Introduction
Цель этого метода является то, чтобы подробно методика, чтобы изолировать целом, интактный стекловидное тело, с стекловидного сердцевины и коры неповрежденной, из трупа глаза, для целей vitreodynamic анализа. Как поле стекловидного физиологии выросла, мульти-дисциплинарных исследователей, таких как исследователей гидромехаников, расследует физические и биомеханические свойства стекловидного 1. Для этого важно, чтобы подробно методика изолировать весь, неповрежденный стекловидное тело, чтобы помочь междисциплинарных исследователей.
Сибэг др. 2 и 3 выполнены другие элегантные целые стекловидных вскрытия трупов на глазах человека и показал иллюстрации результатов. Тем не менее, этот метод использовать не были подробно описаны и неспециалистами не сможет воспроизвести способ независимо. Другие исследования собирают стекловидного от трупных глазах, используя простые методы, такие как стремление или частичном вскрытии,оба из которых не приводит к целой неповрежденной, стекловидное тело. Gisladottis др. 4 и Сюй др. 5 исследовать проницаемость в стекловидное тело заготовленной от трупа глаза. Однако, поскольку ни один из методов экстракции стекловидного не было описано, было предположено, что они отсасывают стекловидного тела с помощью шприца. Вт и др. 6 пошел еще дальше, описывая метод выделения кролика стекловидного тела с хирургической техники. Тем не менее, этот метод приводит к выделению только стекловидного ядра, а не стекловидного коры. Skeie др. 7 позже организовал стекловидного в 4 уникальных регионов и элегантно описали метод препарировать каждую часть для анализа. Эта методика, однако, не приводит к интактной стекловидного тела в целом.
Тока метод был разработан для облегчения биофизических экспериментов, которые в настоящее время выполняется только в трупных глазах. Предыдущие способы, как описаноБове, ограничены, потому что 1) ни полностью не изолировать всю стекловидное тело, 2) собирают стекловидное ядро и кора гомогенизируют, 3) стекловидное анатомическое строение не поддерживается, или 4) методы рассечение не адекватно подробно для репликации исследователями в других областях , Кроме того, из-за непрозрачности склеры и сосудистой оболочки, визуализации стекловидного тела ограничена в интактной глазного яблока. Это ограничивает точность и возможность измерения, которые могут быть сделаны внутри весь глаз. Кроме того, окружающие анатомические структуры стекловидного может путать изучение биохимических и физических свойств стекловидного тела.
В последние годы, тело стекловидное науки значительно вырос, и есть основания полагать, что вся стекловидное тело имеет различные свойства, чем его отдельных частей. Существует растущий интерес в расследовании физические, биомеханические и химические свойства стекловидного тела для vitreodynamics researcч, что имеет применения в клинической медицине, таких как доставка наркотиков, стекловидное тело оксигенации 8 и витрэктомии. Фармакологические vitreodynamics, который использует фармакологических агентов манипулировать стекловидное тело, может быть использован для улучшения результатов витрэктомии 9. Биомеханических свойств используются для моделирования стекловидного поток жидкости, который может быть использован для улучшения технологий доставки лекарств в стекловидное тело 10-12. Физические свойства различных сегментах стекловидного тела имеют решающее значение для понимания витреоретинальной транспорт кислорода 13. Предлагаемый метод стекловидного рассечение может быть использован для изучения различных свойств неповрежденной стекловидного тела. Это позволяет Настольные эксперименты быть сделано на целых неповрежденных, стекловидного тела с лучшей визуализации.
В целом, современные методы исследования для стекловидного тела либо не адекватно описано, или привести к неполной изоляции стекловидное ядро и кора. Таким образом, существует необходимость выполнять еxperiments в прозрачной модели глаза, сохраняя анатомию стекловидного тела, что существует в трупной глаза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все энуклеированным глаза были получены из скотобойни и все эксперименты были проведены в соответствии с институциональными законов в области биобезопасности.
- Безопасный энуклеированным глаз вниз на поверхности. Сделайте это путем размещения контактов ткани через избыточной ткани вокруг глаз и обеспечения его на доске пенополистирола.
- Проанализируйте и отсоединить perilimbal конъюнктиву от глаз.
- Используйте тонкий пинцет (0,3 щипцы) и microscissors (Westcott ножницы) надрезать конъюнктиву у лимба и прямо рассекают его склеры. Разрежьте вдоль конъюнктиву от лимба, как тупым переходит к возможности дальнейшего рассечение.
- Удалить все конъюнктиву путь вокруг глаз (360 градусов), чтобы выставить столько склеры, как это возможно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это полезно, чтобы оставить небольшое количество конъюнктивы чтобы облегчить фиксации глаз с пальцев или хирургических щипцов во время остальной части процедуры.
- Создание полного толщины склеры лоскут вдоль однойсторона глаза (скальпелем 69).
- Сделайте ~ 5 мм склеры разрез параллельно лимба и 3 мм кзади от лимба, осторожно не врезалась в склеры с помощью скальпеля (лезвие скальпеля 11) до тех пор, мрачно пигментированных сосудистой оболочки видна. Будьте осторожны, чтобы не надрезать сам сосудистую оболочку.
- Осторожно рассекают вдоль плоскости между склерой и сосудистой оболочки, либо с ножницами (с использованием тупым) или скальпелем, пока это не возможно, чтобы увеличить потенциальную пространство между этими тканями, нажав сосудистую оболочку аккуратно внутрь.
- Сделать еще склеры разрез перпендикулярно первому разреза склеры с острыми microscissors, создавая Т-образный разрез.
- Затем продолжают прямо рассекают в окружном образом, чтобы удалить склеры ткани от основной сосудистой оболочки и осторожно нажмите на сосудистую оболочку от склеры, как упоминалось выше.
- Увеличить склеры клапан по мере необходимости.
- Осторожно тупым рассекать сосудистую оболочку от склерыв течение всего процесса.
- Увеличить клапан до тех пор, разрез сделан перпендикулярно лимба не достигает зрительного нерва и разрез сделан параллельно лимбу, по крайней мере одна треть окружности глаз (45 °).
- Используйте склеры клапан в качестве источника заемных средств для манипулирования глаз во тупым. Счетчик-тяги на клапане облегчает тупым.
- Повторите предыдущий шаг с другой склеры клапаном.
- Срежьте склеры закрылки разоблачить большую площадь сосудистой оболочки.
- Продолжить разрез, достигнутый в шаге 3 вокруг окружности глаза (360 градусов).
- Удалите остатки сосудистая-сетчатки ткани.
- В открытой области, использовать ватный наконечник-мягко стряхните сосудистое-сетчатка ткани оставшиеся. Кроме того, аккуратно захватить ткани с щипцами и очистить его от основной стекловидного тела.
- При необходимости сделать надрез в сосудистой оболочки мarting от зрительного нерва. Затем очистить от сосудистой оболочки осторожно, чтобы разоблачить сетчатки и стекловидного тела мозга.
- Продолжить тупой рассекает сосудистую оболочку от склеры, а затем очистить от сосудистой оболочки, чтобы получить всю, нетронутыми стекловидного тела.
- Использование ободком склеры, прикрепленный к роговице, чтобы расположить всю стекловидного в нужное место. В этот момент, стекловидное тело прикрепляется к переднему склеры и хрусталика.
- Тупым рассекают стекловидного изнутри склеры, вокруг объектива, удаляя все склеры.
- Используйте тупой инструмент, чтобы зачерпнуть объектив от стекловидного если это будет необходимо. Используйте образец для различных vitreodynamic экспериментов.
- Поместите образец в стеклянном стакане с известной площадью поверхности подвергается воздействию воздуха. Поместите зонд чувствительного к кислороду на краю образца. Использование микро-манипулятор для перемещения зонда на известном расстоянии (г) в образце.
- Использование законов диффузии Фика, чтобы получить теоретическое уравнение диффузии. С дата собраны в шаге 10.1, получаем термин коэффициент диффузии экспериментальная / реакции и т.д.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После протокола приведет к успешному стекловидного вскрытия с ядром и корой (рис 3) без изменений. Это видно из остаточных частей сетчатки, прилипших к стекловидного коры. Неиспользованный вся стекловидного тела может быть использован несколькими способами для конкретных vitreodynamic экспериментов. В нашем случае, скорость диффузии кислорода в неповрежденной стекловидного тела, и это соответствующий постоянной времени изучали (рисунок 2). Стекловидное что иссекали (ядро и кору головного мозга) с помощью нашего метода был помещен в стеклянном стакане с известным площади открытой поверхности. Это сравнивалось с стекловидного тела, что был собран с использованием ранее опубликованным методом, что только изолирует стекловидного Core 6. Все остальные факторы были сохранены в соответствии через экспериментальных и контрольных групп. Стекловидное поверхность подвергалась воздействию воздуха, который имеет известную давление кислорода (~ 160 мм рт.ст.). Напряжение кислорода в стекловидное тело была низкой (<10 мм рт.ст.). Основываясь на скорости ВИТРошибочны потребление кислорода определяется шуй и др. 14 для стекловидного в состоянии геля, мы можем использовать уравнение для 1 мерной транспорта кислорода (в установившемся или нестационарных государственных форм). Измеряя напряжение кислорода известное расстояние в пределах стекловидного поверхности, мы можем экспериментально проверить коэффициент диффузии. Напряжение кислорода был записан с кислородным зондом, таких как Оксфорд и частота ошибок была ± 10%. Образец собирали каждые 30 сек. Присутствие стекловидной коры влияет на скорость диффузии кислорода в середине стекловидного тела. В присутствии стекловидного коры, диффузии кислорода происходит в течение более длительного промежутка времени.
Физические свойства стекловидного сердцевины и коры оказывают влияние на здоровье и болезни. Например, локализованы, дополнительный внутриглазное оксигенации было предложено в качестве средства для лечения ишемии сетчатки 8. Понимание различных коэффициентов диффузии для кислорода через стекловидное корыядро позволит исследователям прогнозировать фактическую скорость доставки кислорода к сетчатке.
Рисунок 1:. Креста в разрезе глаз, где отображаются соответствующие анатомические структуры (модифицированный из Национального института глаза, Национальные институты здоровья) роговица прозрачная ткань, которая образует переднюю наиболее раздел глаза и обеспечивает значительную часть глаза оптический сила. Отгиб перехода роговицы, конъюнктивы и склеры. Склеры простирается от лимба к задней большей аспекте глаза, где она встречает зрительный нерв. Конъюнктива представляет собой тонкий эпителий, что линии очень вне глаза и образует границу между внешней средой и склеры. Внутренние компоненты глаза состоит из передней камеры, хрусталика, радужной оболочки, цилиарного тела, заднюю камеру, заднюю полость, сетчатки и сосудистой оболочки глаза. Vitreouс сердцевина содержит центральную область стекловидного тела, в задней полости глаза. Стекловидное коры расположена вокруг стекловидного тела и прикреплен к сетчатке в нескольких точках в том числе Плана Парс, сосудов сетчатки, диска зрительного нерва и макулы. Стекловидное база трехмерный зона, которая простирается от ~ 2 мм кпереди от зубчатый край на 3 мм кзади от зубчатый край. Сосудистое представляет собой слой сосудистой ткани, которая расположена между склерой и сетчаткой и обеспечивает приток крови к внешней сетчатки. Сетчатка нейросенсорная слой глаза, что subserves света отправки способность глаза. Склеры белый непрозрачный слой, который обеспечивает большую часть структурной поддержки к стенке глаза.
Рисунок 2:. Участок кислорода натяжения стекловидного тела от времени Участок напряжения кислорода в стекловидном ядра (зеленая линия) в сравнении с интактной всей Vitreous (синяя линия). Чувствительный датчик кислорода был помещен в середину образца, и образец подвергается воздействию воздуха, который имеет напряжение кислорода 160 мм рт.
Рисунок 3: Примеры изолированного всей стекловидного тела. Верхнее изображение представляет собой пример всей неповрежденной стекловидного тела еще прикреплен к ободком склеры. Средний изображения является примером всей неповрежденной стекловидного тела без склеры, но с некоторым оставшейся ткани сетчатки. Нижняя представляет собой пример всей неповрежденной, стекловидное тело.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть два важных шагов, которые должны быть тщательно выполненные во время стекловидного вскрытия. Шаг 3, создавая полную толщину лоскута склеры, имеет решающее значение для всей рассечение. Уход должны быть приняты, чтобы не врезаться в сосудистой оболочке при создании полной толщины склеры клапан. Другим критическим шагом является рассечение от склеры от сосудистой оболочки. Этот шаг должен быть тщательно сделано, чтобы предотвратить создание нескольких отверстий в сосудистой оболочке, из которой стекловидное тело может проливаться. Существует способ изменить протокол и до сих пор рассекают нетронутыми все стекловидное тело. Шаг 6 может быть отложено до тех пор, шаг 8. сосудистое не может быть удален в конце после стекловидного ткани расположен в нужном месте.
Ограничение этой процедуры является то, что во время вскрытия, есть только визуальные подсказки, чтобы предположить, успех и точность неповрежденной стекловидного вскрытия. Так стекловидное ядро и кора являются прозрачными и неотличимы невооруженным глазом, этоможет быть сложной задачей. Заметив адгезию на сетчатке стекловидное можно определить, произошло успешно рассечение стекловидного коры. В противном случае, фармакологические вещества, такие как Kenalog, могут быть использованы для улучшения визуализации 15 из стекловидного но не могут быть легко позволяют отличить стекловидного коры и стекловидного ядра. Еще одно ограничение этого метода является то, что является наиболее эффективным для рассечения гель стекловидного тела. Человек стекловидного гель нерегенеративная ткани, который подвергается разжижению с возрастом. Это сжижения мешает нам полностью рассекает весь, неповрежденный стекловидного из глаза. Таким образом, наша техника распространяется только на стекловидное тело животных, таких как коровы, свиньи или кролики, или глазами молодых людей, которые не имеют значительных количеств сжижения. Стекловидное тело у этих животных, как правило, полностью гелеобразного состояния.
Тем не менее, в настоящее время, нет установленного способа, который был по убываниюribed в деталях, для рассечения вся нетронутыми стекловидного от трупных глазах. В настоящее время только стекловидного методы рассечение, которые были хорошо описано привлекать рассечение уникальных, но отдельных регионах стекловидного 7 или рассечение только стекловидного ядра 6.
Применения расчлененного неповрежденной стекловидного тела находятся под ценят и в полной мере. Хирургическое опыт в стекловидное тело, а также клинические, гистологические и биохимические исследования показывают, что химические и структурные свойства стекловидного тела может значительно изменяться 16,17. Таким образом, необходимо сохранить структуру всей стекловидного тела для изучения функции стекловидного глазного физиологии и анатомии. Неиспользованный стекловидного может быть эксплантированных в прозрачной шара для лучшей визуализации в ходе экспериментов. Они могут быть использованы для различных механических / химических тестов для улучшения измерения физической / биомеханической опорыСВОЙСТВАМИ стекловидного тела. Например, мы предполагаем, что расчлененный целом нетронутыми стекловидного может быть использован вместо физиологического раствора, вязких заменителей, или стекловидного ядра в цитируемых реологических экспериментов 6,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 forceps | Storz Opthalmics | E1793 | |
| Westcott Tenotomy Scissors Curved Right | Storz Opthalmics | E3320 R | |
| Scalpel Handle No. 3 | VWR | 25607-947 | |
| Scalpel Blade, #11, for #3 Handle | VWR | 470174-844 |
References
- Siggers, J. H., Ethier, C. R.
- Sebag, J. Age-related changes in human vitreous structure. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 225 (2), 89-93 (1987).
- Grignolo, A.
- Gisladottir, S., Loftsson, T., Stefansson, E. Diffusion characteristics of vitreous humour and saline solution follow the Stokes Einstein equation. G Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 247 (12), 1677-1684 (2009).
- Xu, J., Heys, J. J., Barocas, V. H., Randolph, T. W. Permeability and diffusion in vitreous humor: implications for drug delivery. Pharm Res. 17 (6), 664-669 (2000).
- Watts, F., Tan, L. E., Wilson, C. G., Girkin, J. M., Tassieri, M., Wright, A. J. Investigating the micro-rheology of the vitreous humor using an optically trapped local probe. Journal of Optics. 16 (1), 015301 (2014).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Dissection of human vitreous body elements for proteomic analysis. J Vis Exp. (47), e2455 (2011).
- Abdallah, W., Ameri, H., et al. Vitreal oxygenation in retinal ischemia reperfusion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (2), 1035-1042 (2011).
- Goldenberg, D., Trese, M. Pharmacologic vitreodynamics: what is it? Why is it important. Expert Review of Ophthalmology. 3 (3), 273-277 (2008).
- Choonara, Y. E., Pillay, V., Danckwerts, M. P., Carmichael, T. R., du Toit, L. C. A review of implantable intravitreal drug delivery technologies for the treatment of posterior segment eye diseases. J Pharm Sci. 99 (5), 2219-2239 (2010).
- Balachandran, R. K., Barocas, V. H. Computer modeling of drug delivery to the posterior eye: effect of active transport and loss to choroidal blood flow. Pharm Res. 25 (11), 2685-2696 (2008).
- Smith, C. a, Newson, T. a, et al. A framework for modeling ocular drug transport and flow through the eye using micro-CT. Phys Med Biol. 57 (19), 6295-6307 (2012).
- Quiram, P. A., Leverenz, V. R., Baker, R. M., Dang, L., Giblin, F. J., Trese, M. T. Microplasmin-induced posterior vitreous detachment affects vitreous oxygen levels. Retina. 27 (8), 1090-1096 (2007).
- Shui, Y., Holekamp, N. The gel state of the vitreous and ascorbate-dependent oxygen consumption: relationship to the etiology of nuclear cataracts. Arch Ophthalmol. 127 (4), 475-482 (2009).
- Burk, S. E., Da Mata, A. P., Snyder, M. E., Schneider, S., Osher, R. H., Cionni, R. J. Visualizing vitreous using kenalog suspension. J Cataract Refract Surg. 29 (4), 645-651 (2003).
- Spaide, R. Visualization of the Posterior Vitreous with Dynamic Focusing and Windowed Averaging Swept Source Optical Coherence Tomography. Am J Ophthalmol. S0002-9394 (14), 00537-00536 (2014).
- Domalpally, A., Gangaputra, S., Danis, R. P. Diseases of the Vitreo-Macular Interface. 21, Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. 21-27 (2014).
- Stocchino, R., Repetto, A., Cafferata, C. Experimental investigation of vitreous humour motion within a human eye model. Phys Med Biol. 50 (19), 4729-4743 (2005).
