Introduction
L'obiettivo di questo metodo consiste nel dettaglio una tecnica per isolare un intero, corpo vitreo intatto, con il nucleo vitreo e corteccia intatta, da un occhio di cadavere, ai fini dell'analisi vitreodynamic. Poiché il campo della fisiologia del vitreo è cresciuta, i ricercatori multidisciplinari, quali la meccanica dei fluidi ricercatori, stanno studiando le proprietà fisiche e biomeccaniche del corpo vitreo 1. A tal fine, è indispensabile dettaglio una tecnica per isolare tutto, corpo vitreo intatta per favorire ricercatori multidisciplinari.
Sebag et al. 2 e altri 3 eseguiti eleganti intere dissezioni vetrose sugli occhi cadavere dell'uomo e hanno mostrato le illustrazioni dei risultati. Tuttavia, la tecnica utilizzata non è stata descritta in dettaglio e non esperti, non sarebbe in grado di replicare il metodo indipendente. Altri studi hanno raccolto vitreo da occhi cadavere con metodi semplici, come l'aspirazione o dissezione parziale,entrambi i quali non provocano un tutto, corpo vitreo intatto. Gisladottis et al. 4 e Xu et al. 5 indagare permeabilità nel vitreo raccolte da occhi cadavere. Tuttavia, poiché nessun metodo di estrazione vetrosa è stata descritta, si è ipotizzato che essi aspirati vitreo con una siringa. Watts et al. 6 andato un passo avanti descrivendo un metodo per isolare coniglio vitreo con una tecnica chirurgica. Tuttavia, questo metodo provoca un isolamento del solo nucleo vitreo e non la corteccia vitreo. Skeie et al. 7 poi organizzato il vitreo in 4 regioni uniche ed elegantemente descritto un metodo per sezionare fuori ogni parte per l'analisi. Questa tecnica tuttavia, non comporta un vitreous intatto nel suo complesso.
La tecnica attuale è stato sviluppato per facilitare esperimenti biofisici attualmente eseguite solo in occhi cadavere. I metodi precedenti, come descritto unbove, sono limitati perché 1) nessuno isolare completamente tutto il corpo vitreo, 2) raccolte nucleo vitreo e la corteccia sono omogeneizzati, 3) vitrea struttura anatomica non è mantenuta, o 4) tecniche di dissezione non sono adeguatamente dettagliate per la replica da parte dei ricercatori in altri campi . In aggiunta, a causa della opacità sclera e della coroide, visualizzazione del corpo vitreo è limitata nel bulbo oculare intatto. Questo limita la precisione e la fattibilità di misurazioni che possono essere fatte all'interno occhio intero. Inoltre, le strutture anatomiche circostanti il vitreo possono confondere lo studio delle proprietà biochimiche e fisiche del vitreo.
Negli ultimi anni, il corpo della scienza vitreo è cresciuto enormemente e non vi è ragione di credere che tutto il corpo vitreo ha proprietà diverse rispetto le sue singole parti. Vi è un crescente interesse per lo studio delle proprietà fisiche, biomeccaniche e chimiche del vitreo per vitreodynamics research, che ha applicazioni in medicina clinica, come la somministrazione di farmaci, l'ossigenazione intravitreale 8 e vitrectomia. Vitreodynamics farmacologici, che utilizza agenti farmacologici per manipolare il corpo vitreo, possono essere utilizzati per migliorare i risultati vitrectomia 9. Proprietà biomeccaniche vengono utilizzate per modellare il flusso di fluido vitreale, che può essere utilizzato per migliorare drug delivery tecnologie intravitreale 10-12. Le proprietà fisiche di diversi segmenti del vitreo sono cruciali per comprendere vitreo-retinica trasporto dell'ossigeno 13. La tecnica dissezione vitreo proposto può essere usato per studiare varie proprietà del intatte vitreo. Permette da banco esperimenti da fare su tutto, corpi vetrosi intatti con una migliore visualizzazione.
In sintesi, i metodi attuali per lo studio del vitreo sono o non adeguatamente descritte o causare un isolamento incompleta nucleo vitreo e corteccia. Pertanto, vi è la necessità di eseguire experiments in un modello di occhio trasparente, pur mantenendo l'anatomia del vitreo che esiste negli occhi cadavere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti gli occhi enucleati sono stati ottenuti da un macello e tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le leggi biosicurezza istituzionali.
- Fissare occhio enucleato in giù su una superficie. A tale scopo, mettendo i perni dei tessuti attraverso il tessuto in eccesso intorno all'occhio e fissandolo in giù in una tavola di polistirolo.
- Staccare e staccare congiuntiva perilimbare dall'occhio.
- Utilizzare una pinza sottile (0,3) e pinze microscissors (forbici Westcott) per incidere la congiuntiva al limbus e senza mezzi termini sezionare fuori la sclera. Tagliare la congiuntiva lungo il limbus come la dissezione procede per consentire un'ulteriore dissezione.
- Rimuovere congiuntiva tutto intorno all'occhio (360 gradi) per esporre il più sclera possibile.
NOTA: È utile lasciare una piccola quantità di congiuntiva per facilitare fissarsi l'occhio con i perni chirurgici o una pinza durante il resto della procedura.
- Creare un completo lembo sclerale spessore lungo unolato dell'occhio (bisturi 69).
- Fare un ~ 5 millimetri incisione sclerale parallelamente al limbus e 3 mm posteriormente al limbus tagliando delicatamente nella sclera con un bisturi (lama da bisturi 11) fino coroide pigmentazione scura è visibile. Fare attenzione a non incidere coroide stesso.
- Sezionare cautela lungo il piano tra la sclera e della coroide, sia con le forbici (utilizzando smussa) o con il bisturi, finché è possibile ampliare lo spazio potenziale tra questi tessuti spingendo coroide leggermente verso l'interno.
- Effettuare un'altra incisione sclerale perpendicolare alla prima incisione sclerale con microscissors taglienti, creando una incisione a forma di T.
- Poi continuare a sezionare bruscamente in modo circonferenziale per rimuovere il tessuto sclerale dalla coroide sottostante e spingere delicatamente la coroide dalla sclera come detto sopra.
- Ingrandire il lembo sclerale, se necessario.
- Delicatamente Blunt sezionare la coroide lontano dalla scleradurante tutto il processo.
- Allargare lo sportello finché l'incisione fatta perpendicolarmente al limbus raggiunge il nervo ottico e incisione fatta parallelo al limbus è almeno un terzo della circonferenza dell'occhio (45 °).
- Utilizzare il lembo sclerale come fonte di leva per manipolare l'occhio durante la dissezione smussa. Il contro-trazione sul lembo facilita scollamento.
- Ripetere il passaggio precedente sull'altro lembo sclerale.
- Tagliare i lembi sclerali per esporre una vasta area della coroide.
- Continuare l'incisione fatta nel passaggio 3 circonferenza dell'occhio (360 gradi).
- Rimuovere il restante tessuto coroide-retina.
- All'interno della regione esposta, usare un cotton-tip per spazzolare delicatamente il tessuto della coroide-retina rimanente. In alternativa, afferrare delicatamente il tessuto con una pinza e sbucciare fuori dal corpo vitreo sottostante.
- Se necessario fare un'incisione nella coroide stArting dal nervo ottico. Poi staccarsi coroide delicatamente per esporre la retina e la corteccia vitreo.
- Continuare smussato sezionare la coroide dalla sclera e poi staccarsi coroide per ottenere il tutto, vitrea intatto.
- Utilizzare il cerchio sclerale attaccato alla cornea per posizionare l'intero vetrosa in posizione desiderata. A questo punto, il vitreo è collegato alla sclera anteriore e lente.
- Blunt sezionare il vitreo dall'interno della sclera, intorno alla lente, eliminando tutti sclera.
- Utilizzare uno strumento smussato per raccogliere la lente dal vitreo se necessario. Utilizzare il campione per vari esperimenti vitreodynamic.
- Mettere campione in un bicchiere di vetro con nota superficie esposta all'aria. Inserire sonda sensibile all'ossigeno al bordo del campione. Utilizzare un micromanipolatore per spostare la sonda ad una distanza nota (r) nel campione.
- Utilizzare Leggi di Fick per ottenere l'equazione di diffusione teorica. Con il data raccolta in fase di 10.1, ottenere il termine coefficiente di diffusione sperimentale / reazione etc.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Seguendo il protocollo porterà ad una dissezione vetrosa di successo con il nucleo e la corteccia (figura 3) intatto. Questo è evidente dai pezzi residui di retina aderito alla corteccia vitreo. Intatto intera vitreo può essere utilizzato in diversi modi per specifici esperimenti vitreodynamic. Nel nostro caso, il tasso di diffusione di ossigeno intatta vitreo ed è costante di tempo corrispondente è stato studiato (Figura 2). Vetroso che è stato dissezionato (nucleo e la corteccia) con il nostro metodo è stato collocato in un bicchiere di vetro con una superficie esposta conosciuta. Questo è stato rispetto a vitreo che è stato raccolto utilizzando un metodo precedentemente pubblicato che isola solo nucleo vitreo 6. Tutti gli altri fattori sono stati tenuti coerente tra i gruppi sperimentali e di controllo. La superficie vetrosa è stato esposto all'aria, che ha una tensione di ossigeno noto (~ 160 mmHg). La tensione di ossigeno all'interno del vitreo è stata bassa (<10 mmHg). Sulla base del tasso di vitrconsumo di ossigeno dell'EOUS determinato dalla Shui et al. 14 per vitreo nello stato di gel, possiamo usare l'equazione per 1 trasporto dimensionale di ossigeno (in forme di stato stazionario o instabili). Misurando la tensione di ossigeno una distanza nota all'interno della superficie vetrosa, possiamo validare sperimentalmente il coefficiente di diffusione. La tensione di ossigeno è stato registrato con una sonda di ossigeno come Oxford, e il tasso di errore è ± 10%. Un campione è stato raccolto ogni 30 sec. La presenza della corteccia vitreo influenza la velocità di diffusione dell'ossigeno nel vitreo metà. In presenza di corteccia vitreo, la diffusione di ossigeno si verifica in un intervallo di tempo più lungo.
Le proprietà fisiche del nucleo vitreo e corteccia hanno un impatto in salute e malattia. Ad esempio, localizzato, supplementare ossigenazione intraoculare è stata proposta come un trattamento per ischemia retinica 8. Comprendere i diversi coefficienti di diffusione di ossigeno attraverso la corteccia del vitreonucleo permetterà ai ricercatori di prevedere il tasso effettivo di apporto di ossigeno alla retina.
Figura 1:. Trasversale sezione dell'occhio visualizzazione relative strutture anatomiche (modificato da National Eye Institute, National Institutes of Health) La cornea è il tessuto trasparente che forma il anterior maggior parte dell'occhio e fornisce una porzione significativa della occhio di ottica potenza. Il limbus è la giunzione della cornea, congiuntiva e la sclera. La sclera estende dal limbus al posteriore più aspetto dell'occhio dove incontra il nervo ottico. La congiuntiva è un epitelio sottile che le linee molto esterna dell'occhio e forma il confine tra l'ambiente esterno e la sclera. I componenti interni dell'occhio consistono nella camera anteriore, lente, iride, corpo ciliare, camera posteriore, posteriore cavità, retina e della coroide. Il vitreous nucleo comprende la regione centrale del corpo vitreo, nella cavità posteriore dell'occhio. La corteccia vitreo è situato attorno al corpo vitreo ed è attaccato alla retina in diversi punti tra cui la pars plana, vasi retinici, disco ottico e macula. La base del vitreo è una zona tridimensionale che si estende da ~ 2 mm anteriormente alla serrata a 3 mm posteriormente al serrata. La coroide è uno strato di tessuto vascolare che si trova tra la sclera e retina e fornisce afflusso di sangue alla retina esterna. La retina è lo strato neurosensoriale dell'occhio che subserves la luce invio capacità dell'occhio. La sclera è lo strato bianco opaco che fornisce massa del supporto strutturale alla parete dell'occhio.
Figura 2:. Trama di tensione di ossigeno del vitreo contro il tempo Terreno di tensione di ossigeno a base vetrosa (linea verde) rispetto al intatta tutta la vitreous (linea blu). Una sonda di rilevazione ossigeno è stato posto al centro del campione e il campione è stato esposto all'aria che ha una tensione di ossigeno di 160 mmHg.
Figura 3: Esempi di isolato dell'intero corpo vitreo. Top immagine è un esempio di tutto il corpo vitreo intatto ancora attaccato al cerchio sclerale. Ritratto medio è un esempio di tutto il corpo vitreo intatto senza sclera ma con qualche residuo tessuto retinico. Fondo è un esempio di insieme, corpo vitreo intatto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ci sono due passaggi critici che devono essere accuratamente eseguite durante la dissezione vitreo. Fase 3, la creazione di un completo lembo sclerale spessore, è fondamentale per l'intero dissezione. Si deve prestare attenzione a non tagliare in coroide quando si crea il pieno spessore lembo sclerale. L'altro passaggio fondamentale è sezionando via la sclera dalla coroide. Questo passaggio deve essere fatto con attenzione per evitare la creazione di più fori nella coroide da cui vitreo può fuoriuscire. C'è un modo per modificare il protocollo e ancora sezionare intatto tutto il corpo vitreo. Fase 6 può essere ritardata fino passo 8. La coroide può essere rimosso alla fine dopo il tessuto vitreo è posizionato nella posizione desiderata.
La limitazione di questa procedura è che durante la dissezione, ci sono solo segnali visivi per suggerire il successo e l'accuratezza della dissezione vetrosa intatto. Poiché il nucleo vitreo e corteccia sono sia trasparente e indistinguibile ad occhio nudo, questopuò essere impegnativo. Notando l'adesione della retina sul vitreo è possibile determinare se si è verificata successo dissezione della corteccia vitreo. Altrimenti, sostanze farmacologiche, come Kenalog, possono essere utilizzati per migliorare la visualizzazione 15 del vitreo ma difficilmente possono permettere di distinguere tra la corteccia vitreo e nucleo vitreo. Un altro limite di questa tecnica è che è più efficace per la dissezione di gel vitreo. Gel vitreale umana è un tessuto non-rigenerativa che subisce di liquefazione con l'età. Questo liquefazione ci impedisce di sezionare completamente l'intero, vetrosa intatto dall'occhio. Così, la nostra tecnica è valida solo per vitrea di animali, come mucche, maiali o conigli, o gli occhi di giovani esseri umani che non hanno quantità significative di liquefazione. Il vitreo in questi animali tende ad essere completamente in uno stato di gel.
Tuttavia, attualmente, non esiste un metodo consolidato, che è stato decrescenteribed in dettaglio, per sezionare tutto vitreo intatto da occhi cadavere. Attualmente, le uniche tecniche di dissezione vetrose che sono stati ben descritti coinvolgono la dissezione delle regioni uniche ma separate di vitreo 7 o la dissezione del proprio nucleo vitreo 6.
Le applicazioni di sezionato intatto vitreo sono sotto apprezzati e sottoutilizzate. Esperienza chirurgica con il vitreo e studi clinici, istopatologici e biochimici suggerisce che le proprietà chimiche e strutturali del vitreo possono variare significativamente 16,17. Pertanto, è necessario mantenere la struttura dell'intero corpo vitreo per studiare la funzione del vitreo nella fisiologia oculare e anatomia. Vitreo intatto può essere espiantato a un globo trasparente per una migliore visualizzazione durante gli esperimenti. Essi possono quindi essere utilizzati per una varietà di prove / chimiche meccaniche per migliorare le misure di fisica / prop biomeccanicoerties del vitreo. Ad esempio, si suggerisce che l'intero corpo vitreo intatto sezionato può essere utilizzato al posto di soluzione fisiologica, sostituti viscosi, o nucleo vitreo negli esperimenti reologia citati 6,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 forceps | Storz Opthalmics | E1793 | |
| Westcott Tenotomy Scissors Curved Right | Storz Opthalmics | E3320 R | |
| Scalpel Handle No. 3 | VWR | 25607-947 | |
| Scalpel Blade, #11, for #3 Handle | VWR | 470174-844 |
References
- Siggers, J. H., Ethier, C. R. Fluid Mechanics of the Eye. Annual Review of Fluid Mechanics. 44 (1), 347-372 (2012).
- Sebag, J. Age-related changes in human vitreous structure. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 225 (2), 89-93 (1987).
- Grignolo, A. Fibrous components of the vitreous body. AMA Arch Ophthalmol. 47 (6), 760-774 (1952).
- Gisladottir, S., Loftsson, T., Stefansson, E. Diffusion characteristics of vitreous humour and saline solution follow the Stokes Einstein equation. G Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 247 (12), 1677-1684 (2009).
- Xu, J., Heys, J. J., Barocas, V. H., Randolph, T. W. Permeability and diffusion in vitreous humor: implications for drug delivery. Pharm Res. 17 (6), 664-669 (2000).
- Watts, F., Tan, L. E., Wilson, C. G., Girkin, J. M., Tassieri, M., Wright, A. J. Investigating the micro-rheology of the vitreous humor using an optically trapped local probe. Journal of Optics. 16 (1), 015301 (2014).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Dissection of human vitreous body elements for proteomic analysis. J Vis Exp. (47), e2455 (2011).
- Abdallah, W., Ameri, H., et al. Vitreal oxygenation in retinal ischemia reperfusion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (2), 1035-1042 (2011).
- Goldenberg, D., Trese, M. Pharmacologic vitreodynamics: what is it? Why is it important. Expert Review of Ophthalmology. 3 (3), 273-277 (2008).
- Choonara, Y. E., Pillay, V., Danckwerts, M. P., Carmichael, T. R., du Toit, L. C. A review of implantable intravitreal drug delivery technologies for the treatment of posterior segment eye diseases. J Pharm Sci. 99 (5), 2219-2239 (2010).
- Balachandran, R. K., Barocas, V. H. Computer modeling of drug delivery to the posterior eye: effect of active transport and loss to choroidal blood flow. Pharm Res. 25 (11), 2685-2696 (2008).
- Smith, C. a, Newson, T. a, et al. A framework for modeling ocular drug transport and flow through the eye using micro-CT. Phys Med Biol. 57 (19), 6295-6307 (2012).
- Quiram, P. A., Leverenz, V. R., Baker, R. M., Dang, L., Giblin, F. J., Trese, M. T. Microplasmin-induced posterior vitreous detachment affects vitreous oxygen levels. Retina. 27 (8), 1090-1096 (2007).
- Shui, Y., Holekamp, N. The gel state of the vitreous and ascorbate-dependent oxygen consumption: relationship to the etiology of nuclear cataracts. Arch Ophthalmol. 127 (4), 475-482 (2009).
- Burk, S. E., Da Mata, A. P., Snyder, M. E., Schneider, S., Osher, R. H., Cionni, R. J. Visualizing vitreous using kenalog suspension. J Cataract Refract Surg. 29 (4), 645-651 (2003).
- Spaide, R. Visualization of the Posterior Vitreous with Dynamic Focusing and Windowed Averaging Swept Source Optical Coherence Tomography. Am J Ophthalmol. S0002-9394 (14), 00537-00536 (2014).
- Domalpally, A., Gangaputra, S., Danis, R. P. Diseases of the Vitreo-Macular Interface. 21, Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. 21-27 (2014).
- Stocchino, R., Repetto, A., Cafferata, C. Experimental investigation of vitreous humour motion within a human eye model. Phys Med Biol. 50 (19), 4729-4743 (2005).
