Whole Corpus vitreum Dissektion for Vitreodynamic Analysis

Introduction

Målet med denne fremgangsmåde er at detaljer en teknik til at isolere en hel, intakt glaslegeme, med den glasagtige kerne og cortex intakt fra et kadaver øje, med henblik på vitreodynamic analyse. Da området glasagtige fysiologi er vokset, tværfaglige forskere, såsom Fluid Mekanik forskere, undersøger de fysiske og biomekaniske egenskaber af den glasagtige ^1. Til dette formål er det vigtigt at detaljer en teknik til at isolere hele, intakte glaslegemet til støtte tværfaglige forskere.

Sebag et al. ^2, og andre ³ udførte elegante hele glasagtige dissektioner på menneskelige cadaver øjne og viste illustrationer af resultaterne. Imidlertid blev den anvendte teknik ikke er beskrevet i detaljer og ikke-eksperter ville ikke være i stand til at replikere metoden selvstændigt. Andre undersøgelser har høstet glaslegemet fra cadaver øjne ved hjælp af enklere metoder såsom aspiration eller delvis dissektion,som begge ikke resulterer i en hel, intakt glaslegeme. Gisladottis et al. ⁴ og Xu et al. ⁵ undersøge gennemtrængelighed i glaslegemet høstet fra cadaver øjne. Da der imidlertid ikke Fremgangsmåden ifølge glasagtig ekstraktion blev beskrevet, blev det antaget, at de aspireret glaslegemet med en sprøjte. Watts et al. ⁶ gik et skridt videre ved at beskrive en fremgangsmåde til isolering kanin glaslegemet med en kirurgisk teknik. Men denne metode resulterer i en isolering af kun den glasagtige kerne og ikke glaslegemet cortex. Skeie et al. ⁷ senere organiseret glaslegemet i 4 unikke regioner og elegant beskrevet en metode til at dissekere ud hver del til analyse. Denne teknik imidlertid ikke resulterer i en intakt glaslegemet som helhed.

Den nuværende teknik blev udviklet for at lette biofysiske eksperimenter, der i øjeblikket kun udføres i cadaver øjne. Tidligere fremgangsmåder, som beskrevet enBove, er begrænsede, fordi 1) ingen fuldstændig isolere hele glaslegeme, 2) høstes glasagtige kerne og cortex er homogeniseret, 3) glasagtigt anatomiske struktur ikke opretholdes, eller 4) dissektion teknikker er ikke tilstrækkeligt detaljeret for replikation af forskere inden for andre områder . Desuden er på grund af opaciteten af ​​sclera og årehinden, visualisering af glaslegemet begrænset i den intakte øjeæblet. Dette begrænser præcision og gennemførlighed af målinger, der kan gøres inden i hele øjet. Desuden kan de anatomiske strukturer, der omgiver glaslegemet forvirre studiet af biokemiske og fysiske egenskaber af glaslegemet.

I de senere år har kroppen af ​​glaslegemet videnskab vokset kolossalt, og der er grund til at antage, at hele glaslegemet har andre egenskaber end dens enkelte dele. Der er stigende interesse i at undersøge de fysiske, biomekaniske og kemiske egenskaber af glaslegemet for vitreodynamics researchfirmaernet, hvilket har anvendelser i klinisk medicin, såsom lægemiddelafgivelse, intravitreal iltning ⁸ og vitrectomy. Farmakologiske vitreodynamics, som bruger farmakologiske midler til at manipulere glaslegemet, kan anvendes til at forbedre vitrectomy resultater ^9. Biomekaniske egenskaber anvendes til at modellere glasagtigt fluid flow, som kan anvendes til at forbedre intravitreal drug delivery teknologier ^10-12. Fysiske egenskaber af forskellige segmenter af glaslegemet er afgørende for at forstå vitreoretinal oxygen transport ^13. Den foreslåede glaslegemet dissektion teknik kan anvendes til at studere forskellige egenskaber af det intakte glaslegemet. Det gør det muligt bench-top forsøg skal gøres på hele, intakte glasagtige organer med bedre visualisering.

Sammenfattende er de nuværende metoder til undersøgelse af glaslegemet enten ikke tilstrækkeligt beskrevet, eller resultere i en ufuldstændig isolation glaslegemet kerne og cortex. Der er derfor et behov for at udføre experiments i en gennemsigtig øjenmodellen samtidig bevare anatomien af ​​glaslegemet der eksisterer i cadaver øjet.

Protocol

Alle tømte øjne blev opnået fra et slagteri, og alle forsøg blev udført i overensstemmelse med de institutionelle biosikkerhed love.

1. Sikker enukleeret øje ned på en overflade. Gør dette ved at placere væv stifter gennem overskydende væv omkring øjet og sikre den ned i en Styrofoam bord.
2. Dissekere og afmontere perilimbal bindehinde fra øjet.
   1. Brug fine pincet (0,3 tang) og microscissors (Westcott saks) at incise conjunctiva ved limbus og ligeud dissekere det off senehinden. Skær conjunctiva langs limbus som stump dissektion fortsætter at tillade yderligere dissektion.
   2. Fjern conjunctiva hele vejen omkring øjet (360 grader) for at eksponere så meget sclera som muligt.
      BEMÆRK: Det er nyttigt at efterlade en lille mængde af conjunctiva at lette fiksere øjet med de kirurgiske stifter eller en pincet under resten af ​​proceduren.
3. Opret en fuld tykkelse scleral klap langs den eneside af øjet (skalpelblad 69).
   1. Lav en ~ 5 mm sclera incision parallelt med limbus og 3 mm posteriort for limbus ved forsigtigt at skære ind i sclera med en skalpel (skalpel 11), indtil mørkere choroid er synlig. Pas på ikke at incise årehinden selv.
   2. Dissekerer forsigtigt langs planet mellem sclera og årehinden, enten med en saks (ved stump dissektion) eller med skalpellen, indtil det er muligt at udvide det muligt rum mellem disse væv ved at skubbe årehinden forsigtigt indad.
   3. Foretag et andet scleral snit vinkelret på det første scleral incision med skarpe microscissors, hvilket skaber en T-formet indsnit.
   4. Derefter fortsætte med at omsvøb dissekere i en rundtgående måde at fjerne den sclerale væv fra den underliggende årehinden og forsigtigt skubbe årehinden væk fra sclera som nævnt ovenfor.
   5. Forstørre sclerale klap efter behov.
      1. Forsigtigt blunt dissekere årehinden væk fra scleraunder hele processen.
      2. Forstørre klappen indtil indsnit vinkelret på limbus når synsnerven og snit parallelt med limbus er mindst en tredjedel af øjet omkreds (45 °).
      3. Brug sclerale flap som en kilde til løftestang for at manipulere øjet under stump dissektion. Counter-trækkraft på flappen gør det lettere for stump dissektion.
   6. Gentag det forrige trin på den anden sclera flap.
4. Skåret væk sclerale flapper at blotlægge et stort område af årehinden.
5. Fortsætte snit i trin 3 omkring øjets omkreds (360 grader).
6. Fjern det resterende årehinden-retina væv.
   1. Inden den udsatte region, brug en bomuld-tip til forsigtigt at børste off årehinden-retina væv tilbage. Alternativt forsigtigt fat i vævet med en pincet og flå det af den underliggende glaslegeme.
   2. Hvis det er nødvendigt at gøre et snit ind i årehinden starting fra synsnerven. Så skræl væk årehinden forsigtigt for at eksponere nethinden og glaslegemet cortex.
7. Fortsæt stumpt dissekere årehinden væk fra sclera og derefter skræl væk årehinden at opnå det hele, intakte glasagtigt.
8. Brug scleral rand fastgjort til hornhinden for at placere hele glaslegemet i den ønskede placering. På dette tidspunkt er glaslegemet fastgjort til den forreste sclera og linsen.
9. Blunt dissekere glaslegemet fra indersiden af ​​sclera, omkring objektivet, fjerne alle sclera.
10. Brug et stumpt redskab til at skrabe linsen væk fra glaslegemet om nødvendigt. Brug prøven til forskellige vitreodynamic eksperimenter.
    1. Anbring prøven i et bægerglas med kendt overfladeareal udsættes for luft. Placer ilt følsomme sonde på kanten af ​​prøven. Brug en mikro-manipulator at flytte sonden til en kendt afstand (r) i prøven.
    2. Brug Fick love for diffusion for at opnå den teoretiske diffusion ligning. Med data indsamlet i trin 10.1, få den eksperimentelle diffusionskoefficient / reaktion sigt etc.

Representative Results

Følge protokollen vil føre til en vellykket glasagtigt dissektion med kernen og cortex (figur 3) intakt. Dette fremgår af de resterende stykker af retina klæbet til den glasagtige cortex. Intakt hele glaslegemet kan anvendes på flere måder for specifikke vitreodynamic eksperimenter. I vores tilfælde, diffusionshastigheden af oxygen i intakt glaslegeme og det er tilsvarende tidskonstant blev undersøgt (figur 2). Glaslegeme, der blev dissekeret (kerne og cortex) ved hjælp af vores metode blev anbragt i et bægerglas med en kendt blotlagt overfladeareal. Dette var sammenlignet med glaslegemet, der blev høstet under anvendelse af en tidligere publiceret metode, der kun isolerer glaslegemet kerne ^6. Alle andre faktorer blev holdt konsekvent på tværs af de eksperimentelle og kontrolgrupper. Det glasagtige overflade blev udsat for luft, som har en kendt oxygenspænding (~ 160 mmHg). Den ilt spændinger i glaslegemet var lav (<10 mmHg). Baseret på hastigheden af ​​vi troEOUS iltforbrug bestemt af Shui et al. ¹⁴ for glaslegemet i gelen tilstand, kan vi bruge ligningen for 1 dimensional ilt transport (i konstant eller ustabile tilstand former). Ved at måle oxygenspændingen en kendt afstand inden den glasagtige overflade, kan vi eksperimentelt validere diffusionskoefficienten. Den ilt spænding blev optaget med en ilt sonde, såsom Oxford, og fejlprocenten var ± 10%. En prøve blev opsamlet hvert 30. sek. Tilstedeværelsen af ​​glaslegemet cortex påvirker diffusionshastigheden af ​​oxygen ind i midten glaslegemet. I nærvær af glaslegemet cortex, diffusionen af ​​oxygen sker over en længere tidsinterval.

De fysiske egenskaber af den glasagtige kerne og cortex har en indvirkning på sundhed og sygdom. For eksempel lokaliseret, supplerende intraokulære oxygenering er blevet foreslået som en behandling for retinal iskæmi ^8. Forståelse af de forskellige diffusionskoefficienter for ilt gennem glasagtige cortexkerne vil gøre det muligt for forskerne at forudsige den faktiske andel af ilt levering til nethinden.

Figur 1:. Tværsnit af øjet der viser relevante anatomiske strukturer (modificeret fra National Eye Institute, National Institutes of Health) Hornhinden er den gennemsigtige væv, som danner den forreste mest sektion af øjet og giver en betydelig del af øjets optiske strøm. Limbus er krydset af hornhinden, conjunctiva og sclera. Sclera strækker sig fra limbus til den bageste mest aspekt af øjet, hvor den møder synsnerven. Den bindehinde er et tyndt epitel, linjer meget uden for øjet og danner grænsen mellem det eksterne miljø og sclera. De interne komponenter i øjet bestå af det forreste kammer, linse, iris, corpus ciliare, bageste kammer, posterior hulrum, retina og årehinden. Den vitreous kerne omfatter den centrale del af glaslegemet, inden den bageste kavitet i øjet. Glaslegemet cortex er placeret rundt om glaslegemet og er fastgjort til nethinden på flere punkter, herunder pars plana, retinale kar, optisk disk og macula. Den glasagtige base er en tredimensional zone, der strækker sig fra ~ 2 mm anterior til ora serrata til 3 mm posteriort for ora serrata. Choroid er et vaskulært væv lag, der ligger mellem sclera og retina og tilvejebringer blodforsyning til den ydre nethinde. Nethinden er den neurosensoriske lag af øjet, der subserves lyset sende kapacitet af øjet. Sclera er den hvide opake lag, der tilvejebringer størstedelen af ​​den strukturelle støtte til øjet væg.

Figur 2:. Plot af ilt spænding glaslegemet mod tiden Plot af ilt spændinger i glasagtig kerne (grøn linje) i forhold til intakt hele vitreous (blå linje). Et oxygen sensing probe blev placeret i midten af ​​prøven, og prøven blev udsat for luft, som har en oxygenspænding på 160 mmHg.

Figur 3: Eksempler på isolerede hele glaslegeme. Øverste billede er et eksempel på hele intakte glaslegemet stadig fastgjort til sclerale rand. Midterste billede er et eksempel på hele intakte glaslegeme uden sclera men med nogle resterende retinal væv. Bunden er et eksempel på hel, intakt glaslegeme.

Discussion

Der er to vigtige skridt, der skal være omhyggeligt udført i løbet glasagtige dissektion. Trin 3, hvilket skaber en fuld tykkelse scleral klap, er afgørende for hele dissektion. Der skal udvises forsigtighed for ikke at skære ind årehinden, når du opretter den fulde tykkelse sclera flap. Den anden kritiske trin er at dissekere væk senehinden fra årehinden. Dette trin skal omhyggeligt gøres for at forhindre at oprette flere huller i årehinden hvorfra glaslegemet kan løbe ud. Der er en måde at ændre protokollen og stadig dissekere intakt hele glaslegemet. Trin 6 kan forsinkes indtil trin 8. årehinden kan fjernes ved slutningen efter glaslegemet væv er placeret på det ønskede sted.

Begrænsningen af ​​denne procedure er, at under dissektion, er der kun visuelle signaler, der tyder på succes og nøjagtigheden af ​​den intakte glasagtige dissektion. Da den glasagtige kerne og cortex er både transparente og undistinguishable med det blotte øje, dettekan være udfordrende. Ved at bemærke adhæsionen af ​​nethinden på glaslegemet er det muligt at afgøre, om der er sket vellykket dissektion af glaslegemet cortex. Ellers farmakologiske stoffer, såsom Kenalog, kan anvendes til at forbedre visualisering ¹⁵ af glaslegemet, men kan ikke umiddelbart tillader en at skelne mellem glaslegemet cortex og glaslegemet kerne. En anden begrænsning ved denne teknik er, at det er mest effektivt for dissektion af gel glaslegemet. Human glasagtigt gel er en ikke-regenerativ væv, der undergår fortætning med alderen. Denne fortætning forhindrer os helt dissekere hele, intakte glaslegeme fra øjet. Således er vores teknik kun omfatter glaslegemet af dyr, såsom køer, svin eller kaniner, eller øjne af unge mennesker, som ikke har betydelige mængder af fortætning. Glaslegemet i disse dyr har en tendens til at være helt i en gel tilstand.

Men i øjeblikket er der ingen etableret metode, der har været described i detaljer, for at dissekere helt intakt glaslegemet fra cadaver øjne. I øjeblikket er de eneste glasagtige dissektion teknikker, der er blevet godt beskrevet involverer dissektion af unikke, men separate områder af glaslegemet ⁷ eller dissektion af netop den glasagtige kerne ^6.

Ansøgningerne fra dissekeret intakt glaslegemet er under værdsat og underudnyttede. Kirurgisk erfaring med glaslegemet samt kliniske, histopatologiske og biokemiske undersøgelser tyder på, at de kemiske og strukturelle egenskaber af glaslegemet kan variere betydeligt ^16,17. Derfor er det nødvendigt at bevare strukturen af ​​hele glaslegemet at studere funktionen af ​​glaslegemet i okulær fysiologi og anatomi. Intakt glaslegeme kan eksplanteret til en transparent globus for bedre visualisering under forsøg. De kan derefter anvendes til en lang række mekaniske / kemiske tests for at forbedre målinger af fysiske / biomekanisk properties af glaslegemet. For eksempel foreslår vi, at det dissekerede hele intakte glaslegemet kan anvendes i stedet for saltvand, viskose erstatninger eller glaslegemet kerne i de citerede reologi eksperimenter ^6,18.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3 forceps	Storz Opthalmics	E1793
Westcott Tenotomy Scissors Curved Right	Storz Opthalmics	E3320 R
Scalpel Handle No. 3	VWR	25607-947
Scalpel Blade, #11, for #3 Handle	VWR	470174-844