Introduction
والهدف من هذه الطريقة هو بالتفاصيل تقنية لعزل كله، الجسم الزجاجي سليمة، مع جوهر الزجاجي والقشرة سليمة، من العين جيفة، لأغراض التحليل vitreodynamic. كما مجال علم وظائف الأعضاء الزجاجي نمت والباحثين متعدد التخصصات، مثل ميكانيكا السوائل الباحثين، والتحقيق في الخصائص الفيزيائية والنشاط الحيوي للالزجاجي 1. تحقيقا لهذه الغاية، لا بد من التفصيل تقنية لعزل العموم، الجسم الزجاجي سليمة لمساعدة الباحثين متعدد التخصصات.
سيباغ وآخرون. (2) وغيرها 3 إجراء تشريح زجاجي كلها أنيقة على عيون جيفة الإنسان وأظهرت الرسوم التوضيحية للنتائج. ومع ذلك، لم يكن وصف التقنية المستخدمة في التفاصيل وغير الخبراء لن تكون قادرة على تكرار الأسلوب بشكل مستقل. وقد تحصد دراسات أخرى الزجاجي من العين جيفة باستخدام أساليب أبسط مثل الطموح أو تشريح الجزئي،وكلاهما لا يؤدي إلى كله، والجسم الزجاجي سليمة. Gisladottis وآخرون. (4) وشو وآخرون. 5 تحقيق النفاذية في النكتة الزجاجي تحصد من عيون الجثث. ومع ذلك، منذ أن تم وصفها لا توجد طريقة لاستخراج زجاجي، كان من المفترض أنها يستنشق النكتة زجاجي مع حقنة. واتس وآخرون. 6 ذهب خطوة أبعد من خلال وصف وسيلة لعزل الأرانب الفكاهة زجاجي مع تقنية جراحية. ومع ذلك، يؤدي هذا الأسلوب في عزلة من مجرد الأساسية الزجاجي وليس القشرة زجاجي. Skeie وآخرون. 7 نظمت في وقت لاحق زجاجي في 4 مناطق فريدة وذكية وصفت طريقة لتشريح خارج كل جزء لتحليلها. هذه التقنية ومع ذلك، لا يؤدي إلى الجسم الزجاجي سليمة ككل.
وقد تم تطوير هذه التقنية الحالية لتسهيل التجارب الفيزيائية الحيوية التي يتم حاليا القيام بها إلا في عيون جيفة. الأساليب السابقة، كما وصفها أحدبوف، تقتصر لأن 1) لا يوجد عزل كامل الجسم الزجاجي كله، 2) تحصد الأساسية الزجاجي والقشرة والمتجانس، 3) لا يتم الاحتفاظ التركيب التشريحي الزجاجي، أو 4) لا يتم تفصيل تقنيات تشريح كاف لتكرارها من قبل الباحثين في مجالات أخرى . بالإضافة إلى ذلك، نظرا لغموض الصلبة والمشيمية، والتصور من الجسم الزجاجي محدودة في مقلة العين سليمة. وهذا يحد من الدقة والجدوى من القياسات التي يمكن إجراؤها داخل العين بأكملها. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للهياكل تشريحية المحيطة زجاجي تربك دراسة الخصائص الحيوية والفيزيائية للزجاجي.
في السنوات الأخيرة، ازداد الجسم العلوم زجاجي كبير وليس هناك سبب للاعتقاد بأن الجسم الزجاجي كله لديه خصائص مختلفة من أجزائه الفردية. هناك اهتمام متزايد في التحقيق في الخصائص الفيزيائية، النشاط الحيوي، والكيميائية من الجسم الزجاجي للvitreodynamics researcح، والتي لها تطبيقات في الطب السريري مثل تسليم المخدرات، الأوكسجين intravitreal 8 و استئصال الزجاجية. vitreodynamics الدوائية، والذي يستخدم عاملات دوائية لمعالجة الجسم الزجاجي، ويمكن استخدامها لتحسين نتائج استئصال الزجاجية 9. يتم استخدام خصائص النشاط الحيوي لنمذجة تدفق السائل الزجاجي، والتي يمكن استخدامها لتحسين تقنيات تسليم المخدرات intravitreal 10-12. الخصائص الفيزيائية للشرائح مختلفة من الجسم الزجاجي ضرورية لفهم الجسم الزجاجي الشبكية نقل الأكسجين 13. تقنية تشريح زجاجي المقترحة يمكن استخدامها لدراسة خصائص مختلفة من الفكاهة زجاجي سليمة. فإنه يتيح مقعد بين كبار التجارب الذي يتعين القيام به في الهيئات زجاجي كامل، سليمة مع أفضل التصور.
باختصار، الأساليب الحالية لدراسة الجسم الزجاجي إما غير وصفت على نحو كاف، أو تؤدي إلى عزلة غير مكتملة جوهر الزجاجي والقشرة. ولذلك، هناك حاجة لإجراء هxperiments في نموذج العين شفاف مع الإبقاء على تشريح الجسم الزجاجي الموجود في العين جيفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تم الحصول على كل العيون منزوعة النواة من مسلخ وتم إجراء جميع التجارب وفقا للقوانين المؤسسية للسلامة الأحيائية.
- تأمين العين منزوعة النواة لأسفل على السطح. القيام بذلك عن طريق وضع دبابيس الأنسجة من خلال الأنسجة الزائدة حول العين وتأمين عليه في مجلس الستايروفوم.
- تشريح وفصل الملتحمة محيط بالحوف من العين.
- استخدام ملقط غرامة (0.3 ملقط) وmicroscissors (مقص يستكوت) إلى شق الملتحمة في حوف وبصراحة تشريح تشغيله الصلبة. قطع الملتحمة على طول حوف كعائدات للتشريح حادة للسماح للمزيد من تشريح.
- إزالة الملتحمة على طول الطريق حول العين (360 درجة) لفضح قدر الصلبة ممكن.
ملاحظة: ومن المفيد لترك كمية صغيرة من الملتحمة لتسهيل تثبيت مكان العين مع دبابيس جراحية أو ملقط خلال الفترة المتبقية من هذا الإجراء.
- إنشاء رفرف الصلبة سمك كامل طول واحدجانب من العين (مشرط شفرة 69).
- جعل ~ 5 مم شق الصلبة بالتوازي مع حوف و 3 ملم الخلفي إلى حوف عن طريق خفض بلطف الصلبة مع مشرط (مبضع شفرة 11) حتى المشيمية المصطبغة بحزن غير مرئية. يجب الحرص على عدم شق المشيمية نفسها.
- تشريح بعناية على طول الطائرة بين الصلبة والمشيمية، إما مع مقص (باستخدام تشريح حادة) أو مع مشرط، حتى أنه من الممكن تكبير مساحة المحتمل بين هذه الأنسجة عن طريق دفع المشيمية بلطف إلى الداخل.
- جعل شق الصلبة آخر عمودي على أول شق الصلبة مع microscissors حاد، وخلق شق على شكل T.
- ثم الاستمرار في تشريح بصراحة بطريقة كفافي لإزالة الأنسجة صلبوية من المشيمية الكامنة وبلطف دفع المشيمية بعيدا عن الصلبة على النحو المذكور أعلاه.
- تكبير رفرف الصلبة حسب الحاجة.
- بلطف بلانت تشريح المشيمية بعيدا عن الصلبةطوال العملية.
- تكبير رفرف حتى شق عمودي على حوف تصل إلى العصب البصري وإجراء شق مواز لحوف هو الثلث على الأقل من محيط العين (45 درجة).
- استخدام رفرف الصلبة كمصدر للنفوذ لمعالجة العين أثناء تشريح حادة. وجر مضاد على رفرف يجعل من الاسهل لتشريح حادة.
- كرر الخطوة السابقة على رفرف الصلبة الأخرى.
- قطع اللوحات صلبوية لفضح مساحة واسعة من المشيمية.
- مواصلة شق في الخطوة 3 حول محيط العين (360 درجة).
- إزالة الأنسجة المشيمية، الشبكية المتبقية.
- داخل المنطقة المكشوفة، واستخدام القطن طرف لتنظيف بلطف بعيدا عن الأنسجة المشيمية الشبكية المتبقية. بدلا من ذلك، والاستيلاء على بلطف الأنسجة مع ملقط وقشر تشغيله الجسم الزجاجي الأساسي.
- إذا لزم الأمر إجراء شق في المشيمية الواحدarting من العصب البصري. ثم قشر بعيدا المشيمية بلطف لفضح الشبكية والجسم الزجاجي القشرة.
- تواصل كليلة تشريح المشيمية بعيدا عن الصلبة ومن ثم قشر بعيدا المشيمية للحصول على كامل، زجاجي سليمة.
- استخدام حافة صلبوية تعلق على القرنية لوضع زجاجي كله في الموقع المطلوب. عند هذه النقطة، يتم إرفاق زجاجي لالصلبة الأمامية والعدسة.
- بلانت تشريح الجسم الزجاجي من داخل الصلبة، حول العدسة، وإزالة جميع الصلبة.
- استخدام أداة حادة لحلج القطن العدسة بعيدا عن الجسم الزجاجي إذا لزم الأمر. استخدام نموذج لمختلف التجارب vitreodynamic.
- وضع العينة في دورق زجاجي مع المساحة السطحية المعروفة تعرضها للهواء. وضع الأكسجين التحقيق حساسة على حافة العينة. استخدام مناور الصغيرة لنقل التحقيق إلى مسافة معروفة (ص) في العينة.
- استخدام قوانين فيك من نشر للحصول على معادلة الانتشار النظرية. مع داتا التي تم جمعها في الخطوة 10.1، يجب الحصول على المدى معامل الانتشار التجريبي / رد فعل الخ
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وبعد بروتوكول يؤدي إلى تشريح الجسم الزجاجي ناجح مع جوهر والقشرة (الشكل 3) سليمة. وهذا واضح من القطع المتبقية من الشبكية انضمت إلى القشرة زجاجي. سليمة الفكاهة زجاجي كلها يمكن استخدامها في عدة طرق لإجراء التجارب vitreodynamic محددة. في حالتنا، فإن معدل انتشار الأكسجين في النكتة زجاجي سليمة وانها تمت دراسة المقابل ثابت الزمن (الشكل 2). وضعت الزجاجي الذي تم تشريح (الأساسية والقشرة) باستخدام طريقة لدينا في كوب زجاجي مع مساحة السطح المعرض معروفة. كان هذا بالمقارنة مع الجسم الزجاجي الذي كان حصادها باستخدام طريقة نشرت في وقت سابق ان يعزل فقط الأساسية الزجاجي 6. وظلت جميع العوامل الأخرى متناسقة عبر المجموعات التجريبية والضابطة. تعرضت السطح الزجاجي للهواء، والتي لديها توتر الأوكسجين المعروفة (~ 160 مم زئبق). وكان التوتر الأوكسجين داخل الجسم الزجاجي منخفضة (<10 مم زئبق). استنادا إلى معدل vitrاستهلاك الأوكسجين eous يحددها شوي وآخرون (14) لزجاجي في ولاية هلام، يمكننا استخدام المعادلة للنقل الأكسجين الأبعاد 1 (في أشكال حالة مستقرة أو غير مستقرة). عن طريق قياس توتر الأوكسجين مسافة المعروفة داخل سطح زجاجي، ونحن يمكن التحقق من صحة تجريبيا معامل الانتشار. وسجلت توتر الأوكسجين مع التحقيق الأكسجين مثل أكسفورد، وكان معدل الخطأ ± 10٪. تم جمع عينة كل 30 ثانية. وجود قشرة زجاجي يؤثر على معدل انتشار الأكسجين في الجسم الزجاجي منتصف. في ظل وجود القشرة الزجاجية، ونشر الأكسجين يحدث على مدى فترة زمنية أطول.
الخصائص الفيزيائية للصلب الزجاجي والقشرة لها تأثير في الصحة والمرض. على سبيل المثال، مترجمة، وقد اقترح الأوكسجين العين التكميلي لعلاج نقص التروية الشبكية 8. فهم معاملات نشر مختلفة لالأكسجين من خلال قشرة زجاجيالأساسية سوف تمكن الباحثين على التنبؤ المعدل الفعلي للتسليم الأكسجين إلى شبكية العين.
الشكل 1: الصليب عرض المقاطع من العين التي تظهر الهياكل التشريحية ذات الصلة (معدلة من المعهد الوطني للعيون والمعاهد الوطنية للصحة) والقرنية هي النسيج الشفاف الذي يشكل الأمامي الأكثر الجزء من العين ويوفر جزءا كبيرا من العين البصرية السلطة. حوف هو تقاطع القرنية والملتحمة والصلبة. الصلبة تمتد من حوف إلى معظم الجانب الخلفي من العين حيث يلتقي العصب البصري. الملتحمة هي ظهارة رقيقة خطوط الخارج جدا للعين ويشكل الحدود بين البيئة الخارجية والصلبة. المكونات الداخلية للعين تتكون من الغرفة الأمامية، عدسة، القزحية والجسم الهدبي، غرفة الخلفي، الخلفية تجويف، الشبكية والمشيمية. وvitreouويتألف الصورة الأساسية في المنطقة الوسطى من الجسم الزجاجي، داخل التجويف الخلفي من العين. وتقع القشرة الزجاجية في جميع أنحاء الجسم الزجاجي وتعلق على شبكية العين في عدة نقاط منها مسطح بارس والأوعية الشبكية، القرص البصري والبقعة. قاعدة الزجاجي هي منطقة الأبعاد الثلاثة التي تمتد من ~ 2 مم سابقة لمشرشر أورا إلى 3 ملم الخلفي لمشرشر أورا. المشيمية هي طبقة الأنسجة الوعائية التي تقع بين الصلبة والشبكية وتوفر إمدادات الدم إلى شبكية العين الخارجي. الشبكية هي طبقة العصبي الحسي من العين الذي subserves قدرة ضوء ارسال العين. الصلبة هي طبقة مبهمة البيضاء التي توفر الجزء الأكبر من الدعم الهيكلي للجدار العين.
الشكل 2: قطعة توتر الأوكسجين من الفكاهة زجاجي مع الزمن قطعة توتر الأوكسجين في الجسم الزجاجي الأساسية (الخط الأخضر) مقارنة ضد كله سليمةitreous (الخط الأزرق). وضعت لجنة التحقيق الاستشعار الأوكسجين في منتصف العينة وتعرض العينة للهواء الذي يحتوي على توتر الأوكسجين من 160 مم زئبق.
الرقم 3: أمثلة معزولة الجسم الزجاجي كله. أعلى الصورة مثال على الجسم الزجاجي سليمة كله لا تزال تعلق على حافة صلبوية. الصورة الوسطى هي مثال على الجسم الزجاجي سليمة كله دون الصلبة ولكن مع بعض الأنسجة الشبكية المتبقية. أسفل هو مثال كله، الجسم الزجاجي سليمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك نوعان من الخطوات الحاسمة التي يجب تنفيذها بعناية أثناء تشريح الجسم الزجاجي. الخطوة 3، وخلق رفرف الصلبة سمك الكامل، هو أمر حاسم في تشريح كامل. ينبغي الحرص على عدم قطع في المشيمية عند إنشاء سمك كامل رفرف الصلبة. في خطوة حاسمة أخرى يتم تشريح بعيدا الصلبة من المشيمية. يجب أن تتم هذه الخطوة بعناية لمنع خلق ثقوب متعددة في المشيمية التي الزجاجي يمكن أن تمتد خارج. هل هناك طريقة لتعديل البروتوكول والتي لا تزال تشريح سليمة الفكاهة زجاجي كلها. خطوة 6 يمكن أن يتأخر حتى يمكن إزالتها الخطوة 8. المشيمية في نهاية بعد وضع النسيج الزجاجي في الموقع المطلوب.
الحد من هذا الإجراء هو أنه خلال تشريح، وهناك الإشارات البصرية الوحيدة تشير إلى نجاح ودقة تشريح زجاجي سليمة. منذ الأساسية الزجاجي والقشرة على حد سواء شفافة والتمييز بينهن للعين المجردة، وهذايمكن أن يكون تحديا. عن طريق ملاحظة التصاق شبكية العين على الجسم الزجاجي فمن الممكن لتحديد ما إذا كان قد حدث تشريح ناجحة من القشرة زجاجي. خلاف ذلك، والمواد الدوائية، مثل Kenalog، ويمكن استخدامها لتحسين التصور 15 من زجاجي ولكن لا يمكن أن نسمح بسهولة إلى التمييز بين القشرة الزجاجية والأساسية الزجاجي. قيود أخرى من هذه التقنية هو أنه الأكثر فعالية لتشريح جل الجسم الزجاجي. هلام الزجاجي البشري هو نسيج غير المتجددة أن يخضع لتسييل الغاز الطبيعي مع تقدم العمر. هذا تسييل يمنعنا من تشريح تماما كله، زجاجي سليمة من العين. وبالتالي، أسلوبنا لا تمتد إلا إلى الجسم الزجاجي من الحيوانات مثل الأبقار والخنازير والأرانب، أو عيون البشر الشباب الذين ليس لديهم كميات كبيرة من تسييل. النكتة زجاجي في هذه الحيوانات تميل إلى أن تكون تماما في حالة هلام.
ومع ذلك، في الوقت الحالي، لا توجد طريقة المعمول بها، التي كانت تنازلياribed في التفاصيل، لتشريح الجسم الزجاجي كلها سليمة من عيون الجثث. حاليا، إلا أن تقنيات تشريح الزجاجي الذي تم تفصيله بشكل جيد تنطوي على تشريح مناطق فريدة من نوعها ولكن منفصلة من الجسم الزجاجي 7 أو تشريح فقط جوهر الزجاجي 6.
تطبيقات تشريح الفكاهة زجاجي سليمة تحت الامتنان وغير المستغلة. الخبرة الجراحية مع الجسم الزجاجي وكذلك الدراسات السريرية، التشريحية المرضية والكيمياء الحيوية تشير إلى أن الخواص الكيميائية والهيكلية للالزجاجي يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا 16،17. وبالتالي، فمن الضروري للحفاظ على بنية الجسم الزجاجي كله لدراسة وظيفة الجسم الزجاجي في علم وظائف الأعضاء والتشريح العين. يمكن explanted زجاجي سليمة إلى العالم شفافة لتحسين التصور خلال التجارب. ويمكن بعد ذلك أن تستخدم لمجموعة متنوعة من الاختبارات / الكيميائية الميكانيكية لتحسين قياسات البدنية / دعامة النشاط الحيويerties من النكتة زجاجي. على سبيل المثال، فإننا نقترح أن زجاجي سليمة كله تشريح يمكن أن تستخدم بدلا من المياه المالحة وبدائل لزجة، أو الأساسية الزجاجي في التجارب الريولوجيا استشهد 6،18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 forceps | Storz Opthalmics | E1793 | |
| Westcott Tenotomy Scissors Curved Right | Storz Opthalmics | E3320 R | |
| Scalpel Handle No. 3 | VWR | 25607-947 | |
| Scalpel Blade, #11, for #3 Handle | VWR | 470174-844 |
References
- Siggers, J. H., Ethier, C. R.
- Sebag, J. Age-related changes in human vitreous structure. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 225 (2), 89-93 (1987).
- Grignolo, A.
- Gisladottir, S., Loftsson, T., Stefansson, E. Diffusion characteristics of vitreous humour and saline solution follow the Stokes Einstein equation. G Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 247 (12), 1677-1684 (2009).
- Xu, J., Heys, J. J., Barocas, V. H., Randolph, T. W. Permeability and diffusion in vitreous humor: implications for drug delivery. Pharm Res. 17 (6), 664-669 (2000).
- Watts, F., Tan, L. E., Wilson, C. G., Girkin, J. M., Tassieri, M., Wright, A. J. Investigating the micro-rheology of the vitreous humor using an optically trapped local probe. Journal of Optics. 16 (1), 015301 (2014).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Dissection of human vitreous body elements for proteomic analysis. J Vis Exp. (47), e2455 (2011).
- Abdallah, W., Ameri, H., et al. Vitreal oxygenation in retinal ischemia reperfusion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (2), 1035-1042 (2011).
- Goldenberg, D., Trese, M. Pharmacologic vitreodynamics: what is it? Why is it important. Expert Review of Ophthalmology. 3 (3), 273-277 (2008).
- Choonara, Y. E., Pillay, V., Danckwerts, M. P., Carmichael, T. R., du Toit, L. C. A review of implantable intravitreal drug delivery technologies for the treatment of posterior segment eye diseases. J Pharm Sci. 99 (5), 2219-2239 (2010).
- Balachandran, R. K., Barocas, V. H. Computer modeling of drug delivery to the posterior eye: effect of active transport and loss to choroidal blood flow. Pharm Res. 25 (11), 2685-2696 (2008).
- Smith, C. a, Newson, T. a, et al. A framework for modeling ocular drug transport and flow through the eye using micro-CT. Phys Med Biol. 57 (19), 6295-6307 (2012).
- Quiram, P. A., Leverenz, V. R., Baker, R. M., Dang, L., Giblin, F. J., Trese, M. T. Microplasmin-induced posterior vitreous detachment affects vitreous oxygen levels. Retina. 27 (8), 1090-1096 (2007).
- Shui, Y., Holekamp, N. The gel state of the vitreous and ascorbate-dependent oxygen consumption: relationship to the etiology of nuclear cataracts. Arch Ophthalmol. 127 (4), 475-482 (2009).
- Burk, S. E., Da Mata, A. P., Snyder, M. E., Schneider, S., Osher, R. H., Cionni, R. J. Visualizing vitreous using kenalog suspension. J Cataract Refract Surg. 29 (4), 645-651 (2003).
- Spaide, R. Visualization of the Posterior Vitreous with Dynamic Focusing and Windowed Averaging Swept Source Optical Coherence Tomography. Am J Ophthalmol. S0002-9394 (14), 00537-00536 (2014).
- Domalpally, A., Gangaputra, S., Danis, R. P. Diseases of the Vitreo-Macular Interface. 21, Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. 21-27 (2014).
- Stocchino, R., Repetto, A., Cafferata, C. Experimental investigation of vitreous humour motion within a human eye model. Phys Med Biol. 50 (19), 4729-4743 (2005).
