Summary
Comet assay meet DNA-breuken, veroorzaakt door verschillende factoren. Als alle elementen (behalve oxidatieve stress) veroorzaakt DNA beschadiging constant worden gehouden, de hoeveelheid DNA schade een goede indirecte parameter van oxidatieve stress. Het doel van dit protocol is het comet assay gebruikt voor indirecte meting van oxidatieve stress.
Abstract
Hogere eukaryotische organismen kan niet leven zonder zuurstof; nog, paradoxaal genoeg, zuurstof kan schadelijk zijn voor hen. De zuurstof molecuul chemisch relatief inert omdat het twee ongepaarde elektronen in verschillende pi * anti-bonding orbitalen. Deze twee elektronen parallelle spins, wat betekent dat ze roteren in dezelfde richting rond hun eigen as. Daarom zuurstof molecuul niet erg reactief. Activering van zuurstof kan plaatsvinden door twee verschillende mechanismen; hetzij door reductie via één elektron per keer (monovalent reductie), of door absorptie van voldoende energie om de rotatie van één van de ongepaarde elektronen te keren. Dit resulteert in de productie van reactieve oxidatieve deeltjes (ROS). Er zijn een aantal manieren waarop het menselijk lichaam elimineert ROS in de fysiologische toestand. Als ROS productie overschrijdt de reparatie capaciteit, oxidatieve stress resultaten en schade verschillende moleculen. Er zijn veel verschillende manieren waarop oxidatieve stress me kanasured. Dit manuscript is gericht op een van de genoemde cel gelelektroforese, ook bekend als "comet assay" de metingen van DNA breuken toelaat werkwijzen. Als alle factoren waarvan bekend is DNA schade, anders dan oxidatieve stress constant worden gehouden, de hoeveelheid DNA schade, gemeten door comet assay is een goede parameter van oxidatieve stress. Het principe is eenvoudig en berust op het feit dat DNA-moleculen negatief geladen. Een intact DNA-molecuul zodanig vergroot dat het niet migreert tijdens elektroforese. DNA breuken, echter indien aanwezig resulteren in kleinere fragmenten die bewegen in het elektrische veld naar de anode. Kleinere fragmenten migreren sneller. Aangezien de fragmenten verschillende grootten het uiteindelijke resultaat van de elektroforese is geen afzonderlijk lijn maar een continuüm met de vorm van een komeet. Het systeem maakt een kwantificering van de resulterende "comet" en dus van de DNA breuken in de cel.
Introduction
Comet assay werd voor het eerst ontwikkeld door Zweedse wetenschappers Ostling en Johanson 1. DNA is een negatief geladen molecuul. Tijdens electroforese, kleinere, beschadigde DNA-fragmenten sneller reizen naar een positief geladen anode 2. De kleinere DNA-fragmenten, hoe sneller de migratie naar de anode tot een typische "comet" met een "head" bestaande uit intacte, onbeschadigde DNA en een "staart" bestaande uit beschadigde DNA-fragmenten 3 vormen. Beschadigd DNA kan worden hersteld door verschillende mechanismen in het lichaam 4, waarbij het genereren houden van DNA breuken vrij evenwichtig 5. Indien echter de weegschaal in het voordeel van DNA breuken, kunnen de onderbrekingen ophopen en uiteindelijk bijdragen aan de ontwikkeling van een ziekte.
Ons DNA lijdt ongeveer 0.000165% schade op een gegeven moment 6. Enkelstrengs DNA breuken betrekking op een defect aan een van de twee strengen van de DNA dubbele helixdat dubbelstrengs DNA breuken veroorzaakt wanneer beide strengen van de DNA dubbele helix beschadigd. Er zijn verschillende factoren die de hoeveelheid DNA breuken op een bepaald moment kan versterken, zoals de leeftijd van de cel, sigarettenrook, verschillende drugs of oxidatieve stress 9/7. Als alle factoren die leiden tot betere DNA-breuken constant worden gehouden, dan is de kwantificering van DNA breuken via comet assay is een goede indirecte parameter van oxidatieve stress.
De methode van de komeet assay wordt steeds meer gebruikt vandaag de dag in de geneeskunde, waaronder de oogheelkunde. Een reden hiervoor is dat oxidatieve stress steeds meer erkend als pathogenese van verschillende ziekten 8-11 en comet assay is een methode waarbij oxidatieve stress indirect kunnen worden gekwantificeerd.
Protocol
Studies over comet assay uitgevoerd aan de Universiteit van Basel, afdeling Oogheelkunde werden goedgekeurd door het Lokaal Ethisch Comité van Basel
1. Bereiding van reagentia
- Bereid Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (Ca ++, Mg ++ vrij) door toevoeging van PBS (1 L packet) en 990 ml dH 2 O tot de media. Stel de pH op 7,4. Bewaar bij RT.
- Bereid lyserende oplossing: Ter voorbereiding 1,000 ml toe 2,5 M NaCl (146,1 g), 100 mM EDTA (37,2 g) en 10 mM Trizma base (1,2 g) in dH 2 O.
- Elektroforesegel buffer (300 mM NaOH / 1 mM EDTA) door toevoeging van 30 ml 10 M NaOH en 7,5 ml 0,2 M EDTA, qs 1500 ml dH 2 O en meng. Het totale volume is afhankelijk van de gel box vermogen. Voor gebruik wordt de pH van de buffer op een pH van> 13 waarborgen.
- Bereid neutralisatie buffer met 0,4 M Tris (48,5 g toegevoegd aan ~ 800 ml dH 2 O, aan te passen pH tot 7,5), geconcentreerd (& #62; 10 M HCl) in 1000 ml met dH 2 O. Bewaar de oplossing bij kamertemperatuur.
- Bereid kleurstofoplossing. Om ethidiumbromide (EtBr, 10x voorraad, 20 ug / ml) toe 10 mg EtBr in 50 ml dH 2 O en bewaar bij kamertemperatuur. Voor 1x Stock - meng 1 ml met 9 ml dH 2 O. VOORZICHTIG! Behandel EtBr met voldoende voorzorg omdat het een bekend carcinogeen.
2. Isolatie van leukocyten
- Verkrijgen menselijke bloedmonsters (20 ml) met een anti-stollingsmiddel zoals heparine via venapunctie.
- Scheid de lymfocyten met een dichtheidsgradiënt celscheider zoals Histopaque.
- Kort verdunnen bloed 1: 1 verhouding met PBS of RPMI (zonder FBS) en laag over 600 ul celseparator vloeistof.
- Centrifuge 1800 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Zuig het "buffy" coat in 3-5 ml PBS / RPMI en gecentrifugeerd bij 300 x g gedurende 10 min aan de lymfocyten pellet.
- Ophalen lymfocyten van net boven grens tussen PBS (RPMI) En celscheider vloeistof met behulp van een pipet. Verwijder de leukocyten bands uit de interface tussen plasma en de cel separator vloeibare lagen van elke buis en verzamelen in een 50 ml buis.
- Breng het totale volume op 50 ml met koude Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Was de celsuspensie driemaal met DMEM bij 300 xg gedurende 10 min.
- Tel het totale aantal cellen met een hemocytometer. Hang de cellen in PBS en aliquote in microcentrifugebuizen op 10 7 cellen / buis.
- Pipetteer 0,4 ml van de cellen in een 5 ml plastic wegwerp buis. Voeg 1,2 ml 1% lage gelerende temperatuur agarose bij 40 ° C. Mix en snel en pipet 1,2 ml celsuspensie op de agarose-bedekte oppervlak van een pre-coated slide. Vermijd het produceren van bubbels.
- Laat de agarose gel gedurende ongeveer 2 min. Wees consistent met de tijd en de temperatuur gebruikt voor geleren, en ervoor zorgen dat agarose volledig is ingesteld voordat dompelen in lysisoplossing. Na volledig set, onderdompelen in lyserende oplossing bij ~ 4 ºC.
3. Lysis en elektroforese
Opmerking: De beschreven procedure voor elektroforese onder pH> 13 alkalische omstandigheden.
- Na minstens 2 uur bij ~ 4 ºC, verwijder voorzichtig dia's uit de lyserende Solution. Plaats glijdt naast elkaar op het horizontale gel box nabij een uiteinde, glijden deze zo dicht mogelijk bij elkaar.
- Vul het buffer reservoirs met vers op pH> 13 elektroforesebuffer totdat het vloeistofniveau volledig bedekt slides (belletjes via agarose voorkomen).
- Laat slides zitten in de alkalische buffer gedurende 20 min om voor het afwikkelen van DNA en expressie van alkali-labiele beschadiging.
- Schakel de stroomtoevoer naar 25 volt (~ 0,75 V / cm) en stel de huidige tot 300 milliampère door het verhogen of verlagen van de buffer-niveau. Electrophorese de objectglaasjes gedurende 30 minuten.
- Schakel de stroom uit. Til de dia's uit de buffer en pkant op een drain lade. Drop verstandig de vacht van de dia's met neutralisatie buffer. Laat de objectglaasjes zitten minstens 5 min. Giet slides en herhaal nog twee keer.
- Vlekken op de dia's met 80 pi 1x ethidiumbromide (EtBr) en laat gedurende 5 minuten en vervolgens duik in koud gedestilleerd water om overtollig vlek te verwijderen. Plaats dan een dekglaasje over de glijbaan en onmiddellijk op te slaan. Store dia's voor een maand bij RT in droge omstandigheden.
OPMERKING: Other DNA kleurstoffen (zoals SYBR-groen) kunnen eveneens worden gebruikt. Let op! Draag beschermende handschoenen als de meeste kleurstoffen zijn mutageen.
4. Kwantificering van DNA Breaks
- Om de DNA-schade te visualiseren, observeren de EtBr-gekleurd DNA dia onder een 40x doelstelling fluorescentiemicroscoop.
- Beoordelen DNA schade kwantitatief in de cellen door de lengte van DNA migratie en het percentage DNA migreerden (figuur 1A). Kwantificeren van DNA-schade (Figuur 1B) door de achterklep moment en Olive-moment. Definities van Tail-Moment en Olive -Moment zijn eerder gegeven 8-10.
LET OP: Het is onze ervaring dat het genoeg is om vast te houden met één van de parameters. De cellen worden gefotografeerd door de geautomatiseerde tool die scant over de microscoop glijbaan en foto cellen. Kwantificatie van DNA breuken kan door beeldanalyse software pakketten. Er zijn verschillende software pakketten die op maat zijn gemaakt om het beeld van de cellen vast te leggen en te kwantificeren DNA-schade. We raden het gebruik van dezelfde software pakket gedurende het experiment. De laborant identificeert de intacte cel of komeet worden gescoord op de computer en het klikken met de muis op het. De comet of intacte cel wordt automatisch gescoord.
Representative Results
Hoewel de werkwijze van comet assay maakt reproduceerbare resultaten kan worden beïnvloed door verschillende factoren. Een dergelijke factor is of de leukocyten worden ingevroren voorafgaand aan lysis en gelelektroforese of dat dit wordt uitgevoerd op vers bereide leukocyten. Figuur 2 toont aan dat in groep 2, waarbij leukocyten voorafgaand aan lysis en gelelektroforese ss- DNA werden ingevroren onderbrekingen waren significant hoger dan in groep 1 waarin lysis en gel -electrophoresis werd uitgevoerd op vers bereide cellen.
De test kan ook worden gebruikt om indirect beoordelen systemische oxidatieve stress. Tabel 1 toont de beschrijvende statistieken voor achterklep moment en Olijf- moment in rokers en gezonde proefpersonen. De gegevens blijkt dat het roken van een half pakje sigaretten per dag meer dan verdubbelt ssDNA onderbrekingen in de circulerende leukocyten 9.
Figuur 1. (A) beeldt de microscoop tijdens comet assay analyse. (B) Δ beeldt een typische "komeet" met een heldere kop en staart (beschadigde kleinere DNA-fragmenten). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. ssDNA breuken waren significant hoger bij leukocyten werden ingevroren (groep 2) dan na het bereiden leukocyten voorafgaand aan lysis en gelelektroforese werden gebruikt.
Discussion
Zweedse wetenschappers Ostling en Johanson waren de eerste in hun vakgebied te komeettest gebruiken om DNA-schade in de cellen 1 kwantificeren. De neutrale omstandigheden dat de twee wetenschappers die echter alleen kon de detectie van dubbelstrengs DNA breuken. Singh et al. Ingericht later de assay voor gebruik onder alkalische omstandigheden, die een gevoelige versie die dubbel en enkelstrengs DNA breuken kunnen beoordelen en detecteren alkali-labiele plaatsen 12 geproduceerd. Sinds de eerste ontwikkeling is de assay aangepast in verschillende stappen het geschikt voor het beoordelen typen DNA schade in verschillende celtypes 13-15 te maken.
Zoals bij alle technieken, waarbij strikte aandacht voor technische details belangrijk om nauwkeurige resultaten te 16 verkrijgen. Op basis van onze ervaring, worden de beste resultaten verkregen als elke methodologische stap uit de oplossing voorbereiding tot komeet-kwantificering wordt uitgevoerd door deskundige laboratorium technicians. Het gebruik van verse en juist bereide media, adequate pipetteertechnieken, exacte timing en (zoals eerder in de paragraaf resultaten vermeld) het gebruik van vers bereide leukocyten zijn essentieel om lysis en gelelektroforese om nauwkeurige resultaten te 17 verkrijgen.
Alle afzonderlijke stappen in deze assay zijn even belangrijk voor het verkrijgen van betrouwbare resultaten. 16 Over het algemeen de beste resultaten worden verkregen wanneer elke methodologische stappen van oplossingspreparaat tot comet kwantificering wordt uitgevoerd door ervaren laboratorium technicians.Important lijken het gebruik van verse en juist bereide media voldoende pipetteertechnieken, exacte timing en zoals reeds in de resultaten sectie het gebruik van vers bereide leukocyten voor lysis en gelelektroforese om voldoende resultaten te verkrijgen van het 17 genoemde assay.
Als andere methodes, de komeet assay techniek heeft zijn advanTages en nadelen. Als een gevoelige werkwijze is de test gevoelig voor factoren (bijvoorbeeld, UV-belichting) die DNA breuken kunnen vergroten, zodat de resultaten beïnvloeden. Elke factor die oxidatieve stress kunnen versterken, met uitzondering dat wordt onderzocht, moet worden vermeden. Stressoren kunnen niveau van oxidatieve stress niet alleen in leukocyten, maar ook in alle andere bloed mediums en lymfocyten te verhogen. Zoals eerder vermeld zijn er veel verschillende en directere manier meten oxidatieve stress 18,19. De comet assay is een van vele werkwijzen die bepaalde voordelen heeft. Deze omvatten een relatief lage kostprijs, het kleine aantal cellen vereist (<10.000 cellen) en daarmee de kleine bloedmonsters vereist per patiënt, de relatieve korte periode nodig is om DNA schade in cellen (ongeveer 3 dagen) kwantificeren de gevoeligheid en de wijdverbreide toepassing op ezels DNA schade in verschillende celtypen. In het verleden kiezen we ervoor om te werken met leukocyten omdat we ervaring met dezeceltype en toepassing was voor specifieke studie gepland. Een ander voordeel van het comet assay is dat het kan worden gebruikt om verschillende typen en niveaus van DNA schade detecteert en daardoor kan in diverse andere gebieden van studies naast oxidatieve stress zoals DNA herstel studies, aanvulling proeven of genotoxiciteit worden toegepast.
Oxidatieve stress is nu erkend als een centrale rol spelen in de pathogenese van verschillende ziektes. De comet assay werkwijze, terwijl een van vele manieren voor het meten van oxidatieve stress 18,19, relatief eenvoudig, veelzijdig en goedkoop. Wanneer de knie, kan deze methode worden gebruikt in alle gebieden van de geneeskunde, waarin oxidatieve stress speelt rol 8-10,20,21.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
We zouden graag de LGA Stiftung bedanken, in Triesen Liechtenstein, voor financiële ondersteuning van ons onderzoek naar oxidatieve stress.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Qualigens | (CPW59) | |
| Disodium EDTA | HiMedia | (RM1370) | |
| Ethidium Bromide | Sigma | (E-8751) | |
| Histopaque | Sigma | (1077-1) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free) | HiMedia | (TS1006) | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Ranbaxy Rankem | (S0160) | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | BDH-Merck | (89021) | |
| Triton X-100 | HiMedia | (RM 845) | |
| Trizma Base | Spectrochem | ||
| Materials required for gel electrophoresis | |||
| Normal Melting Agarose (NMA) | HiMedia | (RM273) | |
| Low Melting Point Agarose (LMPA) | Sigma | (A9414) | |
| Methanol - Qualigens | |||
| Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm) | Blue Star | ||
| Microcentrifuge Tubes | Tarsons | (500010) | |
| Micropipettor and Tips | Tarsons | ||
| Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides | |||
References
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
- Phillips, J. L., Singh, N. P., Lai, H. Electromagnetic fields and DNA damage. Pathophysiology. 16 (2-3), 79-88 (2009).
- Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models. Cell Biol Toxicol. 25 (1), 5-32 (2009).
- Aiub, C. A., Pinto, L. F., Felzenszwalb, I. DNA-repair genes and vitamin E in the prevention of N-nitrosodiethylamine mutagenicity. Cell Biol Toxicol. 25 (4), 393-402 (2009).
- Bartsch, H., Nair, J. Chronic inflammation and oxidative stress in the genesis and perpetuation of cancer: role of lipid peroxidation, DNA damage, and repair. Langenbecks Arch Surg. 391 (5), 499-510 (2006).
- Martin, L. J. DNA damage and repair: relevance to mechanisms of neurodegeneration. J Neuropathol Exp Neurol. 67 (5), 377-387 (2008).
- Choy, C. K., Benzie, I. F., Cho, P. UV-mediated DNA strand breaks in corneal epithelial cells assessed using the comet assay procedure. Photochem Photobiol. 81 (3), 493-497 (2005).
- Mozaffarieh, M., et al. Comet assay analysis of single-stranded DNA breaks in circulating leukocytes of glaucoma patients. Mol Vis. 14, 1584-1588 (2008).
- Mozaffarieh, M., Konieczka, K., Hauenstein, D., Schoetzau, A., Flammer, J. Half a pack of cigarettes a day more than doubles DNA breaks in circulating leukocytes. Tob Induc Dis. 8 (14), (2010).
- Mozaffarieh, M., Schotzau, A., Josifova, T., Flammer, J. The effect of ranibizumab versus photodynamic therapy on DNA damage in patients with exudative macular degeneration. Mol Vis. 15, 1194-1199 (2009).
- Pertynska-Marczewska, M., Merhi, Z. Relationship of Advanced Glycation End Products With Cardiovascular Disease in Menopausal Women. Reprod Sci. , (2014).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells). Exp Cell Res. 175, 184-191 (1988).
- Gaivão, I., Sierra, L. M. Drosophila comet assay: insights, uses, and future perspectives. Front Genet. 5, 304 (2014).
- Zhang, J., et al. DNA damage in lens epithelial cells and peripheral lymphocytes from age-related cataract patients. Ophthalmic Res. 51 (3), 124-128 (2014).
- Huet, S. A., Vasseur, L., Camus, S., Chesné, C., Fessard, V. Performance of comet and micronucleus assays in metabolic competent HepaRG cells to predict in vivo genotoxicity. Toxicol Sci. 138 (2), 300-309 (2014).
- Danson, S., Ranson, M., Denneny, O., Cummings, J., Ward, T. H. Validation of the comet-X assay as a pharmacodynamic assay for measuring DNA cross-linking produced by the novel anticancer agent RH1 during a phase I clinical trial. Cancer chemotherapy and pharmacology. 60, 851-861 (2007).
- Moller, P., Moller, L., Godschalk, R. W., Jones, G. D. Assessment and reduction of comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay Validation Group. Mutagenesis. 25, 109-111 (2010).
- Chan, S. W., Chevalier, S., Aprikian, A., Chen, J. Z. Simultaneous quantification of mitochondrial DNA damage and copy number in circulating blood: a sensitive approach to systemic oxidative stress. BioMed Res Int. , 157-547 (2013).
- Sanchez-Quesada, J. L., Perez, A. Modified lipoproteins as biomarkers of cardiovascular risk in diabetes mellitus. Endocrinol Nutr. 60, 518-528 (2013).
- Gandhi, G., Kaur, G., Nisar, U. A. Cross-sectional case control study on genetic damage in individuals residing in the vicinity of a mobile phone base station. Electromagn Biol Med. 9, 1-11 (2014).
- Cabarkapa, A., et al. Protective effect of dry olive leaf extract in adrenaline induced DNA damage evaluated using in vitro comet assay with human peripheral leukocytes. Toxicol In Vitro. 28 (3), 451-456 (2014).
