Summary
コメットアッセイは、様々な要因によって誘発されるDNA破壊を測定します。 DNAの損傷を引き起こす（酸化ストレスを除く）すべての要因が一定に保持される場合、DNA損傷の量は、酸化ストレスの良い間接的なパラメータです。このプロトコルの目的は、酸化ストレスの間接的な測定のためのコメットアッセイを使用することです。
Abstract
高等真核生物は酸素なしで生きることはできません。まだ、逆説的に、酸素は、それらに有害であることができます。それは別のπ*反結合軌道にある2つの不対電子を有するので、酸素分子は、化学的に比較的不活性です。これらの2つの電子が、彼らは自分自身の軸の周りに同じ方向に回転するという意味、平行スピンを持っています。酸素分子は非常に反応しないのはこのためです。酸素の活性化は、二つの異なるメカニズムによって発生することがあります。いずれかの時間（一価の減少）で一つの電子を介して還元により、または十分なエネルギーの吸収による不対電子のスピンを反転させます。これは、反応性酸化種（ROS）の産生をもたらします。人間の体は、その生理学的状態のROSを排除するいくつかの方法があります。 ROS生産は修復能力、酸化ストレスの結果と被害の異なる分子を超えた場合。酸化ストレスは私することのできる多くの異なる方法が存在しますasured。この原稿はまた、DNA切断の測定を可能にする「コメットアッセイ」として知られている細胞ゲル電気泳動、名前のメソッドのいずれかに焦点を当てています。酸化的ストレスの他のDNA損傷を引き起こすことが知られているすべての要因が一定に保たれている場合、コメットアッセイによって測定したDNA損傷の量は、酸化ストレスの良好なパラメータです。原理は単純であり、DNA分子は負に帯電しているという事実に依存します。無傷のDNA分子は、電気泳動中に移動しないような大きなサイズを有します。 DNA切断が、陽極に向かって電界内を移動より小さな断片に存在する結果であれば。小さな断片が速く移動します。フラグメントは、異なるサイズを有するように、電気泳動の最終結果は、異なるラインではなく、彗星の形状に連続ではありません。システムは、得られた「彗星」のため、細胞内のDNA切断の定量化を可能にします。
Introduction
コメットアッセイは、最初にスウェーデンの科学者Ostlingとヨハンソン1によって開発されました。 DNAは負に荷電した分子です。電気泳動の間、小さく、損傷を受けたDNA断片は、正に荷電したアノード2に向かって速く移動します。 DNA断片が小さいほど、陽極に向かってより速くそれらの移動は、無傷の、損傷を受けていないDNAおよび損傷DNA断片3からなる「尾部」からなる「ヘッド」の典型的な「コメット」を形成します。損傷を受けたDNAは5 DNA切断の発生はかなりバランスの維持本体4内の異なるメカニズムによって修復することができます。しかし、バランスがDNA切断に賛成している場合は、ブレークは蓄積することができ、最終的に疾患の発展に貢献します。
私たちのDNAは、与えられた時間6で約0.000165パーセントのダメージを受けます。一本鎖DNAの切断は、DNA二重らせんの2本の鎖のうちの1上の欠陥を参照してください。DNA二重らせんの両方の鎖が破損しているときに、二本鎖DNA切断が発生しているのに対し。このような細胞の年齢、タバコの煙、様々な薬物や酸化ストレス7-9として与えられた時点でのDNA切断の量を高めることができる様々な要因があります。強化されたDNA切断につながるすべての要因が一定に保たれる場合には、コメットアッセイによるDNA切断の定量化は、酸化ストレスの良い間接的なパラメータです。
コメットアッセイの方法は、眼科学などの医学でますます、今日使用されています。この理由の1つは、酸化的ストレスは、より多くの種々の疾患8-11及びコメットアッセイの発症メカニズムとして認識さは酸化ストレスを間接的に定量化することが可能な1つの方法であることです。
Protocol
バーゼル大学で行わコメットアッセイの研究は、眼科学科はバーゼルの現地倫理委員会によって承認されました
試薬の調製
- ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（カルシウム++、Mg ++を無料）をPBS（1 Lパケット）とメディアへのdH 2 Oの990ミリリットルを追加することにより、溶液を調製します。 pHを7.4に調整します。室温で保管してください。
- 溶解液を調製：1,000ミリリットルのdH 2 O中の2.5MのNaCl（146.1グラム）、100mMのEDTA（37.2グラム）および10mMのTrizma塩基（1.2グラム）を追加準備するには
- 1500ミリリットルのdH 2 Oに10 M NaOHを30ミリリットルと7.5ミリリットルの0.2M EDTA、適量を添加することにより、電気泳動緩衝液（300mMのNaOHを/ 1mMのEDTA）を調製し、よく混ぜます。総容量は、ゲルボックス容量に依存します。使用前に、> 13のpHを確保するために、緩衝液のpHを測定します。
- 0.4 Mトリスを含む中和バッファーを準備します（＆＃濃縮（48.5 gmは〜800ミリリットルのdH 2 Oは、7.5にpHを調整するために追加されました）62; 10 MのHCl）をdH 2 Oで千ミリリットルでこの溶液を室温で保管してください。
- 染色溶液を調製します。臭化エチジウム（EtBrを、10倍の株価、20 / mlの）に室温で50ミリリットルのdH 2 Oおよび店舗でのEtBr 10mgを追加します。 1X株式の- 9ミリリットルのdH 2 Oで1ミリリットルを混ぜます慎重な！それが知られている発がん性物質であるように、適切な予防措置とのEtBrを処理します。
白血球の2の単離
- 静脈穿刺を用いてヘパリンなどの抗凝固剤を用いたヒト血液サンプル（20ml）で取得します。
- このようなヒストとして密度勾配細胞分離器を用いてリンパ球を分離します。
- （FBSなし）PBSまたはRPMIで1の割合と層600の上にμlの細胞分離液：簡単に言うと、1に血液を希釈。
- 4℃で20分間遠心操作し1,800×gで。 PBS / RPMI 3〜5mlのに「バフィー」のコートを吸引し、リンパ球をペレット化し、10分間300×gで遠心分離しました。
- ただPBS（RPMIとの境界上からリンパ球を取得ピペッターを使用して）および細胞分離液。プラズマと各チューブの細胞分離液層の間の界面からの白血球バンドを外し、1 50mlチューブに集めます。
- 冷ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で50mlに全量を。 10分間、300×gでDMEMで細胞懸濁液を3回洗浄します。
- 血球計数器を用いて、細胞の合計数をカウントします。 PBSで細胞を懸濁し、10 7細胞/チューブでマイクロ遠心チューブに等分。
- ピペットで5ミリリットル使い捨てプラスチックチューブへの細胞の0.4ミリリットル。 40℃で1.2ミリリットルの1％低ゲル化温度アガロースを追加します。混合し、迅速かつプレコートスライドのアガロースで覆われた表面上に細胞懸濁液1.2mlのをピペット。泡を生成することは避けてください。
- アガロースは、約2分間、ゲル化することができます。ゲル化のために使用される時間と温度と一致すると、そのアガロースが完全に溶解液に浸す前に設定されていることを確認。完全秒後らは、〜4ºCで溶液を溶解することに水没します。
3.溶解および電気泳動
注：記載された手順は、pH> 13のアルカリ性条件下での電気泳動のためのものです。
- 〜4ºCで少なくとも2時間後、静かに溶解液からスライドを削除します。場所はできるだけ一緒に近く、それらを滑り、一方の端部付近の水平ゲルボックスに並んでスライドします。
- 液面が完全にスライドを覆うまで（アガロース上の泡を避けるため）焼きたてのpH> 13電気泳動バッファーでバッファ貯水池を埋めます。
- スライドは、DNAとアルカリに不安定な損傷の発現の巻き戻しを可能にするために20分間、アルカリ性緩衝液に座ってみましょう。
- 25ボルト（〜0.75 V / cm）での電源をオンにして、上昇又はバッファレベルを低下させることにより、300ミリアンペアの電流を調整。 30分間スライドを電気泳動。
- 電源をオフにします。静かバッファおよびpからスライドを持ち上げますドレイントレイのレース。賢明なコートを中和バッファーでスライドを削除します。スライドは、少なくとも5分間座ってすることができます。スライドを排出し、さらに2回繰り返します。
- 80μlの1×臭化エチジウム（EtBrを）でスライドを染色し、5分間放置した後、余分な汚れを除去するために冷却した蒸留水に浸し。その後、スライド上にカバースリップを置き、それらをすぐに保存します。ストアは、乾燥状態で室温で月にスライドします。
注：他のDNA染色（ 例えば 、SYBR緑）を用いてもよいです。注意！ほとんどの色素は変異原性であるように、保護手袋を着用します。
DNA切断の4定量
- DNA損傷を可視化するために、40倍対物レンズ蛍光顕微鏡下でのEtBr染色DNAのスライドを観察します。
- DNAの移動および移行DNA（ 図1A）の割合の長さを測定することにより定量的に細胞内のDNA損傷を評価します。 Tail-モーメントとオリーブMOMEによるDNA損傷（ 図1B）を定量化しますNT。テールモーメントとオリーブ-Momentの定義は、以前8-10を与えられています。
注：我々の経験では、それはパラメータの一つによって固執するのに十分です。細胞は、顕微鏡スライドや写真細胞上でスキャンする自動化ツールを設定することで、撮影されています。 DNA切断の定量化は、画像解析ソフトウェアパッケージによって行うことができます。カスタムセルの画像をキャプチャし、DNA損傷を定量化するために作られているいくつかの異なるソフトウェア·パッケージがあります。我々は、実験を通して同じソフトウェアパッケージを使用することをお勧めします。ラボの技術者は、無傷の細胞または彗星は、コンピューターで採点されるように識別し、その上にマウスでクリックします。彗星または無傷の細胞は、その後、自動的に採点されます。
Representative Results
コメットアッセイの方法は、再現性のある結果を描画するが、それは様々な要因によって影響され得ます。そのような要因の1つは、白血球が溶解前、ゲル電気泳動、またはこのステップは、新たに調製した白血球の上で実行されるかどうかに凍結保存されているか否かである。 図2は 、白血球が溶解前およびゲル電気泳動SS-DNAに凍結保存したグループ2、でていることを示していますブレークは、溶解し、ゲル-electrophoresisが新たに調製された細胞で行ったグループ1に比べ、有意に高かったです。
アッセイはまた、間接的に全身酸化ストレスを評価するために使用され得ます。表1は、喫煙者と健常者でTail-モーメントとOlive-モーメントの記述統計量を示しています。データは、毎日タバコの半分パック喫煙する循環白血球9でのssDNA休憩を倍以上のことが明らかになりました。
図1（A）は、コメットアッセイの解析中に使用される顕微鏡を示しています。 （B）Δは明るいヘッドとテール（損傷した小さいDNA断片）を有する典型的な「彗星」を示している。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
白血球は、新たに調製した白血球が溶解し、ゲル電気泳動の前に使用したときよりも（グループ2）凍結保存したときに、図2のssDNAブレークが有意に高かったです。
Discussion
スウェーデンの科学者Ostlingとヨハンソンは、セル1におけるDNA損傷を定量化するためにコメットアッセイを使用して、そのフィールドの最初でした。中性条件は、二つの科学者が使用することが、唯一の二本鎖DNA切断の検出を可能にしました。シンらは 、後に二本鎖および一本鎖DNA切断を評価し、アルカリに不安定な部位12を検出することができる敏感なバージョンを生成し、アルカリ条件下で使用するためのアッセイを、適 応しました。その初期の開発以来、このアッセイは、異なる細胞タイプ13-15におけるDNA損傷の種類を評価するために好適にするために様々な段階で修飾されています。
すべての技術と同様に、技術的な詳細に厳密な注意を払うことは、正確な結果16を得ることが重要です。すべての方法論的段階からの溶液製剤彗星への専門家の実験室TECHNによって実行される定量化は、されている場合は、私たちの経験に基づいて、最良の結果が得られていますicians。新鮮で正しく準備されたメディア、適切なピペッティング技術、正確なタイミングと新たに調製した白血球の（以前は結果の項で述べたように）使用の使用は、正確な結果17を得るために溶解し、ゲル電気泳動ためには不可欠です。
このアッセイのすべての個々のステップは、信頼できる結果を得るために等しく重要である。彗星定量まで溶液調製から一つ一つの方法論的なステップは、専門家の研究室によって実行された場合、一般的に最良の結果に16が得られる新鮮で正しく準備されたメディアの使用を思わtechnicians.Important 、適切なピペッティング技術、正確なタイミングとは、すでに結果セクションアッセイ17から適切な結果を得るために溶解し、ゲル電気泳動のために新たに調製した白血球の使用にいいます。
他の方法がそうであるように、コメットアッセイ技術は、アドバンがありますtagesと欠点。感度の高い方法であることは、このアッセイは、DNA切断を増強するため、結果に影響を与える可能性のある要因（ 例えば、UV光）に対して脆弱です。研究されていることを除いて、酸化的ストレスを高めることができる任意の要因は、避けるべきです。ストレッサーは、白血球ではなく、他のすべての血液媒体およびリンパ球だけでなく、酸化ストレスのレベルを上げることができます。前述したように酸化ストレス18,19の測定多くの異なる、より直接的な方法があります。コメットアッセイは、特定の利点を有している多くの方法の一つです。これらは、その比較的低いコストを含む、少数の細胞は、必要な（<10,000細胞）、したがって、患者ごとに必要な少量の血液サンプル、細胞（約3日）におけるDNA損傷を定量化するのに必要な時間の比較的短い期間、その感度異なる細胞型におけるDNA損傷を査定するために、その広範な適用性。私たちはこの経験を持っていたので、過去には、我々は、白血球で動作するように選択します細胞型、それが計画された特定の研究に適用しました。コメットアッセイの別の利点は、異なるタイプおよびDNA損傷のレベルを検出するために使用することができ、そのようなDNA修復試験、補足試験または遺伝毒性試験などの酸化ストレスに加えて研究の様々な他の分野に適用することができることです。
酸化ストレスは、現在、複数の疾患の病因に重要な役割を果たしていると認識されます。コメットアッセイ法は、酸化的ストレス18,19を測定する多くの方法のうちの1つが、比較的単純な汎用性と安価です。習得した場合、この方法は、酸化ストレスが役割8-10,20,21を果たしている医学のすべての領域で使用することができます。
Disclosures
なし。
Acknowledgments
我々は、財政的に酸化ストレスの研究を支援するため、トリーゼンリヒテンシュタイン、LHW財団に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Qualigens | (CPW59) | |
| Disodium EDTA | HiMedia | (RM1370) | |
| Ethidium Bromide | Sigma | (E-8751) | |
| Histopaque | Sigma | (1077-1) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free) | HiMedia | (TS1006) | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Ranbaxy Rankem | (S0160) | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | BDH-Merck | (89021) | |
| Triton X-100 | HiMedia | (RM 845) | |
| Trizma Base | Spectrochem | ||
| Materials required for gel electrophoresis | |||
| Normal Melting Agarose (NMA) | HiMedia | (RM273) | |
| Low Melting Point Agarose (LMPA) | Sigma | (A9414) | |
| Methanol - Qualigens | |||
| Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm) | Blue Star | ||
| Microcentrifuge Tubes | Tarsons | (500010) | |
| Micropipettor and Tips | Tarsons | ||
| Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides | |||
References
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