Introduction
La generazione di memoria immunologica in assenza della malattia è la base fisiologica di vaccinazione efficace 1. Recentemente, sistemi di approcci basati biologia, hanno rivelato che i vaccini di successo come il vaccino contro la febbre gialla, inducono una forte induzione di risposte immunitarie innate e l'attivazione di diversi sottoinsiemi di cellule dendritiche (DC), che a loro volta, portano a multilineare attivazione di antigene specifiche cellule T 2,3. Dal momento che le DC sono l'unica popolazione di cellule immunitarie con la possibilità di attivare le cellule T naïve antigene-specifiche 4, lo studio della loro funzione durante la vaccinazione è fondamentale per capire le risposte immunitarie ai vaccini e per progettare strategie future contro gli agenti patogeni difficili.
Un sistema che consente di risalire diverse sottopopolazioni PVS durante la risposta immunitaria ai vaccini sarebbe auspicabile, al fine di stabilire un accurato cinetica della migrazione DC a tessuti linfoidi, e quindi quello di fornirecomprensione dei meccanismi fisiologici responsabili per l'avvio di specifici vaccini immunità adattativa. Genetica inversa a base di approcci offrono la possibilità di generare modificato, vaccini vivi attenuati che possono essere utilizzati in via sperimentale con questo scopo. Dal momento della sua attuazione in materia di ricerca di influenza, genetica inversa basata plasmide-è stato ampiamente impiegato per generare ceppi influenzali ricombinanti compreso LAIVs. Protocolli standard per salvare virus influenzali ricombinanti richiedono multi-trasfezione di linee altamente transfectable cellulari con plasmidi ambisense (che producono sia positivi che negativi senso RNA) che contengono i segmenti virali otto influenzali, nonché di amplificazione in un sistema permissiva come Madin-Darby rene canino ( MDCK) cellule e / o di gallina embrionate uova 5. Tuttavia, l'applicazione di genetica inversa per generare strumenti molecolari per studiare i meccanismi immunitari della vaccinazione rimane inesplorato.
La generazionedi nuovi modelli di mouse che permettono specifico esaurimento delle sottopopolazioni di cellule del sistema immunitario, tra cui DC, ha aperto nuove possibilità per comprendere i meccanismi immunitari fondamentali alla base di protezione del vaccino-suscitato. Il confronto tra le funzioni sottoinsieme DC nei topi e nell'uomo ha rivelato che, in larga misura, mouse e DCS umani sono funzionalmente omologhe 6,7, questi risultati, suggeriscono fortemente che lo sviluppo di modelli murini consentendo specifica esaurimento delle DC nello stato stazionario e in condizioni infiammatorie, può servire per capire la fisiologia delle risposte DC nell'uomo. Negli ultimi anni una serie di modelli di topo sono state generate portando transgeni esprimenti il recettore simian tossina difterica (DT) (DTR) sotto il controllo della regione del promotore di un gene di interesse 8,9. Dal momento che i tessuti di topo non naturalmente esprimono DTR, questi modelli consentono esaurimento condizionale di sottoinsiemi di cellule che trasportano il gene targeting di interesse sul inoculazione mouse con DT. Così, il nostro ability ad esaurire DC specifici e altri leucociti in vivo durante i processi fisiologici, è stata notevolmente rafforzata dallo sviluppo di ro-based DTR. Tuttavia, mentre questi modelli di topi transgenici sono stati ampiamente utilizzati per comprendere l'ontogenesi del sistema immunitario, la loro applicazione per lo sviluppo del vaccino è stato appena testato. Qui, combinando l'influenza genetica inversa e competitivi chimere del midollo osseo a base di DTR, proponiamo un metodo per studiare la cinetica di vaccino immunità così come la funzione del gene individuo durante la risposta immunitaria ai vaccini in vivo. L'applicazione di questa tecnologia per la valutazione preclinica di nuovi vaccini contro le malattie infettive difficili potrebbe contribuire a razionalizzare la progettazione di vaccini e per testare vaccini candidati in vivo.
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Protocol
Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo protocolli approvati e seguendo le linee guida della legge sulla protezione degli animali tedesca. Tutto il personale che effettuano esperimenti sugli animali passati programmi di formazione a seconda della categoria B o C della Federazione delle Associazioni scientifiche europee animali da laboratorio.
1. Generazione di ricombinante vivo attenuato Influenza vaccini da Reverse Genetics
NOTA: Il protocollo dettagliato per la generazione di virus influenzali ricombinanti dalla genetica inversa è stata descritta da studi precedenti 5 ed è fuori dal campo di applicazione della presente relazione. In breve, il salvataggio di vaccini antinfluenzali adattate a freddo (CAV) è fatto in un armadio biosicurezza di classe II sotto il livello di biosicurezza 2 (BSL2) contenimento, e prevede passaggi descritti di seguito. Il protocollo di trasfezione e infezioni segue quella Martinez-Sobrido et al. 5.
- Generare un influenzale adattato freddo riassortantivaccino utilizzando come sfondo della adattato fredda ceppo A / Ann Arbor / 6/60 (H2N2), così come l'emoagglutinina (HA) e neuraminidasi modificato (NA) del / PR / 8/34 (H1N1) A ( Figura 1A). La modifica nel gene NA è costituito da un sostituto basato su PCR di una sequenza conservata nel gambo della proteina (residui da 65 a 72) da una breve sequenza di cDNA codificante l'ovalbumina di pollo (OVA) peptide -derived SIINFEKL (Figura 1B). Il peptide SIINFEKL è un peptide altamente immunodominante nel contesto della classe MHC H-2b risposta di topi C57BL / 6 12 I-ristretta.
- Piatto 10 6 293T cellule per pozzetto in 6 pozzetti con DMEM al 10% di siero fetale bovino (FBS) supplementato con 1% di penicillina / streptomicina (P / E).
- Preparare miscela di trasfezione plasmide: Aggiungere 1 ug di ciascuno dei plasmidi codificanti cDNA per PB2, PB1, PA, NP, M, NS dalla influenza A / Ann Arbor / 6/60 ceppo e 1 mg di plasmidi codificanti per la NA -SIINFEKL eHA da influenza A / PR / 8/34. Aggiungere pre-riscaldato OptiMEM (15 microlitri per un volume finale di 100 ul / pozzetto).
- Incubare mix trasfezione per 30 minuti a RT.
- Aggiungere 100 pl di miscela di trasfezione / pozzetto ed incubare per 16 ore a 37 ° C e 5% CO 2.
- Cambiare supporti cella DMEM 0,3% BSA 1% P / E a 33 ° C e 5% CO 2 per 5 ore.
- Aggiungere cellule MDCK permissive 10 6 influenzali in DMSO contenente 1 mg / ml di tripsina da pancreas bovino trattato con L-1-Tosylamide-2-feniletile clorometil chetone (TPCK-tripsina). Mantenere i 293T-MDCK co-culture per 2-3 giorni a 33 ° C e 5% di CO 2.
- Raccogliere surnatanti di cellule co-culture MDCK-293T e chiaro per centrifugazione a 260 g per 5 min.
- Inoculare 9-10 giorni di età uova embrionate di pollo in condizioni sterili. Per fare questo, fare un foro sulla parte superiore del guscio d'uovo, come indicato da Martinez-Sobrido et al. 5.
- Coprire il wit guscio d'uovoh fuso cera con un batuffolo di cotone e incubare le uova di gallina inoculate per 3 giorni a 33 ° C.
- Raccogliere il liquido allantoico dalle uova embrionate infette: Lavare i gusci d'uovo con il 70% di etanolo. Aprire l'uovo con una crepa molto delicatamente nella parte superiore e rimuovere la membrana allantoide con pinza sterile. Utilizzare una pipetta 10 ml di raccogliere quanto più fluido possibile (in genere 6 - 10 ml). Centrifugare a 260 xg per 10 min a 4 ° C e trasferire il fluido eliminato allantoico di nuovi tubi.
Immunità 2. Monitoraggio vaccino specifico
- Tracciare delle cellule dendritiche peptide-cuscinetto (DC)
- Per la vaccinazione del mouse, anestetizzare i topi con il 5% isoflurano in ossigeno utilizzando un vaporizzatore di precisione. Utilizzare una pipetta 200 microlitri di somministrare 50 ml di PBS contenente 10 3 formanti placca unità (PFU) del vaccino esprimere il peptide SIINFEKL attraverso le goccioline direttamente alle narici del mouse.
- Tre giorni dopo la vaccinazione, euthanize topi tramite anestesia isoflurano seguita da dislocazione cervicale.
- Sollevare la pelle del mouse sulla linea mediana appena sotto la gabbia toracica con una pinza e tagliare una piccola incisione attraverso la pelle con le forbici. Dal punto di incisione, rendono un 3 - 5 cm di lunghezza tagliare attraverso la pelle verso la testa e la coda, poi due incisioni 2 cm dalla linea mediana lateralmente da ciascuna estremità. Staccare la pelle a rivelare la cavità peritoneale e toracica. Tagliare con cautela attraverso le membrane che circondano il peritoneo per esporre il torace.
- Per accedere al mediastino tagliare il diaframma e la parte inferiore della gabbia toracica. Individuare e rimuovere 2 linfonodi mediastinici (mln), un po 'dorsale e laterale adiacente al timo, medialmente adiacente alla arteria anonima, nei pressi del lato ventrale della trachea.
- Per raccogliere le mln utilizzano pinze curve. Posizionare pinze sotto i linfonodi e tirare delicatamente. Mettere i linfonodi in un 6-pozzetti contenente 1 ml di DMEM e rimuovere eventuali connective o tessuto adiposo che circonda il nodo.
- Tease bene ogni campione con due aghi 26 G collegati ad 1 ml siringhe. Per stuzzicare il linfonodo, tenere premuto con un ago mentre la rottura del linfonodo con l'altro ago. Quando questo viene fatto correttamente, le cellule concentrate scoppiano dal linfonodo sono facilmente osservati nei media. Passare tutto il materiale tessuto attraverso un filtro di nylon 70 micron per ottenere sospensioni di cellule singole.
- Centrifugare sospensioni di cellule singole per 10 min a 260 xg in una centrifuga refrigerata. Risospendere il pellet di cellule in 2 ml di globuli rossi di lisi (rbcL) Buffer per lisare i globuli rossi. Lasciare lisi di procedere per 3 minuti a temperatura ambiente.
- Neutralizzare tampone rbcL via centrifugazione e risospensione delle cellule in 2 ml di PBS ghiacciato.
- Cellule piastra a forma di U piastre da 96 pozzetti ad una concentrazione di 10 7 cellule / ml in un volume finale di 100 ul.
- Per la citometria a flusso di analisi, Cell Block Fc-recettori con1 mg di anticorpi CD16 / CD32-topo anti per 10 6 cellule per 15 min in ghiaccio.
- Piatti centrifuga e scartano sovranatanti di piatto rapido passaggio. Incubare i pozzetti individuali con la combinazione di anticorpi superficie scelta. Tipicamente per la rilevazione di cellule dendritiche in linfonodi, il cocktail di anticorpi dovrebbe includere: 0,25 pg di anti-CD11c, 0,25 mg di CD11b, 0,5 mg di MHC di classe II, 0,25 mg di CD103 e 0,15 mg di CD8α in un volume finale di 100 ul.
- Per gating negativo, aggiungere 0,25 mg di anti-CD3, CD19, NK1.1 o un lignaggio cocktail (Figura 2A). Strategie di gating alternativi e protocolli per una corretta compensazione di più coloranti fluorescenti sono disponibili sul sito web del Progetto Genoma immunologica. Oltre ai marcatori di superficie di scelta, aggiungere 1 mg di un anticorpo contro H-2K b legato alla SIINFEKL al cocktail. Questo anticorpo disponibile in commercio consente la visualizzazione delle DC in che il peptide SIINFEKL è legato alla superficie MHC di classe I.
- Incubare le cellule con anticorpi di superficie per 30 min in ghiaccio. Proteggere piastra dalla luce. Piastre centrifugare a 260 xg per 5 minuti e lavare con 2 ml di PBS due volte. Trasferire le cellule di citometria a flusso tubi per l'analisi.
- Valutazione del vaccino specifico la proliferazione delle cellule T
- Ottenere cellule T del donatore da disponibile commercialmente topi TCR-transgenici (topi OT-I) (C57BL / 6-Tg (Tcr aTcrb) 1100Mjb / J) in cui tutte le cellule T CD8 generate sono specifiche per il peptide SIINFEKL. Euthanize topi anestesia isoflurano seguita da dislocazione cervicale. Harvest milza effettuando un'incisione nella cavità addominale. Posizionare milza / s in 2 ml di DMEM / milza e rimuovere il tessuto connettivo e grasso.
- Generare sospensioni singola cella di milza seguendo la procedura descritta in 2.1.2 e 2.1.3.
- Per arricchire ulteriormente la sospensione singola cella sulle cellule T, si applicano i protocolli di separazione tallone magneticoutilizzando sia le procedure di selezione positivi o negativi 12. Per differenziare donatore cellule riceventi, utilizzare i topi congenici modo che per esempio topi riceventi esprimono il CD45.1 marcatore leucociti mentre le cellule T del donatore esprimono CD45.2 12.
- Per marcare le cellule T, incubare in 1 ml di PBS contenente 5 mM di carboxyfluorescein ester succinimidil (CFSE) in una densità cellulare ottimale di 5 x 10 6 cellule / ml. Incubare le cellule per 20 min a 37 ° C al riparo dalla esposizione alla luce. Dopo l'incubazione, le cellule centrifugare a 260 xg per 5 minuti, il surnatante scarto, e risospendere le cellule in 3 ml di siero fetale bovino (FBS) per neutralizzare CFSE.
- Cellule centrifugare a 260 xg durante 10 minuti e risospendere nel volume adeguato di PBS in modo che 100 ml di soluzione contiene 2 x 10 6 cellule. Infondere destinatario topi congenici con 2 x 10 6 cellule / topo via retro-orbitale sinusale iniezione 13.
- Euthanize topi riceventi a giorni 3, 4 e 5 postvaccinazione in anestesia isoflurano seguita da dislocazione cervicale. Raccolto linfonodi mediastinici e preparare sospensioni singola cella per citometria a flusso, come indicato in 2.1.2-2.1.5.
- Identificare le cellule del donatore dalla colorazione delle sospensioni di cellule singole a 100 l di un cocktail di anticorpi che contiene: 0,25 mg di anticorpi anti-topo CD3 CD4 e CD8; 0,5 mg di anti-topo CD45.1 o anticorpi CD45.2 (a seconda del fenotipo delle cellule del donatore). Lasciare la FL-1 canale del citometro a flusso aperto (FITC) per determinare il profilo di diluizione di CFSE 12 (Figura 2B).
3. I topi chimerici per sezionare gene-specifica del vaccino Risposte
NOTA: La generazione di concorrenza chimere di midollo osseo utilizzando modelli murini basati DTR permette la discriminazione di funzioni specifiche delle cellule durante la risposta immunitaria ai vaccini. Qui vi mostriamo una strategia aggiuntiva con la quale combinazione di DTR-esprimono donatore cells con celle di permessi topi knockout per studiare specifiche funzioni geniche durante l'immunità in compartimenti cellulari specifici. Nell'esempio generiamo topi con specifico delezione dei recettori toll-like 3 (TLR3) in Langerin + CD103 + DC.
- Preparazione delle cellule del donatore di midollo osseo
- Lavorare sotto un armadietto livello di biosicurezza II. Evitare la contaminazione utilizzando strumenti in autoclave esclusivamente.
- Per generare midollo osseo topi chimerici, utilizzare CD45.1 congenic + C57BL / 6 topi femmina come destinatari, e utilizzare TLR3 - / -, Langerin-DTR / EGFP, o topi WT esprimono CD45.2 + come donatori. Utilizzando topi donatori e riceventi congenici permette la differenziazione delle cellule del donatore e del ricevente via citometria a flusso e questo permette attecchimento da valutare.
- Per ottenere cellule del midollo osseo del donatore, eutanasia topi donatori con anestesia isoflurano seguita da dislocazione cervicale. Con forbici affilate eseguono incisioni intorno alle caviglie in modo che il mmuscolatura ouse è esposto.
- Uso pinze smussato tirare la pelle del mouse e pelliccia delicatamente dalla caviglia verso i fianchi in modo che i muscoli delle gambe sono visibili.
- Con le forbici affilate tagliare le gambe del mouse all'altezza delle anche e sopra la testa del femore.
- Posizionare gambe su una capsula di Petri e su ghiaccio. Lavorare velocemente e rimuovere tutti i muscoli per esporre le ossa.
- Femori e tibie separati. Inserire ossa in una soluzione di etanolo al 70% per 5 minuti per rimuovere eventuali batteri e posto immediatamente su un'altra capsula petri contenente 5 ml di DMEM privo di siero. Tagliare osso finisce con forbici affilate e lavare il midollo osseo nel DMEM. Per fare ciò, filo 1 ml di DMEM nell'osso inserendo un ago 26 G attaccato ad una siringa da 5 ml. Assicurarsi che le ossa sembrano bianco (vuoto) dopo lavaggio.
- Raccogliere tutte le cellule del midollo osseo di topi donatori in 10 ml di DMEM. Generare sospensioni singola cella di cellule del midollo osseo passando il raccolto attraverso un colino cella 70 micron.
- Clorecchio sospensioni di cellule singole di cellule del midollo osseo per centrifugazione a 260 xg per 10 min a 4 ° C in una centrifuga refrigerata. Risospendere pellet cellulare in 10 ml di PBS. Deplezione delle cellule rosse del sangue utilizzando soluzione rbcL come descritto in 2.1.3 e 2.1.4.
- Contare cellule del midollo osseo utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato. Valutare la vitalità cellulare del determinazione delle cellule morte con trypan colorazione blu 13. In modo ottimale, un animale produce singolo di circa 3 x 10 7 globuli bianchi / mouse con una redditività pari ad almeno l'80%.
- In caso di totale chimere del midollo osseo, preparare TLR-3 - cellule o peso del donatore - /. La concentrazione cellulare ottimale è di 2 x 10 7 cellule / ml da 2 x 10 6 cellule in 100 microlitri di PBS saranno utilizzati per il trapianto. Se non utilizzato immediatamente, conservare le cellule del donatore a -80 ° C utilizzando tecniche di congelamento lento e FBS con il 10% DMSO. Per il modello chimerico misto, mescolare le cellule Langerin-DTR-donatori e TLR3 - / -
- Irradiazione del mouse e trapianto
- Irradiare topi femmina tra 6-8 settimane di età in una fonte irradiatore cesio-137. Dare topi due dosi di 550 rad 4 ore di distanza. Split irradiazione minimizza la tossicità epatica acuta e quindi riduce il mouse letalità dovuta al protocollo irradiazione.
- Dopo l'irraggiamento, tenere i topi in trattamento con antibiotici per due settimane. Dare antibiotici con l'acqua potabile a 2,5-5 mg di Baytril / kg.
- Di 2 - 4 ore dopo la seconda irradiazione, topi trapiantati con cellule del midollo osseo del donatore per via endovenosa. Effettuare l'iniezione di cellule del donatore via retro-orbitale sinusale iniezione 13 e sotto anestesia isoflurano utilizzando volume massimo di 100 ml di PBS contenente 2 x 10 6 cellule.
- Quattro settimane dopo il trapianto, valutare attecchimento in un campione di 100ml di sangue periferico tramite citometria a flusso utilizzando una macchina in grado di leggere almeno due colori. Per distinguere tra donatore e cellule riceventi radio resistenti, utilizzare commercialmente disponibile CD45.1 fluorescente e anticorpi anti-topo CD45.2 utilizzando diluizioni tra 1/100 e 1/200. Attecchimento ottimale delle cellule del donatore deve essere almeno l'80% del totale delle cellule ematopoietiche nel sangue periferico.
- La vaccinazione e mirata esaurimento
- Vaccinare i topi con il vaccino antinfluenzale vivo attenuato ricombinante via intranasale. Per la vaccinazione del mouse, anestetizzare i topi con il 5% isoflurano in ossigeno utilizzando un vaporizzatore di precisione. Utilizzare una pipetta 200 microlitri di somministrare 50 ml di PBS contenente 10 3 formanti placca unità (PFU) del vaccino.
- Per generare il modello finale del mouse, trattare i topi con 50 ng di DT diluito in 50 ml di PBS intranasale. Somministrare DT goccia a goccia direttamente alle narici di topi anestetizzati come descritto in 3.3.1. Mi TreatCE con dosi giornaliere che iniziano il trattamento in giorno -2 prima della vaccinazione fino al giorno 2 post-vaccinazione (Figura 3B).
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Representative Results
Generazione di ricombinanti vaccini influenzali vivo attenuato può essere ottenuto mediante trasfezione di plasmidi che codificano le otto segmenti del virus dell'influenza sotto il controllo di promotori bidirezionali 5. Un vaccino influenzale adattato fredda solito contiene sei segmenti di un ceppo adattato fredda, nonché l'HA e NA del ceppo influenzale di scelta (ad esempio, H1N1) (Figura 1A). Il principio di freddo-adattamento si basa sulla replicazione virale limitato a 33 ° C, la temperatura del tratto respiratorio superiore (URT) nei topi e nell'uomo 14. Pertanto, il vaccino può replicare in qualche misura nel URT, ma non può causare la polmonite tratto respiratorio inferiore. Utilizzando fusion tecnologia PCR, una regione conservata nel gambo della neuraminidasi virale (NA), sostituito da un tracciabile peptide OVA-derivato (SIINFEKL) (Figura 1B).
Per tenere traccia delle risposte specifiche vaccino in cinetica studi abbiamo approfittato di peptidi tracciabili derivati dalla formulazione del vaccino, così come i modelli chimerici mouse. Tra il giorno 3 e 6 post-vaccinazione, SIINFEKL fruttiferi CD103 + DC può essere rilevato nella linfa-polmone drenante nodi 12 (Figura 2A). Citometria a flusso multiparametrica consente la quantificazione di presentazione dell'antigene del vaccino-derivato in tempo reale. Inoltre, l'infusione di cellule T specifiche per SIINFEKL permette quantificazione delle risposte delle cellule T CD8 specifici vaccino (Figura 2B).
Per valutare le funzioni specifiche del gene durante la vaccinazione abbiamo ideato un modello di topo che unisce la tecnologia DTR e competitivi chimere del midollo osseo (Figura 3A). In questo modo, la perdita della funzione del gene è stata mirata a compartimenti cellulari specifici nel corso delle risposte immunitarie alla vaccinazione (Figura 3B, C).
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Figura 1. Ingegneria LAIVs tracciabili. (A) segmenti Influenza clonati in plasmidi ambisense (spina dorsale PDZ come descritto da Martinez-Sobrido et al. 5) sono state trasfettate in cellule 293T con Lipofectamine 2000. 24 ore dopo la trasfezione, sovranatanti ottenuti da cellule 293T sono stati utilizzati per Madin-Darby canine di rene (MDCK), le cellule-influenzali permissive cappotto in presenza di 1% di TPCK tripsina. Tutto il protocollo è stato eseguito a 33 ° C. Surnatanti virali da cellule MDCK sono poi stati inoculati in 9 giorni di età uova embrionate di pollo per tre giorni a 33 ° C. Salvataggio virale è stata confermata dalla società amplificazione PCR genoma virale e sequenziamento. (B) Per inserire la SIINFEKL peptide OVA-derivati nella neuraminidasi influenzale (NA), una regione conservata (residui da 65 a 72) del gene NA di A / Puerto / 8/34 (H1N1) Rico è stato sostituito per un breve cDNA codificante il peptide SIINFEKL tramite fusionePCR. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Vaccino tecniche di analisi. (A) migratori dendritiche sono stati recintato nei linfonodi mediastinici (mln) come MHC di classe II cellule CD11c hi med. Nell'esempio, antigene-cuscinetto CD103 migratorio + DC sono stati identificati come CD103 + H-2 b -SIINFEKL + cellule mediante citometria a flusso. (B) OT-I-specifiche cellule T sono stati iniettati a topi nello stesso giorno della vaccinazione. Quattro giorni dopo, le cellule sono state raccolte dai linfonodi di topi vaccinati e valutati per il loro profilo di proliferazione. Diluizione CFSE sul canale FL-1 è stato utilizzato come indicatore della divisione cellulare. CAV: vaccino freddo adattato; CAV SIINFEKL :. Vaccino freddo adattato esprime OVA-derived peptide SIINFEKL Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. studi di funzione genica. (A) Schema di chimere midollo osseo (BMC) e strategie di vaccinazione. (-2 E +2 riferiscono alla somministrazione di DT, due giorni prima o dopo la vaccinazione). (B) Aggiunta di DT nei topi chimerici esprimenti Langerin-DTR permette specifici esaurimento delle migratorio Langerin + DC coexpressing CD103 nel polmone. (C) comparativo analisi delle cellule T specifiche per il vaccino nei topi chimerici. Rilevazione di NP 366-374 specifico d'cellule T CD8 è stato fatto via commerciale colorazione dextramer.803fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo studio viene descritto come la genetica e modelli di mouse chimerici inversa può essere utilizzata per chiarire i meccanismi fisiologici e molecolari dell'immunità indotta dal vaccino. Influenza genetica inversa è stabilito in molti laboratori e ha svolto un ruolo principale nella comprensione patogenesi dell'influenza, la replica, e la trasmissione 17. Un punto chiave nel nostro protocollo è il salvataggio di vaccini antinfluenzali adattate freddo esprimono epitopi stranieri. Mentre la strategia di introdurre brevi cDNAs sul fusto della neuraminidasi è stato descritto da molti gruppi, l'investigatore deve garantire che mutazioni addizionali vengono introdotti durante la produzione del vaccino in uova e che il vaccino è in grado di replicare nel tratto respiratorio senza indurre polmonite 5,12. Poiché sia il fusto della neuraminidasi virale e altre regioni del genoma dell'influenza come segmento gene NS e il segmento PB1 consente l'assegnazione di sequenze estere 19,20, modificazioni della nostra protocollo può essere utilizzata per aggiungere peptidi esteri supplementari, per esempio, comprendere le gerarchie della risposta immunitaria delle cellule T contro il virus dell'influenza, un punto chiave per la progettazione razionale dei vaccini.
Combinando vaccini tracciabili e deplezione-based DTR di sottoinsiemi DC siamo stati in grado di perdita di funzione del gene per sottopopolazioni cellulari specifiche fissato. Questa tecnologia è stata applicata prima di chiarire la risposta immunitaria agli agenti patogeni 21, ma non di sezionare pathways responsabili della protezione del vaccino. Grazie alla disponibilità di modelli basati DTR e la flessibilità della tecnica per generare topi chimerici, questa tecnica può essere ulteriormente esteso a popolazioni leucocitarie aggiuntive e geni con funzioni immunitarie. È importante notare che il trattamento DT può anche provocare deplezione di ulteriori sottoinsiemi DC esprimenti Langerin come CD8α + DC nei tessuti linfoidi. Pertanto si consiglia vivamente di perform uno studio di dose-risposta per valutare gli effetti del trattamento DT. Un potenziale avvertimento del nostro modello è che il trapianto di midollo osseo allogenico ha dimostrato di diminuire antivirale globale CD8 T immunità cellulo 15. Quindi, cautela deve essere esercitata quando si confrontano i dati tra topi trapiantati e non trapiantati.
Diversi agenti patogeni umani fondamentali che sono urgentemente necessari vaccini possono essere studiati in modelli murini con wild-type agenti patogeni o surrogati del mouse. Questi includono virus dell'influenza, Plasmodium, e il virus Ebola. Le tecniche proposte in questo studio possono aiutare a comprendere il meccanismo di base di vaccini sperimentali contro questi agenti patogeni e quindi, per razionalizzare la progettazione di vaccini.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM 1x) | Gibco RL-Life Technologies | 41965-039 | |
| OptiMEM | Gibco RL-Life Technologies | 31985-047 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen-Life Technologies | 11668-027 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | PAA | p11-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Embryonated eggs | Valo biomedia Gmbh | ||
| PBS (1x) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 70 μM Nylon Filters | Greiner-Biorad | 542-070 | |
| Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10x | BD Bioscience | 555899 | |
| CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2) | BD Pharmigen | 553142 | |
| APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16) | Biolegend | 141605 | |
| PE-Anti-mouse CD11c (HLA3) | BD Biosciences | 553802 | |
| eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2) | eBioscience | 48-5321-82 | |
| Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70) | Biolegend | 101216 | |
| PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7) | Biolegend | 121416 | |
| PE-Anti-mouse CD45.1 (A20) | eBioscience | 12-0453-82 | |
| V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4) | BD Bioscience | 562130 | |
| PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7) | eBioscience | 46-0081-80 | |
| APC-Cy7-Anti-mouse CD3ε (145-2611) | Biolegend | 100325 | |
| eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5) | eBioscience | 48-0041-80 | |
| CFSE Proliferation dye | eBioscience | 65-0850-85 | |
| Baytril 2.5% | Bayer | 65-0850-85 | |
| Dymethil-Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Ovalbumin | Molecular probes | O23020 | |
| Diphteria Toxin (DT) | Sigma-Aldrich | D0564 | |
| Trypsin-TPCK | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| BD FACsCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo cell analysis software 9.5 | Flowjo inc. | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life technologies | T10282 | |
| Countess Automatic Cell Counter | Invitrogen-Life Technologies | C10227 |
References
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