إدارة الأنف المؤتلف لقاحات الأنفلونزا في همي ماوس نماذج لدراسة الأغشية المخاطية الحصانة
Summary
There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.
Abstract
Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies.
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.
Introduction
توليد ذاكرة مناعية في غياب المرض هو الأساس الفسيولوجي للتطعيم فعال 1. في الآونة الأخيرة، كشفت أنظمة النهج القائم على الأحياء أن اللقاحات الناجحة مثل لقاح الحمى الصفراء، لحث على تحريض قوي من الاستجابات المناعية الفطرية وتفعيل عدة مجموعات فرعية من الخلايا الجذعية (DCS)، والذي بدوره يؤدي إلى multilineage تفعيل antigen- خلايا T معينة 2،3. منذ البلدان النامية هي السكان الخلايا المناعية الوحيد مع القدرة على تنشيط خلايا T ساذجة مستضد معين 4، ودراسة وظيفتها خلال التطعيم أمر بالغ الأهمية لفهم الاستجابات المناعية للقاحات وتصميم الاستراتيجيات المستقبلية ضد مسببات الأمراض الصعبة.
ومن شأن نظام يسمح بتعقب مجموعات فرعية البلدان النامية مختلفة خلال الاستجابات المناعية للقاحات يكون مرغوبا فيه من أجل إنشاء حركية دقيقة من العاصمة الهجرة إلى الأنسجة اللمفاوية، وبالتالي توفيرنظرة ثاقبة الآليات الفسيولوجية المسؤولة عن بدء محدد اللقاح مناعة التكيفية. علم الوراثة العكسية القائم على النهج توفر إمكانية لتوليد المعدلة واللقاحات الحية الموهنة التي يمكن استخدامها تجريبيا مع هذا الغرض. منذ تنفيذه على البحث الإنفلونزا، واستخدمت على نطاق واسع الوراثة العكسية القائم على البلازميد لتوليد سلالات الأنفلونزا المؤتلف بما في ذلك LAIVs. بروتوكولات موحدة لانقاذ فيروسات الأنفلونزا المؤتلف تتطلب متعددة ترنسفكأيشن خطوط transfectable غاية الخلية مع البلازميدات ambisense (المنتجة على حد سواء الإيجابية والسلبية RNA معنى) التي تحتوي على شرائح الفيروسية ثمانية الأنفلونزا وكذلك التضخيم في نظام متساهل مثل مدين، داربي الكلى الكلاب ( MDCK) الخلايا و / أو الدجاج المحتوي البيض 5. ومع ذلك، فإن تطبيق علم الوراثة العكسية لتوليد الأدوات الجزيئية لدراسة الآليات المناعية للقاح لا تزال غير مستكشفة.
الجيلمن نماذج الماوس جديدة تسمح نضوب معين من مجموعات فرعية الخلايا المناعية، بما في ذلك البلدان النامية، وفتحت آفاقا جديدة لفهم الآليات المناعية الأساسية الكامنة وراء حماية أثار اللقاح. وكشفت المقارنة بين وظائف فرعية DC لدى الفئران والبشر ذلك، إلى حد كبير، والماوس والبلدان النامية الإنسان وظيفيا مثلي 6،7، هذه النتائج، بقوة توحي بأن تطوير نماذج الماوس تسمح نضوب معين من البلدان النامية في حالة مستقرة وخلال حالات الالتهابات، قد تساعد على فهم علم وظائف الأعضاء من ردود DC في البشر. في السنوات الأخيرة تم إنشاء عدد من نماذج الماوس تحمل الجينات المحورة التعبير عن القردي ذيفان الخناق (DT) مستقبلات (DTR) تحت سيطرة منطقة المروج من الجينات في المصالح 8،9. منذ الأنسجة الماوس لا تعبر بطبيعة الحال DTR، وهذه النماذج تسمح استنزاف المشروط لمجموعات فرعية الخلايا التي تحمل الجينات المستهدفة من الفائدة على التلقيح الفأر مع DT. وبالتالي، عبيلي لديناتي واي لاستنزاف البلدان النامية المحددة والكريات البيض الأخرى في الجسم الحي أثناء العمليات الفسيولوجية، قد تعززت بشكل كبير من خلال تطوير ريال عماني على أساس DTR. ومع ذلك، في حين تم استخدام هذه نماذج الماوس المعدلة وراثيا على نطاق واسع لفهم تطور الجنين من الجهاز المناعي، وتطبيقها على تطوير لقاح تم اختبار نادرا. هنا، من خلال الجمع بين الانفلونزا الوراثة العكسية وتنافسية الوهم نخاع العظام أساس DTR، نقترح طريقة لدراسة حركية مناعة لقاح فضلا عن وظيفة الجينات الفردية خلال الاستجابات المناعية للقاحات في الجسم الحي. تطبيق هذه التقنية لتقييم ما قبل السريرية لقاحات جديدة ضد الأمراض المعدية الصعبة يمكن أن تساعد في ترشيد تصميم لقاح واختبار لقاحات مرشحة في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة وصفنا كيف علم الوراثة ونماذج الماوس خيالية العكس يمكن استخدامها لتوضيح الآليات الفسيولوجية والجزيئية للحصانة التي يسببها اللقاح. تم تأسيس علم الوراثة عكس الإنفلونزا في العديد من المختبرات ولعبت دورا كبير في فهم المرضية الإنفلونزا، والنسخ، ونقل 17….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Sergio Gómez-Medina for excellent technical support with mouse experiments. This work was supported by funds from the Leibniz Association and the Leibniz Center of Infection. A.L. is a recipient of a pre-doctoral fellowship from the Leibniz Graduate School.
Materials
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM 1X) | Gibco RL-Life Technologies | 41965-039 | |
| Opti MEM | Gibco RL-Life Technologies | 31985-047 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen-Life Technologies | 11668-027 | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | PAA | p11-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Embryonated eggs | Valo biomedia Gmbh | ||
| PBS (1X) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 70 μM Nylon Filters | Greiner-Biorad | 542-070 | |
| Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10X | BD Bioscience | 555899 | |
| CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2) | BD Pharmigen | 553142 | |
| APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16) | Biolegend | 141605 | |
| PE-Anti-mouse CD11c (HLA3) | BD Biosciences | 553802 | |
| eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2) | eBioscience | 48-5321-82 | |
| Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70) | Biolegend | 101216 | |
| PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7) | Biolegend | 121416 | |
| PE-Anti-mouse CD45.1 (A20) | eBioscience | 12-0453-82 | |
| V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4) | BD Bioscience | 562130 | |
| PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7) | eBioscience | 46-0081-80 | |
| APC-Cy7-Anti-mouse CD3ε (145-2611) | Biolegend | 100325 | |
| eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5) | eBioscience | 48-0041-80 | |
| CFSE Proliferation dye | eBioscience | 65-0850-85 | |
| Baytril 2.5% | Bayer | 65-0850-85 | |
| Dymethil-Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Ovalbumin | Molecular probes | O23020 | |
| Diphteria Toxin (DT) | Sigma-Aldrich | D0564 | |
| Trypsin-TPCK | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| BD FACsCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo cell analysis software 9.5 | Flowjo inc. | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life technologies | T10282 | |
| Countess Automatic Cell Counter | Invitrogen-Life Technologies | C10227 |
References
- Bevan, M. J. Understand memory, design better vaccines. Nat. Immunol. 12, 463-465 (2011).
- Gaucher, D. Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses. J. Exp. Med. 205, 3119-3131 (2008).
- Querec, T. D. Systems biology approach predicts immunogenicity of the yellow fever vaccine in humans. Nat. Immunol. 10, 116-125 (2009).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. 3, (2010).
- Haniffa, M. Human Tissues Contain CD141hi Cross-Presenting Dendritic Cells with Functional Homology to Mouse CD103+ Nonlymphoid Dendritic Cells. Immunity. 37, 60-73 (2012).
- Haniffa, M., Collin, M., Ginhoux, F. Ontogeny and functional specialization of dendritic cells in human and mouse. Adv. Immunol. 120, 1-49 (2013).
- Jung, S. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17, 211-220 (2011).
- Lahl, K., Sparwasser, T. In vivo depletion of FoxP3+ Tregs using the DEREG mouse model. Methods Mol. Biol. 17, 211-220 (2011).
- Duffield, J. S. Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair. J. Clin. Invest. 115, 56-65 (2005).
- Meredith, M. M. Expression of the zinc finger transcription factor zDC. J. Exp. Med. 209, 1153-1165 (2012).
- Girón, J. V. Mucosal Polyinosinic-Polycytidylic Acid Improves Protection Elicited by Replicating Influenza Vaccines via Enhanced Dendritic Cell Function and T Cell Immunity. J. Immunol. 193, 1324-1332 (2014).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. bib.usb.ve. , (1983).
- Cox, R. J., Brokstad, K. A., Ogra, P. Influenza virus: immunity and vaccination strategies. Comparison of the immune response to inactivated and live, attenuated influenza vaccines. Scand. J. Immunol. 59, 1-15 (2004).
- Gowdy, K. M. Impaired CD8(+) T cell immunity after allogeneic bone marrow transplantation leads to persistent and severe respiratory viral infection. Transpl. Immunol. 32, 51-60 (2015).
