Introduction
Трансфекция нуклеиновых кислот в клетках имеет разнообразный применение в научных исследованиях. Примеры включают в себя (1) гены репортер изучить роль различных элементов гена в экспрессии генов, (2) экспрессии белка плазмиды что экспрессия белка интерес, и (3) малых интерферирующих РНК подавляют экспрессию генов. Путем манипулирования уровня экспрессии отдельных генов и измерения перепада эффект таких манипуляций, исследователи могут вывести генные функции в выбранных биологических системах. Не все методы трансфекции обеспечивают те же эффективности трансфекции, и даже тот же метод трансфекции не трансфекции клеток всех типов в равной степени 1. Следовательно, различные методы трансфекции были разработаны такие как фосфат кальция методом, DEAE декстран, катионный липид трансфекции катионным, без липидов полимерной трансфекции, электропорации, и nucleofection 2,3.
Трансфекции в макрофагов ESPEбенно трудно из-за того, что макрофаги профессиональные фагоциты, которые очень чувствительны к посторонних материалов, включая бактерии, полученных (метилированный) ДНК 4. Введение чужеродной ДНК активирует Toll-подобный рецептор 9 (TLR9) путь, ведущий к продукции цитокинов и азотной окиси 5,6. Эти активированные макрофаги могут затем быть менее чувствителен к лечению, что исследователи намерены изучить.
Наша лаборатория постоянно transfects в RAW264.7 линию макрофагов клеток с люциферазных генов-репортеров, и мы разработали протокол, который достаточно прочный, чтобы люциферазы сигнал значительно выше, чем фон, но и достаточно мягкий для макрофагов оставаться на их состоянии покоя. Поведение трансфицированных клеток оценивали с помощью светлячка-репортерного гена люциферазы, несущим промоторную область IκBζ (pGL3- IκBζ). Выражение IκBζ активируется бактериальной компонента клеточной стенки губыopolyssacharide (ЛПС) 7,8, и подавляется в противовоспалительного цитокина, интерлейкин-10 (ИЛ-10) 8. Для учета изменения трансфекции среди скважин, мы сотрудничаем трансфекции управления плазмиды, содержащей ген люциферазы Renilla (например, phRL-TK) для целей нормализации. Протокол, описанный оптимизирован после тестирования различных параметров, включая сроки трансфекции, типа реагентов трансфекции, количества реагентов трансфекции и плазмидной ДНК, а также соотношение реагента для трансфекции плазмидной ДНК. Два трансфекции реагенты, включенные в этот протокол: (1) на основе липидов трансфекции реагента и (2) белок / полиамин на основе реагента для трансфекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Очистка плазмидной ДНК
- Извлечение ДНК плазмиды с использованием набора maxiprep в соответствии с протоколом производителя. Ресуспендируют плазмидной ДНК в 500 мкл ТЕ-буфера.
- Выполните фенол: хлороформ: изоамиловый спиртовой экстракции и изопропанол осадков для удаления остаточных загрязняющих веществ бактериальных. Наличие LPS препятствует трансфекции 9.
- Добавить 500 мкл фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (25: 24: 1, рН 8) с плазмидной ДНК и энергично встряхивают в течение 15 сек. Фенол вызывает ожоги кожи и обезболивающее, так ожоги не всегда чувствовал, пока не серьезный ущерб. Выполните фенол: извлечение изоамиловый в вытяжном шкафу и соблюдайте осторожность: хлороформ.
- Выдержите смесь в течение 5 мин при комнатной температуре. Центрифуга при 13000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Передача 350 мкл верхней водной фазы в новую 1,5 мл пробирку.
- Добавить 350 мкл ТЕ-буфера в пробирку, которая содержит нижнюю органическую фазу, Встряхивать в течение 15 сек. Центрифуга при 13000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Передача 350 мкл верхней водной фазы в той же 1,5 мл пробирку.
- Добавить 70 мкл 3 М ацетата натрия (рН 5,2) и хорошо перемешать. Добавить 700 мкл 100% изопропанола. Все хорошо перемешать и инкубировать 10 мин при комнатной температуре. Центрифуга при 13000 мкг в течение 10 MiNaT 4 ° C. Удалить супернатант.
- Добавить 500 мкл 75% этанола в гранулах. Образцы перемешивают, чтобы смешивать и центрифуге при 5000 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант. ДНК в осадке.
- Открыть крышку пробирки и просушить на воздухе осадок при КТ в течение 5 - 10 мин. Осадок должен стать прозрачным. Добавить 500 мкл ТЕ-буфера для ресуспендирования осадка ДНК. Нагревают при 50 - 60 ° С в течение 10 мин, чтобы растворить осадок ДНК.
- Измеряют поглощение при 260 нм (А260) и 280 нм (А280) с помощью спектрометра. Рассчитать концентрацию ДНК путем умножения значения A260 от 50 нг / мкл. Оценить качество ДНК calculatinг отношение А260 / А280. ДНК с высоким качеством должен дать соотношение A260 / A280 1,8 - 2,0.
2. культивирования клеток и посев
- Культура RAW264.7 клетки в DMEM с добавлением 9% фетальной телячьей сыворотки (DMEM / 9% FCS) в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе. Во время каждого прохода, открепления клеток от пластины непрерывным отбором с использованием пипетки Пастера. Прохождение клетки каждые 2 дня, и семя 1,5 - 2 миллионов клеток на 10 см для культуры ткани, обработанной блюдо как акции. Оттепель новый запас клеток каждые 5 - 6 недель.
- В день трансфекции, семена 200000 клеток на лунку в 24-луночного планшета в объеме 500 мкл DMEM / 9% FCS. Инкубируйте клетки в течение 4 ч в 37 ° C инкубаторе.
- Трансфекции клетки либо с липидной основе реагента (шаг 3.1) или белок / полиамин на основе реагента (шаг 3.2).
3. Трансфекция
- На основе липидов трансфекции:
- Разминка трансфекции ReageNт до комнатной температуры в темноте. Разминка бессывороточной среды DMEM и / 9% ФТС до 37 ° C.
- Добавить 0,5 мкг плазмидной ДНК в 50 мкл бессывороточной среды в 1,5 мл пробирку. Добавьте 2 мкл реагента для трансфекции с кончика пипетки ниже поверхности жидкости. Вихрь в течение 6 сек.
- Оставьте смесь реагентов / ДНК в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Во время 30-минутной инкубации, извлеките носитель из колодца и добавить 250 мкл свежей DMEM / 9% FCS в каждую лунку.
- Через 30 мин добавляют 250 мкл DMEM / 9% FCS к смеси реагент / ДНК. Все хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз.
- Добавить 300 мкл разбавленной смеси в каждую лунку. Выдержите в течение 2 - 4 часов в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе.
- Удалить трансфекции решение и добавить 500 мкл DMEM / 9% FCS. Инкубировать в течение 24 - 48 ч в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе до стимуляции клеток.
- Белок / полиамин на основе трансфекции:
- Разминка бессывороточнаясредний и DMEM / 9% FCS до 37 ° С.
- Добавить 0,75 мкл реагента для трансфекции 18,75 мкл бессывороточной среды. Кратко Vortex перемешать. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Добавить 0,5 мкл 1 мкг / мкл ДНК в разбавленном трансфицированных реагента. Инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин.
- В 10-минутной инкубации, удалить носитель из каждой лунки 24-луночного планшета и добавить 250 мкл свежей DMEM / 9% FCS в каждую лунку.
- Через 10 мин добавляют 250 мкл DMEM / 9% FCS в смеси реагентов / ДНК.
- Добавить 270 мкл разбавленной смеси в скважине. Выдержите в 37 ° С и 5% СО 2 инкубатора для 2 - 4 ч.
- Удалить трансфекции решение и добавить 500 мкл DMEM / 9% FCS. Выдержите в течение 24 - 48 часов в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе.
4. Стимулирование и сотовый анализа люциферазы
- Замените СМИ в хорошо 250 мкл свежей DMEM / 9% FCS.
- Добавить 50 мкл LPS LPS или IL +-10 В требуемых концентрациях до колодца. Возвращение пластины в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе. Стимулируют для 2 - 6 ч.
- Удалить стимуляции решение стремлением, промыть холодной ледяной PBS и добавьте 200 мкл 1x Пассивный лизирующего буфера. Rock при комнатной температуре в течение 30 мин. Собрать и передачи лизат в 1,5 мл пробирки и удалить клеточного дебриса путем центрифугирования при 20000 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
- Передача 40 мкл очищенного лизата (надосадочной) в белом, прозрачным дном 96-луночного планшета для определения люциферазы сигналов в соответствии с протоколом производителя.
- Читайте люциферазы сигнал с люминометре по всей видимом спектре света.
5. Анализ данных
- Рассчитывают соотношение светлячка: Renilla путем деления отдельные значения люциферазы светлячка значениями Renilla люциферазы из каждой лунки.
- Рассчитайте изменение раза путем деления светлячка: Renilla соотношение лечить хорошочто необработанной скважины.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 сравнивает эффективность трансфекции двух реагентов трансфекции в RAW264.7. На основе липидов реагент обычно дает около 25%, а скорость трансфекции белка / полиамин на основе трансфекции в результате около 5% эффективности (фиг.1А). Разница в эффективности трансфекции наблюдалось также в люциферазы сигналов в RAW264.7 клеток, трансфицированных pGL3-IκBζ промотора репортера (Фиг.1В). Добавление ЛПС в этих трансфицированных клеток увеличивается люциферазы светляков сигнал, прямое указание повышенной транскрипционной активности промотора репортер IκBζ. Другими словами, результаты показали, что ЛПС активируется экспрессию гена IκBζ, в соответствии с предыдущими сообщениями 7,8. Рисунок 2 показывает типичные результаты, полученные в экспериментах с использованием липидной основе трансфекции в качестве примера. После получения индивидуальных значений сигналов от фиrefly люциферазы и люциферазы Renilla (2А и 2В), Светлячок люциферазы сигналы были нормированы на Renilla люциферазы сигнала (рис 2С). Нормализация рекомендуется из-за хорошо к скважине изменения в эффективности трансфекции. Чтобы определить, если условия обработки (ЛПС или ЛПС + IL-10) изменили репортер сигналы, светлячков: соотношение Renilla (т.е., нормированные сигналы) между группами лечения были по сравнению с необработанной (нестимулированной) образца (рис 2D ). Наши данные показали, что лечение RAW264.7 клетки с LPS активируется активность промотора репортера pGL3-IκBζ, указывая, что ЛПС повышает уровень транскрипции гена IκBζ. В присутствии IL-10, промотор репортера IκBζ имел низкую активность, предполагая, что IL-10 обладает способностью ингибировать ЛПС-индуцированную транскрипцию гена IκBζ. Белок / полиамин на основе трансфекции, как правило,дали более низкие значения в обоих люциферазы светлячка и люциферазы Renilla сигналов. Рисунок 3 сравнивает продолжительность времени отдыха между трансфекции и стимуляции (24 ч или 48 ч), и показывает, что люциферазы сигналы со временем уменьшается. Уменьшение сигнала не мешали при интерпретации данных на основе липидов трансфекции реагента был использован (фиг.3А); индукции под действием ЛПС и путем ингибирования IL-10 все еще наблюдалось после 48 ч отдыха. Тем не менее, уменьшение сигнала было более значительным, когда белок / полиамин на основе реагента для трансфекции использовали (3В), особенно люциферазы Renilla сигналы. В результате, разница между группами лечения не наблюдалось после 48 ч отдыха.
Один нежелательный эффект трансфекции является гибель клеток, так оценивали влияние каждого метода трансфекции по степени апоптоза. Клетки трансфицировали, или нет, и подвергали аннексина-V и пропидийиодидом (PI)окрашивание. Лизаты получают из этих клеток были также проанализированы на наличие интактного и расщепленного поли АДФ-рибоза полимераза (PARP) белка. Проточной цитометрии анализ / PI окрашенных клеток аннексина-V предположил, что на основе липидов трансфекции несколько увеличилась доля положительных клеток аннексина-V по сравнению с нетрансфицированными клеток, в то время как белок / полиамин на основе трансфекции не так (4А) , Аналогичным образом, на основе липидов трансфицировали несколько увеличилась доля расщепляется PARP, а белок / полиамин на основе трансфекции не так (4В). Тем не менее, несмотря на повышенные количества апоптотических клеток, морфология клеток с помощью световой микроскопии не изменилась (фиг.4С). Что еще более важно, биологический ответ на основе липидов трансфекции клеток оставались идентичны тем, которые из нетрансфицированных клеток (рис 4D). Клетки стимулировали LPS ± IL-10, и суммами, ФНО ^5; выделенный в культуральную надосадочную жидкость количественно с помощью ELISA. Оба нетрансфицированные и на основе липидов трансфекции клеток из аналогичных количеств TNF, в ответ на ЛПС и тормозились добавлением IL10. Нет ФНО не было сделано, когда клетки не были стимулированы (рис 4D) предполагая, что клетки оставались наивным после трансфекции.
Рисунок 1. липидной основе трансфекции дал высокую эффективность трансфекции, чем белок / полиаминов на основе трансфекции. () RAW264.7 трансфекции клеток в GFP-экспрессирующих плазмиды либо с липидной основе или трансфекции реагентов белка / полиамин основе. GFP сигнал измеряли с помощью проточной цитометрии через 24 часа. (B) RAW264.7 клетки трансфицировали промоторной репортера pGL3-IkBζ. После 48 ч отдыха, грлоктей стимулировали LPS в течение 6 ч. Светлячок люциферазы сигнал измеряется в соответствии с инструкциями изготовителя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Типичные данные анализа люциферазы. RAW264.7 клетки трансфицировали TK-Renilla и IkBζ промотора репортера. Через 24 часа отдыха, клетки стимулировали LPS ± IL-10 в течение 2 часов. (А) люциферазы светлячка и (б) Renilla люциферазы сигналы были измерены в соответствии с инструкциями для анализа люциферазы производителя. (С) Репортер деятельность нормализовалась к сигналу ТК-Renilla и построены как отношение Светлячок / Renilla. (D) Сложите изменения рассчитывается путем деленияСветлячок:. Отношение Renilla из стимулированных образцов тем, что в образце нестимулированной Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Сила сигнала люциферазы зависит от времени. (A) на основе липидов трансфицировали и (б) Белок / полиамин на основе трансфицированные клетки покоилась на либо 24 ч или 48 ч до стимуляции LPS ± ИЛ-10 в течение 2 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный здесь, не только сосредоточиться на эффективности трансфекции, но стремится найти баланс между эффективностью и сохранения физиологических состояний клеток. В частности, наша процедура удается свести к минимуму токсичность трансфекции реагента и максимизации люциферазы сигнал.
Один важный шаг в протоколе это здоровье клеток. Заросли культуры не подходят для трансфекции как их изменения физиологии и непрерывного культивирования клеток RAW264.7 в течение длительного периода времени может также изменить фенотип и функции клеток 10. Свежий размороженные клетки, которые имеют низкое число проход рекомендуется использовать для трансфекции.
Еще одним важным фактором является выбор реагентов трансфекции. На основе липидов трансфекции реагенты, как правило, используются в научных исследованиях из-за его простоты использования и коммерческой доступности. Тем не менее, некоторые из этих реагентов вызвало unintendeд (и, как правило, нежелательные) изменения в глобальной экспрессии генов в трансфицированных клеток 11,12. Чтобы решить эту проблему, клетки инкубируют только с реагентов трансфекции в течение нескольких часов вместо типичного O / N, или реагент не липидной основе выбирается для трансфекции. Более длительное время инкубации с реагента для трансфекции повысит эффективность трансфекции, но он также может быть вредным для клеток либо вызывает гибель клеток или активации клеток, оба из которых может вмешиваться в экспериментальной конструкции. Фиг.4А и 4В показывают, что белок / polyamine- на основе трансфекции не вызывать апоптоз или некроз, по сравнению с нетрансфицированными клеток. На основе липидов трансфекции, даже при коротком времени инкубации, вызвало высокий уровень гибели клеток. Это коррелирует с более высокой эффективности трансфекции липидного основе реагента для трансфекции. Однако, когда трансфицированные клетки наблюдали под микроскопом, не было заметным морфологическое изменениес (рис 4C). Активированные макрофаги обычно принимают расползание форму, но оба нетрансфицированные и трансфицированные клетки не показывают признаков активации до стимуляции, указывая, что они были в их покоя государств. Кроме того, трансфицированные клетки ответили аналогично ЛПС и IL-10 стимуляции как нетрансфецированной клеток (рис 4D). Эти наблюдения показывают, что в совокупности эта процедура трансфекции не изменяет естественное поведение клеток.
Время между трансфекции и экспериментального лечения (времени отдыха) также имеет решающее значение. Достаточно времени должно быть дано за люциферазы генов выражать и для клеток по восстановлению их состояние покоя; Однако, длинный инкубационный может уменьшить люциферазы сигналы, особенно когда эффективность трансфекции не является высокой.
Процедура здесь относится к конкретному репортерного гена люциферазы, используемой в нашей лаборатории. Незначительные корректировки будет урожденнаяДед, когда используется другой репортер. Параметры, которые должны быть проверены, включают различное люциферазы светляков репортер: соотношение люциферазы Renilla, остальное время между трансфекции и лечения, а также условий обработки. 50: 1 соотношение pGL3-IκBζ: phRL-ТК, как правило, используется, но отношение может составлять от 1: 1 до 100: 1. Было установлено, что 24 ч отдыха между удалением трансфекции раствора от клеток и начала экспериментального лечения дает наилучший сигнал. После 48 часов, люциферазные сигналы начали снижаться, и различия между группами лечения были снижены или даже отменены.
Описанная процедура трансфекции не ограничивается репортера люциферазы анализов. Другие экспериментальные проекты, которые не нуждаются в однородную популяцию будет на пользу; например, флуоресцентной микроскопии, которая опирается на наблюдения из отдельных клеток. Один недостаток будет местонахождение успешно трансфицированных клеток среди нетрансфицированных коллегами, ноПреимущества быть меньше времени и трудоемким может быть более лучшего. В случаях, когда предпочтительными стабильными клеточные линии, наш протокол обеспечивает среднее для первых экспериментов, в которых экспериментальная процедура может быть оптимизированы, когда генерируются устойчивые клеточные линии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Life Technologies | K210007 | Any maxiprep kit will work |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Life Technologies | 15593-049 | Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container. |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30396.03 | Inactivated at 56 °C water bath for 45 min before use. |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Warm to at least room temperature before use. |
| XtremeGene HP DBA transfection reagent | Roche | 6366236001 | Warm to room temperature before use. |
| GeneJuice | EMD Millipore | 70967 | Warm to room temperature before use. |
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E1941 | 30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 |
References
- Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10 (1), 9-18 (2010).
- Thompson, C. D., Frazier-Jessen, M. R., Rawat, R., Nordan, R. P., Brown, R. T. Evaluation of methods for transient transfection of a murine macrophage cell line RAW 264.7. Biotechniques. 27 (4), 824-835 (1999).
- Kim, T., Eberwine, J. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Stacey, K. J., Sweet, M. J., Hume, D. A. Macrophages ingest and are activated by bacterial DNA. Journal of immunology. 157 (5), 2116-2122 (1996).
- Jiang, W., Reich, I. C., Pisetsky, D. S. Mechanisms of activation of the RAW264.7 macrophage cell line by transfected mammalian DNA. Cell Immunol. 229 (1), 31-42 (2004).
- Jiang, W., Pisetsky, D. S. The induction of HMGB1 release from RAW 264.7 cells by transfected DNA. Mol Immunol. 45 (7), 2038-2046 (2008).
- Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-147 (2009).
- Cheung, S. T., So, E. Y., Chang, D., Ming-Lum, A., Mui, A. L. Interleukin-10 inhibits lipopolysaccharide induced miR-155 precursor stability and maturation. PLoS One. 8 (8), e71336 (2013).
- Weber, M., Moller, K., Welzeck, M., Schorr, J. Short technical reports. Effects of lipopolysaccharide on transfection efficiency in eukaryotic cells. Biotechniques. 19 (6), 930-940 (1995).
- Berghaus, L. J., et al. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 33 (5), 443-456 (2000).
- Fiszer-Kierzkowska, A., et al. Liposome-based DNA carriers may induce cellular stress response and change gene expression pattern in transfected cells. BMC Mol Biol. 12 (1), 27-36 (2011).
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (7), 617-626 (2009).
