Introduction
कोशिकाओं में न्यूक्लिक एसिड की अभिकर्मक वैज्ञानिक अनुसंधान के क्षेत्र में एक विविध आवेदन किया है। उदाहरण (1) रिपोर्टर जीन, जीन अभिव्यक्ति में जीन के विभिन्न तत्वों की भूमिका का अध्ययन करने के लिए (2) प्रोटीन अभिव्यक्ति plasmids ब्याज की प्रोटीन overexpress करने के लिए, और (3) छोटे आरएनए हस्तक्षेप जीन अभिव्यक्ति downregulate के लिए शामिल हैं। विशेष जीनों की अभिव्यक्ति के स्तर से छेड़छाड़ और इस तरह के जोड़तोड़ का अंतर प्रभाव को मापने के द्वारा, शोधकर्ताओं चुना जैविक प्रणालियों में जीन कार्यों परिणाम निकालना कर सकते हैं। नहीं सभी अभिकर्मक तरीकों एक ही अभिकर्मक क्षमता प्रदान करते हैं, और यहां तक कि एक ही अभिकर्मक विधि समान रूप से 1 सभी प्रकार की कोशिकाओं transfect नहीं करता है। इसलिए, अलग अभिकर्मक तरीकों कैल्शियम फॉस्फेट विधि, DEAE dextran, cationic लिपिड अभिकर्मक, cationic गैर लिपिड बहुलक अभिकर्मक, इलेक्ट्रोपोरेशन, और nucleofection 2,3 के रूप में इस तरह विकसित किया गया है।
मैक्रोफेज में अभिकर्मक खासकर हैखासकर मुश्किल की वजह से मैक्रोफेज (methylated) डीएनए 4 व्युत्पन्न बैक्टीरिया सहित विदेशी माल के लिए बहुत संवेदनशील होते हैं कि पेशेवर फ़ैगोसाइट तथ्य यह है कि करने के लिए। विदेशी डीएनए का परिचय साइटोकिन्स और नाइट्रिक ऑक्साइड 5,6 के उत्पादन के लिए अग्रणी टोल की तरह रिसेप्टर 9 (TLR9) मार्ग को सक्रिय करता है। ये सक्रिय मैक्रोफेज तो शोधकर्ताओं की जांच करने का इरादा है कि इलाज के लिए कम जिम्मेदार हो सकता है।
हमारी प्रयोगशाला नियमित luciferase संवाददाता जीन के साथ RAW264.7 बृहतभक्षककोशिका सेल लाइन transfects, और हम पृष्ठभूमि की तुलना में काफी अधिक luciferase संकेत करने के लिए पर्याप्त मजबूत है कि एक प्रोटोकॉल विकसित की है, लेकिन मैक्रोफेज उनके आराम की स्थिति में रहने के लिए पर्याप्त भी कोमल है। ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के व्यवहार IκBζ (pGL3- IκBζ) के प्रमोटर क्षेत्र को शरण देने के एक जुगनू-luciferase संवाददाता जीन द्वारा मूल्यांकन किया गया। IκBζ अभिव्यक्ति बैक्टीरिया कोशिका दीवार घटक होंठ से upregulated हैopolyssacharide (एलपीएस) 7,8, और विरोधी भड़काऊ साइटोकाइन द्वारा downregulated, इंटरल्युकिन 10 (आईएल -10) 8। कुओं के बीच अभिकर्मक विभिन्नता के लिए खाते में करने के लिए, हम सामान्य बनाने के उद्देश्य के लिए Renilla luciferase जीन (जैसे, phRL-टी) युक्त नियंत्रण प्लाज्मिड transfect सह। वर्णित प्रोटोकॉल डीएनए प्लाज्मिड के लिए विभिन्न अभिकर्मक के समय, अभिकर्मक अभिकर्मकों के प्रकार, अभिकर्मक अभिकर्मकों और प्लास्मिड डीएनए की मात्रा सहित पैरामीटर, साथ ही अभिकर्मक अभिकर्मक के अनुपात के परीक्षण के बाद अनुकूलित है। इस प्रोटोकॉल में शामिल दो अभिकर्मक अभिकर्मकों (1) एक लिपिड आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक और (2) एक प्रोटीन / polyamine आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक हैं।
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Protocol
1. प्लास्मिड डीएनए शुद्धि
- निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक maxiprep किट का उपयोग प्लास्मिड डीएनए निकालें। ते बफर के 500 μl में Resuspend प्लास्मिड डीएनए।
- क्लोरोफॉर्म: एक फिनोल प्रदर्शन करना isoamyl शराब निकासी और isopropanol तेज़ी अवशिष्ट जीवाणु दूषित पदार्थों को दूर करने के लिए। एलपीएस की उपस्थिति अभिकर्मक 9 के साथ हस्तक्षेप।
- प्लास्मिड डीएनए (1, पीएच 8 25: 24) और 15 सेकंड के लिए सख्ती से हिला isoamyl शराब: क्लोरोफॉर्म: फिनोल के 500 μl जोड़ें। Phenol गंभीर त्वचा जलने का कारण बनता है और गंभीर क्षति है जब तक जलता हमेशा महसूस नहीं कर रहे हैं तो एक संवेदनाहारी है। धूआं हुड में isoamyl निष्कर्षण और सावधानी का उपयोग करें: क्लोरोफॉर्म: फिनोल प्रदर्शन करते हैं।
- आरटी पर 5 मिनट के लिए मिश्रण को सेते हैं। आरटी पर 10 मिनट के लिए 13,000 XG पर अपकेंद्रित्र। एक नया 1.5 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में ऊपरी जलीय चरण के 350 μl स्थानांतरण।
- कम जैविक चरण में शामिल है कि ट्यूब ते बफर के 350 μl जोड़ें। 15 सेकंड के लिए सख्ती से हिला। आरटी पर 5 मिनट के लिए 13,000 XG पर अपकेंद्रित्र। एक ही 1.5 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब करने के लिए ऊपरी जलीय चरण के 350 μl स्थानांतरण।
- 3 एम सोडियम एसीटेट (पीएच 5.2) के 70 μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से। 100% isopropanol के 700 μl जोड़ें। अच्छी तरह मिक्स और आरटी पर 10 मिनट के लिए सेते हैं। 10 minat 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 13,000 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें।
- गोली के लिए 75% इथेनॉल के 500 μl जोड़ें। भंवर नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 5000 XG पर मिश्रण और अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें। डीएनए गोली में है।
- ट्यूब की टोपी खोलें और हवा 5 के लिए आरटी पर गोली सूखी - 10 मिनट। गोली पारदर्शी बन जाना चाहिए। डीएनए गोली resuspend करने के लिए ते बफर के 500 μl जोड़ें। 50 पर गर्मी - 10 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस डीएनए गोली भंग करने के लिए।
- 260 एनएम (A260) और एक स्पेक्ट्रोमीटर के साथ 280 एनएम (A280) में absorbance के उपाय। 50 एनजी / μl द्वारा A260 मूल्य गुणा करके डीएनए की एकाग्रता की गणना। Calculatin द्वारा डीएनए की गुणवत्ता का आकलनजी A260 / A280 अनुपात। 2.0 - उच्च गुणवत्ता के साथ डीएनए 1.8 की एक A260 / A280 अनुपात देना चाहिए।
2. सेल संवर्धन और सीडिंग
- DMEM में संस्कृति RAW264.7 कोशिकाओं को एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 9% भ्रूण बछड़ा सीरम (DMEM / 9% एफसीएस) के साथ पूरक। प्रत्येक पारित होने के दौरान, एक पाश्चर विंदुक का उपयोग निरंतर pipetting द्वारा थाली से कोशिकाओं को अलग। बीतने कोशिकाओं हर 2 दिन, और 1.5 बीज - स्टॉक के रूप में एक 10 सेमी टिशू कल्चर इलाज किया डिश पर 2 लाख कोशिकाओं। 6 सप्ताह - कोशिकाओं को हर 5 में से एक नया स्टॉक गला लें।
- अभिकर्मक के दिन पर, DMEM / 9% एफसीएस के 500 μl की एक मात्रा में एक 24 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति 200,000 कोशिकाओं बीज। 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 4 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
- Transfect कोशिकाओं या तो लिपिड आधारित अभिकर्मक (3.1 कदम) या प्रोटीन / polyamine आधारित अभिकर्मक (3.2 कदम) के साथ।
3. अभिकर्मक
- लिपिड आधारित अभिकर्मक:
- अभिकर्मक reagen गरमटी अंधेरे में आरटी के लिए। सीरम मुक्त मध्यम और DMEM / 9% एफसीएस के लिए 37 डिग्री सेल्सियस गर्म।
- एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में सीरम मुक्त माध्यम से प्लास्मिड डीएनए के 0.5 माइक्रोग्राम से 50 μl जोड़ें। तरल की सतह के नीचे विंदुक टिप के साथ अभिकर्मक अभिकर्मक के 2 μl जोड़ें। 6 सेकंड के लिए भंवर।
- 30 मिनट के लिए आरटी पर अंधेरे में अभिकर्मक / डीएनए मिश्रण छोड़ दें।
- 30 मिनट ऊष्मायन के दौरान, अच्छी तरह से मीडिया को दूर करने और प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए ताजा DMEM / 9% एफसीएस के 250 μl जोड़ें।
- 30 मिनट के बाद, अभिकर्मक / डीएनए मिश्रण करने के लिए DMEM / 9% एफसीएस के 250 μl जोड़ें। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
- प्रत्येक अच्छी तरह से पतला मिश्रण के 300 μl जोड़ें। एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 4 घंटे - 2 के लिए सेते हैं।
- अभिकर्मक समाधान निकालें और DMEM / 9% एफसीएस के 500 μl जोड़ें। सेल उत्तेजना से पहले एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 48 घंटा - 24 के लिए सेते हैं।
- प्रोटीन / polyamine आधारित अभिकर्मक:
- वार्म अप सीरम मुक्तमध्यम और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए DMEM / 9% एफसीएस।
- सीरम मुक्त माध्यम से 18.75 μl अभिकर्मक अभिकर्मक के 0.75 μl जोड़ें। भंवर संक्षेप में मिश्रण करने के लिए। 5 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। पतला ट्रांसफ़ेक्ट अभिकर्मक में 1 माइक्रोग्राम / μl डीएनए के 0.5 μl जोड़ें। 10 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
- 10 मिनट ऊष्मायन के दौरान, 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से मीडिया को दूर करने और प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 250 μl ताजा DMEM / 9% एफसीएस जोड़ें।
- 10 मिनट के बाद, अभिकर्मक / डीएनए मिश्रण में DMEM / 9% एफसीएस के 250 μl जोड़ें।
- अच्छी तरह से करने के लिए पतला मिश्रण के 270 μl जोड़ें। 4 घंटा - 2 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में सेते हैं।
- अभिकर्मक समाधान निकालें और DMEM / 9% एफसीएस के 500 μl जोड़ें। एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 48 घंटा - 24 के लिए सेते हैं।
4. सेल उत्तेजना और luciferase परख
- ताजा DMEM / 9% एफसीएस के साथ अच्छी तरह से 250 μl में मीडिया की जगह।
- 50 एलपीएस की μl या एलपीएस + आईएल जोड़ेंअच्छी तरह से करने के लिए वांछित सांद्रता में -10। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर करने के लिए थाली लौटें। 6 घंटा - 2 के लिए उत्तेजित।
- आकांक्षा द्वारा उत्तेजना समाधान निकालें बर्फ ठंड पीबीएस के साथ धोने, और 1x निष्क्रिय lysis बफर के 200 μl जोड़ें। 30 मिनट के लिए आरटी पर रॉक। परिमार्जन और 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए lysate हस्तांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 20,000 XG पर centrifuging द्वारा सेल मलबे को हटा दें।
- स्थानांतरण निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार luciferase संकेतों के निर्धारण के लिए एक सफेद, स्पष्ट नीचे 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए मंजूरी दे दी lysate (सतह पर तैरनेवाला) के 40 μl।
- पूरे दृश्य प्रकाश स्पेक्ट्रम भर में एक luminometer साथ luciferase संकेत पढ़ें।
5. डेटा विश्लेषण
- प्रत्येक अच्छी तरह से Renilla luciferase के मूल्यों से जुगनू luciferase की व्यक्तिगत मूल्यों को विभाजित करके Renilla अनुपात: जुगनू की गणना।
- द्वारा अच्छी तरह से इलाज के Renilla अनुपात: जुगनू विभाजित करके गुना परिवर्तन की गणनाअनुपचारित अच्छी तरह से की है।
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Representative Results
चित्रा 1 RAW264.7 में दो अभिकर्मक अभिकर्मकों के अभिकर्मक दक्षता तुलना करती है। प्रोटीन / polyamine आधारित अभिकर्मक के बारे में 5% दक्षता (चित्रा 1 ए) में हुई, जबकि लिपिड आधारित अभिकर्मक आमतौर पर के बारे में 25% अभिकर्मक दर दे दी है। अभिकर्मक दक्षता में अंतर भी pGL3-IκBζ प्रमोटर रिपोर्टर (चित्रा 1 बी) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट RAW264.7 कोशिकाओं में luciferase संकेतों में मनाया गया। इन कोशिकाओं को एलपीएस की वृद्धि जुगनू luciferase संकेत, IκBζ प्रमोटर रिपोर्टर की वृद्धि की प्रतिलेखन गतिविधि का एक सीधा संकेत वृद्धि हुई है। दूसरे शब्दों में, परिणाम एलपीएस पिछली रिपोर्टों 7,8 के साथ संगत IκBζ जीन की अभिव्यक्ति upregulated का सुझाव दिया। 2 हमारे प्रयोगों में प्राप्त ठेठ परिणामों से पता चलता है, एक उदाहरण के रूप में लिपिड आधारित अभिकर्मक का उपयोग कर। फाई से अलग-अलग संकेत मान प्राप्त करने के बादrefly luciferase और Renilla luciferase (आंकड़े 2A और 2 बी), जुगनू luciferase संकेतों Renilla luciferase संकेत (चित्रा -2) के लिए सामान्यीकृत थे। सामान्यीकरण की वजह से अभिकर्मक दक्षता में अच्छी तरह से करने के लिए अच्छी तरह से बदलाव के लिए सिफारिश की है। उपचार की स्थिति (एलपीएस या एलपीएस + आईएल 10) जुगनू संवाददाता का संकेत है, बदल दिया, तो यह निर्धारित करने के लिए: Renilla अनुपात (यानी, सामान्यीकृत संकेतों) उपचार समूहों की अनुपचारित (unstimulated) नमूना (चित्रा 2 डी के साथ तुलना की गई )। हमारे डेटा LPS के साथ इलाज RAW264.7 कोशिकाओं एलपीएस IκBζ जीन के प्रतिलेखन के स्तर में वृद्धि का संकेत है कि pGL3-IκBζ प्रमोटर रिपोर्टर की गतिविधि upregulated दिखाया। आईएल 10 की उपस्थिति में, IκBζ प्रमोटर संवाददाता आईएल -10 IκBζ जीन की एलपीएस प्रेरित प्रतिलेखन को बाधित करने में सक्षम था, सुझाव है कि कम गतिविधि के लिए किया था। प्रोटीन / polyamine आधारित अभिकर्मक आमतौर परजुगनू luciferase और Renilla luciferase संकेतों दोनों में कम मूल्यों दे दी है। 3 अभिकर्मक और उत्तेजना (24 घंटा या 48 घंटा) के बीच बाकी समय की लंबाई तुलना, और luciferase संकेतों समय के साथ कम किया है कि पता चलता है। लिपिड आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक (चित्रा 3) का इस्तेमाल किया गया था जब संकेत में कमी डेटा व्याख्या के साथ हस्तक्षेप नहीं किया; आईएल -10 से LPS और निषेध से प्रेरण अभी भी बाकी के 48 घंटे के बाद मनाया गया। प्रोटीन / polyamine आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक, (3B चित्रा) विशेष रूप से Renilla luciferase संकेतों का इस्तेमाल किया गया था, फिर भी, जब संकेत में कमी और अधिक महत्वपूर्ण था। नतीजतन, उपचार समूहों के बीच का अंतर एक 48 घंटा आराम के बाद नहीं मनाया गया।
एपोप्टोसिस की डिग्री पर प्रत्येक अभिकर्मक विधि के प्रभाव का आकलन किया गया था ताकि अभिकर्मक से एक अवांछित प्रभाव कोशिका मृत्यु है। कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट, या नहीं, और Annexin-वी और propidium आयोडाइड के अधीन थे (पीआई)धुंधला हो जाना। इन कोशिकाओं से तैयार lysates भी बरकरार है और cleaved पाली ADP राइबोज़ पोलीमर्स (PARP) प्रोटीन की उपस्थिति के लिए विश्लेषण किया गया। Annexin वी / पीआई दाग कोशिकाओं के प्रवाह cytometric विश्लेषण untransfected कोशिकाओं की तुलना में प्रोटीन / polyamine आधारित अभिकर्मक (चित्रा -4 ए) नहीं किया था, जबकि लिपिड आधारित अभिकर्मक थोड़ा Annexin-वी पॉजिटिव कोशिकाओं के अनुपात में वृद्धि हुई सुझाव दिया है कि । इसी तरह, प्रोटीन / polyamine आधारित अभिकर्मक (चित्रा 4 बी) नहीं किया था, जबकि cleaved PARP के अनुपात में वृद्धि हुई थोड़ा ट्रांसफ़ेक्ट लिपिड आधारित। हालांकि, apoptotic कोशिकाओं का ऊंचा संख्या के बावजूद, प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिकाओं की आकृति विज्ञान (चित्रा 4C) बदलाव नहीं किया। इससे भी महत्वपूर्ण बात, लिपिड आधारित ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के जैविक प्रतिक्रिया untransfected कोशिकाओं (चित्रा 4D) के लोगों को समान बना रहा। कोशिकाओं ^ आईएल 10 ± LPs, और टीएनऍफ़ की मात्रा के साथ प्रेरित किया गया5; संस्कृति सतह पर तैरनेवाला में स्रावित एलिसा द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया। दोनों untransfected और लिपिड आधारित ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं एलपीएस के जवाब में TNFα के समान मात्रा में किया जाता है और IL10 के अलावा द्वारा हिचकते थे। कोशिकाओं को उत्तेजित नहीं कर रहे थे जब कोई TNFα बनाया गया था (चित्रा 4D) कोशिकाओं अभिकर्मक के बाद भोले बने सुझाव है कि।
लिपिड आधारित अभिकर्मक 1. चित्रा प्रोटीन / polyamine आधारित अभिकर्मक से अधिक अभिकर्मक दक्षता दे दी है। (ए) RAW264.7 कोशिकाओं या तो लिपिड आधारित या प्रोटीन / polyamine आधारित अभिकर्मक अभिकर्मकों के साथ एक GFP व्यक्त प्लाज्मिड ट्रांसफ़ेक्ट गया। GFP संकेत cytometry के 24 घंटे के बाद प्रवाह द्वारा मापा गया था। (बी) RAW264.7 कोशिकाओं pGL3-IkBζ प्रमोटर पत्रकार के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। 48 घंटा बाकी है, ग के बादएल 6 घंटे के लिए LPS के साथ प्रेरित किया गया। जुगनू luciferase संकेत निर्माता के निर्देशों के अनुसार मापा गया था। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. ठेठ luciferase परख डेटा। RAW264.7 कोशिकाओं टी-Renilla और IkBζ प्रमोटर पत्रकार के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। 24 घंटा आराम के बाद, कोशिकाओं को 2 घंटे के लिए आईएल 10 ± LPS के साथ प्रेरित किया गया। (ए) जुगनू luciferase और (बी) Renilla luciferase संकेतों luciferase परख निर्माता के निर्देशों के अनुसार मापा गया। (सी) रिपोर्टर गतिविधि टी-Renilla संकेत के लिए सामान्यीकृत था और जुगनू / Renilla अनुपात के रूप में साजिश रची है। (डी) परिवर्तन मोड़ो विभाजित करके गणना की हैजुगनू:। unstimulated नमूना के उस से प्रेरित नमूनों की Renilla अनुपात में यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Luciferase सिग्नल की शक्ति चित्रा 3. समय पर निर्भर है। (ए) लिपिड आधारित ट्रांसफ़ेक्ट और (बी) प्रोटीन / polyamine आधारित ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के लिए विश्राम किया गया 24 घंटे या 48 घंटे पूर्व आईएल 10 ± LPS के साथ उत्तेजना के लिए या तो 2 घंटे के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
प्रोटोकॉल केवल अभिकर्मक दक्षता पर ध्यान केंद्रित नहीं करता यहाँ वर्णित है, लेकिन कोशिकाओं के शारीरिक राज्यों की क्षमता और संरक्षण के बीच एक संतुलन कायम करना है। विशेष रूप से, हमारे प्रक्रिया अभिकर्मक अभिकर्मक की विषाक्तता को कम करने और luciferase संकेत को अधिकतम करने में सफल होता है।
प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम कोशिकाओं के स्वास्थ्य की है। ऊंचा हो गया संस्कृतियों उनके शरीर क्रिया विज्ञान में परिवर्तन, और यह भी 10 कोशिकाओं के phenotype और समारोह बदल सकते हैं समय की एक लंबी अवधि के लिए RAW264.7 कोशिकाओं की निरंतर संवर्धन के रूप में अभिकर्मक के लिए उपयुक्त नहीं हैं। एक कम बीतने संख्या है कि हौसले thawed कोशिकाओं अभिकर्मक के लिए उपयोग करने के लिए सिफारिश की है।
एक अन्य महत्वपूर्ण विचार अभिकर्मक अभिकर्मकों की पसंद है। लिपिड आधारित अभिकर्मक अभिकर्मकों कारण आम तौर पर इस्तेमाल करते हैं और वाणिज्यिक उपलब्धता के अपने आसानी के लिए अनुसंधान में इस्तेमाल कर रहे हैं। हालांकि, इन अभिकर्मकों के कुछ unintende का कारणडी (और आमतौर पर अवांछित) ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं 11,12 में वैश्विक जीन अभिव्यक्ति में बदल जाता है। इस समस्या का समाधान करने के लिए, कोशिकाओं केवल बजाय ठेठ हे / एन के कुछ ही घंटों के लिए अभिकर्मक अभिकर्मकों के साथ incubated रहे हैं, या एक गैर लिपिड आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक के लिए चुना जाता है। अभिकर्मक अभिकर्मक के साथ अब ऊष्मायन समय अभिकर्मक दक्षता में वृद्धि होगी, लेकिन यह भी प्रायोगिक डिजाइन के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, जो दोनों के कोशिका मृत्यु या सेल सक्रियण, जिससे कोशिकाओं या तो के लिए हानिकारक हो सकता है। प्रोटीन / polyamine- कि -4 ए और 4 बी शो आंकड़े आधारित अभिकर्मक untransfected कोशिकाओं की तुलना में apoptosis या परिगलन का कारण नहीं था। लिपिड आधारित अभिकर्मक, यहां तक कि छोटी ऊष्मायन समय के साथ, कोशिका मृत्यु के उच्च स्तर के कारण होता है। यह लिपिड आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक के उच्च अभिकर्मक दक्षता के लिए सहसंबद्ध है। ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं खुर्दबीन के नीचे मनाया गया हालांकि, जब कोई उल्लेखनीय रूपात्मक बदलाव नहीं थेएस (चित्रा 4C)। सक्रिय मैक्रोफेज आमतौर पर एक विशाल आकार को अपनाने, लेकिन दोनों untransfected और ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं वे उनके आराम राज्यों में थे यह दर्शाता है कि उत्तेजना के लिए पहले सक्रियण के लक्षण नहीं दिखा था। इसके अलावा, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं untransfected कोशिकाओं (चित्रा 4D) के रूप में LPS और आईएल -10 उत्तेजना को इसी तरह से प्रतिक्रिया व्यक्त की। इन टिप्पणियों को सामूहिक रूप से इस अभिकर्मक प्रक्रिया कोशिकाओं 'प्राकृतिक व्यवहार में परिवर्तन नहीं होता है कि संकेत मिलता है।
अभिकर्मक और प्रयोगात्मक उपचार (आराम का समय) के बीच का समय भी महत्वपूर्ण है। बहुत हो गया समय व्यक्त करने के लिए luciferase जीन के लिए और उनके आराम की स्थिति को फिर से स्थापित करने की कोशिकाओं के लिए दिए जाने की जरूरत; हालांकि, एक लंबे ऊष्मायन अभिकर्मक दक्षता उच्च नहीं है, खासकर जब luciferase संकेतों को कम कर सकते हैं।
यहाँ की प्रक्रिया हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता विशिष्ट luciferase संवाददाता जीन करने के लिए लागू होता है। मामूली समायोजन nee के लिए किया जाएगाded एक अन्य संवाददाता इस्तेमाल किया जाता है। Renilla luciferase अनुपात, अभिकर्मक और उपचार, और उपचार की स्थिति के बीच बाकी समय: परीक्षण करने की आवश्यकता है कि पैरामीटर अलग जुगनू luciferase संवाददाता शामिल हैं। एक 50: pGL3-IκBζ का अनुपात 1: phRL-टी आम तौर पर प्रयोग किया जाता है, लेकिन अनुपात 1 से लेकर कर सकते हैं: 1: 1 से 100। यह कोशिकाओं से अभिकर्मक समाधान के हटाने और प्रयोगात्मक उपचार के शुरू के बीच एक 24 घंटा बाकी सबसे अच्छा संकेत दे दिया है कि पाया गया था। 48 घंटे के बाद, luciferase संकेतों गिरते शुरू कर दिया है, और उपचार समूहों के बीच मतभेद कम या भी समाप्त कर दिया गया।
वर्णित अभिकर्मक प्रक्रिया luciferase संवाददाता assays के लिए सीमित नहीं है। एक समरूप जनसंख्या की जरूरत नहीं है कि अन्य प्रयोगात्मक डिजाइन लाभान्वित किया जाएगा; उदाहरण के लिए, व्यक्ति की कोशिकाओं से टिप्पणियों पर निर्भर करता है जो फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के लिए। एक नुकसान यह untransfected समकक्षों के बीच सफलतापूर्वक ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं का पता लगाने के लिए किया जाएगा, लेकिनकम समय लेने वाली और श्रम प्रधान और अधिक वांछित हो सकता होने के लाभों। स्थिर सेल लाइनों पसंद कर रहे हैं, जहां मामलों में, हमारे प्रोटोकॉल स्थिर सेल लाइनों उत्पन्न किया जा रहा है जब प्रयोगात्मक प्रक्रिया अनुकूलित किया जा सकता है, जिसमें प्रारंभिक प्रयोगों के लिए एक मतलब प्रदान करता है।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Life Technologies | K210007 | Any maxiprep kit will work |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Life Technologies | 15593-049 | Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container. |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30396.03 | Inactivated at 56 °C water bath for 45 min before use. |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Warm to at least room temperature before use. |
| XtremeGene HP DBA transfection reagent | Roche | 6366236001 | Warm to room temperature before use. |
| GeneJuice | EMD Millipore | 70967 | Warm to room temperature before use. |
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E1941 | 30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 |
References
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