Introduction
細胞中の核酸のトランスフェクションは、科学研究における多様な用途を有します。例としては、遺伝子発現をダウンレギュレートする遺伝子発現の異なる遺伝子エレメントの役割を研究するために、（2）タンパク質発現プラスミドを、目的のタンパク質を過剰発現し、（3）低分子干渉RNA（1）レポーター遺伝子を含みます。特定の遺伝子の発現レベルを操作すると、そのような操作の差動効果を測定することによって、研究者は、選択された生物学的系における遺伝子の機能を推定することができます。必ずしもすべてのトランスフェクション方法は、同じトランスフェクション効率を提供し、さらに同一のトランスフェクション法は、1に等しく、すべての細胞型をトランスフェクトしません。従って、異なるトランスフェクション方法は、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン、カチオン性脂質トランスフェクション、カチオン性非脂質性ポリマートランスフェクション、エレクトロポレーション、およびヌクレオ2,3として開発されてきました。
マクロファージへのトランスフェクションはESPEですによるマクロファージが（メチル化）DNA 4由来の細菌を含む異物に非常に敏感であるプロの食細胞であるという事実にインターネット上の下記URLで難しいです。外来DNAの導入は、サイトカインおよび一酸化窒素5,6の産生をもたらすToll様受容体9（TLR9）経路を活性化します。これらの活性化マクロファージはその後、研究者が検討する予定治療にあまり応答することができます。
私たちの研究室では、日常的に、ルシフェラーゼレポーター遺伝子とのRAW264.7マクロファージ細胞株をトランスフェクトし、我々は、バックグラウンドよりも有意に高いルシフェラーゼシグナルを有するのに十分な堅牢であるプロトコルを開発するだけでなく、それらの休止状態のままにするマクロファージのための十分な穏やかいます。トランスフェクトされた細胞の挙動をIκBζ（pGL3-IκBζ）のプロモーター領域を保有するホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子で評価しました。 IκBζ発現は、細菌の細胞壁成分のリップによってアップレギュレートされますopolyssacharide（LPS）7,8、および抗炎症性サイトカインによって下方制御、インターロイキン10（IL-10）8。井戸の中で、トランスフェクションの変動を考慮するために、我々は、正規化のためにウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子（ 例えば、phRL-TK）を含む対照プラスミドを同時トランスフェクト。記述されたプロトコルは、トランスフェクションのタイミング、トランスフェクション試薬の種類、トランスフェクション試薬のプラスミドDNAの量、ならびにプラスミドDNAのトランスフェクション試薬の比を含む種々のパラメータをテストした後に最適化されます。このプロトコルに含まれる2つのトランスフェクション試薬（1）脂質ベースのトランスフェクション試薬と、（2）タンパク質/ポリアミン系トランスフェクション試薬です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.プラスミドDNA精製
- 製造業者のプロトコルに従ってマキシプレップキットを用いてプラスミドDNAを抽出します。 TE緩衝液500μl中に再懸濁プラスミドDNA。
- クロロホルム：フェノールを実行イソアミルアルコール抽出およびイソプロパノール沈殿残留細菌の汚染物質を除去します。 LPSの存在は、トランスフェクション9に干渉する。
- プラスミドDNAを、15秒間激しく振る：クロロホルム：イソアミルアルコール（1、pHが8〜25：24）500μlのフェノールを加えます。フェノールは重篤な皮膚の薬傷の原因となり、重大な損傷があるまで火傷を常に感じていないように麻酔薬です。クロロホルム：フェノール行うドラフト中イソアミル抽出をし、注意してください。
- RTで5分間混合物をインキュベートします。室温で10分間、13,000×gで遠心分離します。新しい1.5 mlのコレクションチューブに上部の水相の350μlのを転送します。
- 下の有機相を含むチューブにTE緩衝液350μlのを追加。 15秒間激しく振ります。室温で5分間、13,000×gで遠心分離します。同じ1.5ミリリットルのコレクションチューブに上層の水相の350μlのを転送します。
- 3M酢酸ナトリウム（pH5.2）の70μLを加え、よく混ぜます。 100％イソプロパノール700μlのを追加します。よく混ぜ、室温で10分間インキュベートします。 10 minat 4℃で13,000×gで遠心分離します。上清を取り除きます。
- ペレットに75％エタノールを500μlを追加します。ボルテックスのサンプルを4℃で5分間、5,000×gで混合し、遠心分離します。上清を取り除きます。 DNAはペレットです。
- チューブの蓋を開け、空気が5室温でペレットを乾燥さ - 10分。ペレットは半透明になるはずです。 DNAペレットを再懸濁するためにTE緩衝液500μlのを追加します。 DNAペレットを溶解する10分間60℃ - 50で加熱。
- 分光計で260 nmの（A260）および280nm（A280）での吸光度を測定します。 50 ng /μLでによってA260の値を乗算することにより、DNAの濃度を計算します。 calculatinによるDNAの品質を評価G A260 / A280比。 2.0 - 高品質のDNAが1.8のA260 / A280比を与える必要があります。
2.細胞培養と播種
- DMEM中で培養RAW264.7細胞を、37℃、5％CO 2インキュベーター中で9％ウシ胎仔血清（DMEM / 9％FCS）を補充しました。各通過の間に、パスツールピペットを用いて連続ピペットでプレートから細胞を剥離。継代細胞2日ごと、および1.5シード - ストックとして10cmの組織培養処理皿に2万個の細胞を。 6週間 - すべての5個の新株を解凍します。
- トランスフェクションの日に、DMEM / 9％FCSの500μlの容量で24ウェルプレートにウェル当たり200,000細胞を播種します。 37℃のインキュベーター内で4時間、細胞をインキュベートします。
- いずれかの脂質ベースの試薬（ステップ3.1）、またはタンパク質/ポリアミン系試薬（ステップ3.2）で細胞をトランスフェクト。
3.トランスフェクション
- 脂質ベースのトランスフェクション：
- トランスフェクションreagenウォームアップ暗所でRTに対するT。 37°Cまでの無血清培地およびDMEM / 9％FCSをウォームアップ。
- 1.5mlチューブに無血清培地のプラスミドDNA0.5μgの50μlを添加します。液体の表面下のピペットチップでトランスフェクション試薬の2μlを添加します。 6秒間ボルテックス。
- 室温で30分間、暗所での試薬/ DNA混合物を残します。
- 30分間のインキュベーションの間、ウェルから培地を除去し、各ウェルに新鮮なDMEM / 9％FCSの250μlを添加します。
- 30分後、試薬/ DNA混合物にDMEM / 9％FCSの250μlを添加します。ピペッティングによりよく混ぜます。
- 各ウェルに希釈した混合物の300μlを添加します。 37℃、5％CO 2インキュベーター内で4時間2 -インキュベートします。
- トランスフェクション溶液を除去し、DMEM / 9％FCSの500μlを添加します。細胞刺激の前に37℃、5％CO 2インキュベーター内で48時間- 24インキュベートします。
- タンパク質/ポリアミンベースのトランスフェクション：
- ウォームアップ無血清培地と37℃のDMEMは/ 9％FCS。
- 無血清培地の18.75μlにトランスフェクション試薬の0.75μlを添加します。渦は簡単に混合します。室温で5分間インキュベートします。希釈されたトランスフェクトされた試薬に1μgの/μlのDNAの0.5μlを添加します。室温で10分間インキュベートします。
- 10分間のインキュベーションの間、24ウェルプレートの各ウェルから培地を除去し、各ウェルに250μlの新鮮なDMEM / 9％FCSを加えます。
- 10分後、試薬/ DNA混合物にDMEM / 9％FCSの250μlを添加します。
- ウェルに希釈した混合物の270μlを添加します。 4時間2 - 37℃、5％CO 2インキュベーター中でインキュベートします。
- トランスフェクション溶液を除去し、DMEM / 9％FCSの500μlを添加します。 37℃、5％CO 2インキュベーター中で48時間- 24インキュベートします。
4.細胞の刺激とルシフェラーゼアッセイ
- 新鮮なDMEM / 9％FCS250μlのとよく内のメディアを交換してください。
- LPSまたはLPS + ILの50μLを追加ウェルに所望の濃度で-10。 37℃、5％CO 2のインキュベーターにプレートを返します。 6時間 - 2のために刺激します。
- 、吸引により刺激溶液を除去し、氷冷PBSで洗浄し、1×受動溶解緩衝液200μlを添加します。室温で30分間ロック。スクレイプ1.5 mlチューブに溶解物を移し、4℃で10分間20,000×gで遠心分離することにより細胞残屑を除去します。
- 製造業者のプロトコルに従って、ルシフェラーゼシグナルの決意は白、透明底の96ウェルプレートへの転送清澄化ライセート（上清）の40μlのを。
- 全可視光スペクトル全体のルミノメーターでルシフェラーゼシグナルを読みます。
5.データ解析
- 各ウェルからのウミシイタケルシフェラーゼの値でホタルルシフェラーゼの個々の値を分割してウミシイタケ比：ホタルを計算します。
- によって十分に治療のウミシイタケ比：ホタルを分割して倍の変化を計算未処理ウェルのこと。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
図1は、RAW264.7における2つのトランスフェクション試薬のトランスフェクション効率を比較します。タンパク質/ポリアミンベースのトランスフェクションは、約5％の効率（ 図1A）をもたらした脂質ベースの試薬 は、典型的には約25％のトランスフェクション率を与えました。トランスフェクション効率の差ものpGL3-IκBζプロモーターレポーター（ 図1B）でトランスフェクトされたRAW264.7細胞におけるルシフェラーゼシグナルが観察されました。これらのトランスフェクト細胞へのLPSの添加は、ホタルルシフェラーゼシグナル、IκBζプロモーターレポーターの増加転写活性の直接的な指標を増加させました。言い換えれば、この結果はLPSが以前の報告と一致7,8、IκBζ遺伝子の発現をアップレギュレートすることが示唆された。 図2は、典型的な結果は、一例として、脂質ベースのトランスフェクションを使用して、我々の実験で得られ示します。 Fiのから個々の信号値を取得した後reflyルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼ（ 図2Aおよび図2B）、ホタルルシフェラーゼシグナルは、ウミシイタケルシフェラーゼシグナル（ 図2C）に標準化しました。正規化が原因トランスフェクション効率のウェル間のばらつきにお勧めします。ウミシイタケ比（ すなわち、正規化された信号）の処置群は、未処理（未刺激）サンプル（ 図2Dのものと比較した処理条件（LPSまたはLPS + IL-10）は、ホタルのレポーターシグナルを変化させた場合に決定するために）。我々のデータは、LPSで処理RAW264.7細胞をLPSでIκBζ遺伝子の転写レベルを増加させたことを示す、をpGL3-IκBζプロモーターレポーターの活性をアップレギュレートすることを示しました。 IL-10の存在下で、IκBζプロモーターレポーターは、IL-10は、IκBζ遺伝子のLPS誘導性の転写を阻害することができたことを示唆し、より低い活性を有しました。タンパク質/ポリアミンベースのトランスフェクションは通常ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼ信号の両方で低い値を示した。 図3は 、トランスフェクションと刺激間の休止時間（24時間または48時間）の長さを比較し、ルシフェラーゼの信号が時間の経過とともに減少したことを示しています。脂質ベースのトランスフェクション試薬は、（ 図3A）を用いた場合の信号の減少は、データの解釈を妨げませんでした。 IL-10によるLPSおよび阻害による誘導は、まだ残りの48時間後に観察されました。タンパク質/ポリアミン系トランスフェクション試薬は、（ 図3B）は、特にRenillaルシフェラーゼシグナルを使用した場合しかし、シグナルの減少がより顕著でした。その結果、治療群間の差は、48時間の休息の後に観察されませんでした。
アポトーシスの程度に各トランスフェクション法の影響を評価したように、トランスフェクションの一つの望ましくない効果は、細胞死です。細胞をトランスフェクトした、またはしない、およびアネキシンV及びヨウ化プロピジウム（PI）に供しました染色。これらの細胞から調製した溶解物は、また、無傷で切断されたポリADPリボースポリメラーゼ（PARP）タンパク質の存在について分析しました。アネキシンV / PI染色細胞のフローサイトメトリー分析は、タンパク質/ポリアミンベースのトランスフェクションはなかったが、脂質ベースのトランスフェクションは、若干、非トランスフェクト細胞と比較して、アネキシンV陽性細胞の割合を増加することが示唆された（ 図4A） 。タンパク質/ポリアミン系トランスフェクションは（ 図4B）しなかった。同様に、脂質ベースのわずかトランスフェクトは、切断PARPの割合を増加させました。しかし、アポトーシス細胞の上昇数にもかかわらず、光学顕微鏡による細胞の形態は（ 図4C）を変更しませんでした。さらに重要なことは、脂質ベースのトランスフェクトされた細胞の生物学的応答は、非トランスフェクト細胞（ 図4D）のものと同一のままでした。細胞は、IL-10 ^±LPSおよびTNFの量で刺激し5;培養上清中に分泌をELISAによって定量しました。両方のトランスフェクトしていないと脂質ベースのトランスフェクションされた細胞は、LPSに応答してTNFαの同様の量を作り、IL10の添加により阻害されました。細胞を刺激しなかったときに、TNFαが行われなかった（ 図4D）は、細胞がトランスフェクション後のナイーブ残っていることを示唆しています。
脂質ベースのトランスフェクションの1図は、タンパク質/ポリアミン系トランスフェクションよりも高いトランスフェクション効率を示しました 。 （A）RAW264.7細胞は、いずれかの脂質ベースまたはタンパク質/ポリアミン系トランスフェクション試薬を用いてGFP発現プラスミドをトランスフェクトしました。 GFPシグナルは、24時間後にフローサイトメトリーによって測定しました。 （B）RAW264.7細胞のpGL3-IkBζプロモーターレポーターでトランスフェクトしました。 48時間の休息の後、Cellsは6時間LPSで刺激しました。ホタルルシフェラーゼシグナルは、製造業者の指示に従って測定した。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2の典型的なルシフェラーゼアッセイデータ。RAW264.7細胞はTK-ウミシイタケ及びIkBζプロモーターレポーターでトランスフェクトしました。 24時間の休息の後、細胞を2時間LPS±IL-10で刺激しました。 （A）ホタルルシフェラーゼ及び（B）Renillaルシフェラーゼシグナルを、ルシフェラーゼアッセイを製造業者の説明書に従って測定しました。 （C）レポーター活性TK-ウミシイタケ信号に正規化し、ホタル/ウミシイタケ比としてプロットしました。 （D）の変化倍数を割ることによって計算されますホタル：未刺激サンプルのそれによって刺激されたサンプルのウミシイタケ比。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
ルシフェラーゼ信号の強度3.図は、時間依存性である。（A）脂質ベースのトランスフェクトし、（B）タンパク質/ポリアミン系トランスフェクト細胞をLPS±IL-10で刺激前に24時間または48時間のいずれかのために休ませました2時間。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここで説明するプロトコルは、単独でトランスフェクション効率に焦点を当てたが、細胞の生理的状態の効率と保全のバランスを取ることを目的としません。具体的には、私たちの手順は、トランスフェクション試薬の毒性を最小化し、ルシフェラーゼシグナルを最大化することに成功しています。
プロトコルにおける一つの重要なステップは、細胞の健康状態です。生い茂った培養物は、それらの生理機能が変化し、長時間のRAW264.7細胞の連続培養は、細胞10の表現型および機能を変更することができるように、トランスフェクションには適していません。低継代番号がたて解凍した細胞を、トランスフェクションのために使用することをお勧めします。
もう一つの重要な考慮事項は、トランスフェクション試薬の選択です。脂質ベースのトランスフェクション試薬は、典型的に起因使用および商業的入手の容易さの研究に使用されています。しかし、これらの試薬のいくつかはunintende引き起こさD（および通常は望ましくない）トランスフェクションされた細胞11,12のグローバル遺伝子発現の変化。この問題に対処するために、細胞は、わずか数時間のトランスフェクション試薬の代わりに、典型的なO / Nでインキュベートする、または非脂質ベースの試薬をトランスフェクションのために選択されます。トランスフェクション試薬とのより長いインキュベーション時間は、トランスフェクション効率を増加させるが、それは、細胞に有害であることができるいずれかの実験計画を妨害する可能性がどちらも細胞死または細胞の活性化を引き起こす。 図4Aおよび4Bは 、そのタンパク質/ポリアミンベースのトランスフェクションは、トランスフェクトしていない細胞と比較して、アポトーシスまたは壊死を引き起こさありませんでした。脂質ベースのトランスフェクションは、さらに短いインキュベーション時間で、細胞死のより高いレベルを引き起こしました。これは、脂質ベースのトランスフェクション試薬のより高いトランスフェクション効率と相関しています。トランスフェクトした細胞を顕微鏡下で観察したときしかし、顕著な形態学的変化は認められませんでしたS（ 図4C）。活性化マクロファージは、通常、広大な形状を採用したが、非トランスフェクションおよびトランスフェクトされた細胞の両方は、彼らが休止状態にあったことを示し、刺激前に活性化の兆候を示さありませんでした。さらに、トランスフェクトされた細胞は、非トランスフェクト細胞（ 図4D）として、LPSおよびIL-10の刺激と同様に反応しました。これらの観察をまとめ、このトランスフェクション手順は、細胞の自然な行動を変化させないことを示しています。
トランスフェクションおよび実験処理の間の時間（休憩時間）も重要です。十分な時間が発現するルシフェラーゼ遺伝子について、それらの休止状態を再確立するための細胞のために与えられる必要があります。しかしながら、長いインキュベーションは、トランスフェクション効率が高くない場合は特に、ルシフェラーゼシグナルを減少させることができます。
ここでの手順は、私たちの研究室で使用される特定のルシフェラーゼレポーター遺伝子に適用されます。マイナー調整は旧姓になりますDED別のレポーターを使用した場合。ウミシイタケルシフェラーゼの比、トランスフェクションおよび治療、および処理条件との間の休止時間：テストする必要があるパラメータが異なるホタルルシフェラーゼレポーターを含みます。 50：のpGL3-IκBζ：1の比率のphRL-TKは、一般的に使用されますが、比率は1から範囲とすることができる：1：1から100まで。これは、細胞からトランスフェクション溶液を除去し、実験的処置の開始との間の24時間の残りの部分は、最良の信号を与えたことが見出されました。 48時間後、ルシフェラーゼシグナルは減少を開始し、治療群間の差は減少し、あるいは廃止されました。
記載のトランスフェクション手順を、ルシフェラーゼレポーターアッセイに限定されるものではありません。均質な集団を必要としない他の実験設計は、利益を得ることになります。例えば、個々の細胞からの観察に依存して、蛍光顕微鏡。一つの欠点は、トランスフェクトしていない相手の間で正常にトランスフェクトされた細胞を検索することがしますが、あまり時間がかかり、労働集約的であることの利点は、より望ましいことがあります。安定な細胞株が好ましい場合には、我々のプロトコルは、安定な細胞株が生成されているときに実験手順を最適化することができる最初の実験の平均を提供します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Life Technologies | K210007 | Any maxiprep kit will work |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Life Technologies | 15593-049 | Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container. |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30396.03 | Inactivated at 56 °C water bath for 45 min before use. |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Warm to at least room temperature before use. |
| XtremeGene HP DBA transfection reagent | Roche | 6366236001 | Warm to room temperature before use. |
| GeneJuice | EMD Millipore | 70967 | Warm to room temperature before use. |
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E1941 | 30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 |
References
- Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10 (1), 9-18 (2010).
- Thompson, C. D., Frazier-Jessen, M. R., Rawat, R., Nordan, R. P., Brown, R. T. Evaluation of methods for transient transfection of a murine macrophage cell line RAW 264.7. Biotechniques. 27 (4), 824-835 (1999).
- Kim, T., Eberwine, J. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Stacey, K. J., Sweet, M. J., Hume, D. A. Macrophages ingest and are activated by bacterial DNA. Journal of immunology. 157 (5), 2116-2122 (1996).
- Jiang, W., Reich, I. C., Pisetsky, D. S. Mechanisms of activation of the RAW264.7 macrophage cell line by transfected mammalian DNA. Cell Immunol. 229 (1), 31-42 (2004).
- Jiang, W., Pisetsky, D. S. The induction of HMGB1 release from RAW 264.7 cells by transfected DNA. Mol Immunol. 45 (7), 2038-2046 (2008).
- Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-147 (2009).
- Cheung, S. T., So, E. Y., Chang, D., Ming-Lum, A., Mui, A. L. Interleukin-10 inhibits lipopolysaccharide induced miR-155 precursor stability and maturation. PLoS One. 8 (8), e71336 (2013).
- Weber, M., Moller, K., Welzeck, M., Schorr, J. Short technical reports. Effects of lipopolysaccharide on transfection efficiency in eukaryotic cells. Biotechniques. 19 (6), 930-940 (1995).
- Berghaus, L. J., et al. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 33 (5), 443-456 (2000).
- Fiszer-Kierzkowska, A., et al. Liposome-based DNA carriers may induce cellular stress response and change gene expression pattern in transfected cells. BMC Mol Biol. 12 (1), 27-36 (2011).
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (7), 617-626 (2009).
