Introduction
La transfección de ácidos nucleicos en las células tiene una aplicación diversa en la investigación científica. Los ejemplos incluyen (1) genes indicadores para estudiar el papel de los diferentes elementos de genes en la expresión génica, (2) los plásmidos de expresión de proteínas que sobreexpresan la proteína de interés, y (3) pequeños ARN de interferencia para downregulate la expresión génica. Mediante la manipulación del nivel de expresión de genes particulares y midiendo el efecto diferencial de tales manipulaciones, los investigadores pueden deducir las funciones de los genes en los sistemas biológicos seleccionados. No todos los métodos de transfección proporcionan las mismas eficacias de transfección, e incluso el mismo método de transfección no transfectar todos los tipos celulares igualmente 1. Por lo tanto, los diferentes métodos de transfección se han desarrollado tal como el método de fosfato de calcio, DEAE dextrano, transfección de lípido catiónico, catiónicos transfección polímero no lípidos, electroporación, y nucleofection 2,3.
La transfección en macrófagos es ESPEcialmente difícil debido al hecho de que los macrófagos son fagocitos profesionales que son muy sensibles a materiales extraños, incluyendo bacterias derivados (metilado) DNA 4. Introducción de ADN extraño activa la vía Toll-like receptor 9 (TLR9) que conduce a la producción de citoquinas y 5,6 óxido nítrico. Estos macrófagos activados pueden entonces ser menos sensible al tratamiento que los investigadores pretenden estudiar.
Nuestro laboratorio transfecta rutinariamente la RAW264.7 línea celular de macrófagos con genes informadores de luciferasa, y hemos desarrollado un protocolo que es lo suficientemente robusta como para tener señal de luciferasa significativamente más alto que el fondo, pero también lo suficientemente suave para los macrófagos se mantengan en su estado de reposo. Los comportamientos de las células transfectadas fueron evaluados por un gen reportero de luciferasa de luciérnaga-albergar la región promotora del IκBζ (pGL3- IκBζ). IκBζ expresión está regulada por el labio componente de la pared celular bacterianaopolyssacharide (LPS) 7,8, y downregulated por la citoquina anti-inflamatoria, la interleucina-10 (IL-10) 8. Para tener en cuenta la variación de transfección entre pozos, co-transfectar un plásmido de control que contiene el gen de la luciferasa de Renilla (por ejemplo, phRL-TK) con fines de normalización. El protocolo descrito se optimiza después de probar varios parámetros incluyendo la sincronización de la transfección, el tipo de reactivos de transfección, las cantidades de reactivos de transfección y de ADN de plásmido, así como la relación de reactivo de transfección con el plásmido de ADN. Los dos reactivos de transfección incluidos en este protocolo son (1) un reactivo de transfección a base de lípidos y (2) a / reactivo de transfección a base de poliamina proteína.
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Protocol
1. El plásmido DNA Purification
- Extraer el ADN plásmido usando un kit de maxiprep de acuerdo con el protocolo del fabricante. ADN plásmido Resuspender en 500 l de tampón TE.
- Realizar un fenol: cloroformo: alcohol isoamílico extracción y precipitación con isopropanol para eliminar contaminantes bacterianos residuales. La presencia de LPS interfiere con la transfección 9.
- Añadir 500 l de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25: 24: 1, pH 8) con el ADN plásmido y agitar enérgicamente durante 15 seg. El fenol provoca quemaduras graves en la piel y es un anestésico para quemaduras no siempre se hacen sentir hasta que no haya daños severos. Realizar fenol: extracción de isoamilo en la campana de humos y tenga cuidado: cloroformo.
- Incubar la mezcla durante 5 min a TA. Centrifugar a 13000 xg durante 10 min a TA. Transferir 350 l de fase acuosa superior a un nuevo tubo de 1,5 ml colección.
- Añadir 350 l de tampón TE al tubo que contiene la fase orgánica inferior. Agitar enérgicamente durante 15 segundos. Centrifugar a 13.000 xg durante 5 min a TA. Transferir 350 l de fase acuosa superior a la misma tubo de recogida de 1,5 ml.
- Añadir 70 l de acetato de sodio 3 M (pH 5,2) y mezclar bien. Añadir 700 l de 100% de isopropanol. Mezclar bien e incubar 10 min a TA. Se centrifuga a 13.000 xg durante 10 MINAT 4 ° C. Eliminar el sobrenadante.
- Añadir 500 l de etanol al 75% al sedimento. Muestras de mezclar en vórtex y centrifugar a 5000 xg durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante. ADN es en el sedimento.
- Abrir el tapón del tubo y el aire seco el sedimento a temperatura ambiente durante de 5 - 10 min. El sedimento debe convertirse translúcido. Añadir 500 l de tampón TE para resuspender el sedimento de ADN. Se calienta a 50 - 60 ° C durante 10 min para disolver el sedimento de ADN.
- Medir la absorbancia a 260 nm (A260) y 280 nm (A280) con un espectrómetro. Calcular la concentración de ADN multiplicando el valor A260 por 50 ng / l. Evaluar la calidad del ADN por calculating la relación A260 / A280. ADN con alta calidad debe dar una relación A260 / A280 de 1,8-2,0.
2. El cultivo de células y Siembra
- Células RAW264.7 Cultura en DMEM suplementado con suero fetal de ternera 9% (DMEM / 9% de FCS) en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. Durante cada paso, separar las células de la placa por pipeteado continuo con una pipeta Pasteur. Passage las células cada 2 días, y sembrar 1,5-2.000.000 células en una placa de cultivo de tejidos tratados con 10 cm como el stock. Descongelar un nuevo balance de células cada 5-6 semanas.
- En el día de la transfección, las semillas de 200.000 células por pocillo en una placa de 24 pocillos en un volumen de 500 l de DMEM / 9% de FCS. Se incuban las células durante 4 horas en la incubadora a 37ºC.
- Transfectar células ya sea con el reactivo basado en lípidos (paso 3.1) o el reactivo de base poliamina-proteína / (paso 3.2).
3. La transfección
- Basados en lípidos transfección:
- Caliente el reagen transfecciónt a RT en la oscuridad. Calentar medio libre de suero y DMEM / 9% de FCS a 37 ° C.
- Añadir 0,5 g de ADN plásmido a 50 l de medio libre de suero en un tubo de 1,5 ml. Añadir 2 l de reactivo de transfección con la punta de la pipeta por debajo de la superficie del líquido. Vortex durante 6 s.
- Dejar reposar la mezcla reactivo / ADN en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 min.
- Durante la incubación de 30 minutos, retire los medios de comunicación desde el bien y añadir 250 l de DMEM / 9% de FCS a cada pocillo.
- Después de 30 min, añadir 250 l de DMEM / 9% de FCS a la mezcla de reactivo / ADN. Mezclar bien pipeteando arriba y abajo.
- Añadir 300 l de la mezcla diluida a cada pocillo. Incubar durante 2-4 horas en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora.
- Retire solución de transfección y añadir 500 l de DMEM / 9% de FCS. Incubar durante 24 - 48 horas en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora antes de la estimulación celular.
- Proteína / a base de poliamina transfección:
- Calentar el suero librey medio DMEM / 9% de FCS a 37 ° C.
- Añadir 0,75 l de reactivo de transfección de 18,75 l de medio libre de suero. Vortex brevemente para mezclar. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Añadir 0,5 l de 1 mg / l de ADN en el reactivo transfectadas diluida. Incubar a TA durante 10 min.
- Durante la incubación de 10 min, quitar el medio de cada pocillo de la placa de 24 pocillos y añadir 250 l fresco DMEM / 9% de FCS a cada pocillo.
- Después de 10 min, añadir 250 l de DMEM / FCS 9% en la mezcla de reactivo / ADN.
- Añadir 270 l de la mezcla diluida al pozo. Incubar en un incubador de CO2 de 37 ° C y 5% para 2-4 horas.
- Retire solución de transfección y añadir 500 l de DMEM / 9% de FCS. Incubar durante 24 - 48 horas en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora.
4. La estimulación celular y ensayo de luciferasa
- Reemplace los medios en los bien con 250 l de DMEM / 9% de FCS.
- Añadir 50 l de LPS o LPS + IL-10 A las concentraciones deseadas al pozo. Devuelva la placa a la 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. Estimular el 2 - 6 horas.
- Retire solución estimulación mediante aspiración, lavar con PBS frío hielo, y añadir 200 l de 1x pasiva tampón de lisis. Roca a temperatura ambiente durante 30 min. Raspar y transferir el lisado a tubos de 1,5 ml y eliminar los desechos celulares por centrifugación a 20.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Transferencia de 40 l de lisado aclarado (sobrenadante) a un plato blanco, fondo claro de 96 pocillos para la determinación de las señales de luciferasa de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Lea la señal de luciferasa con un luminómetro en todo el espectro de luz visible.
Análisis 5. Datos
- Calcular la luciérnaga: relación Renilla dividiendo los valores individuales de la luciferasa de luciérnaga por los valores de Renilla luciferasa de cada pocillo.
- Calcular el cambio veces dividiendo la luciérnaga: Renilla relación del tratado bien porque del pozo sin tratar.
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Representative Results
La Figura 1 compara la eficiencia de transfección de los dos reactivos de transfección en RAW264.7. El reactivo basado en lípidos típicamente dio aproximadamente 25% de tasa de transfección, mientras que la transfección basado poliamina-proteína / resultó en aproximadamente 5% de eficiencia (Figura 1A). La diferencia en la eficiencia de transfección se observó también en señales de luciferasa en las células RAW264.7 transfectadas con el promotor reportero pGL3-IκBζ (Figura 1B). La adición de LPS a estas células transfectadas aumento de la señal de luciferasa de luciérnaga, una indicación directa del aumento de la actividad de transcripción del informador promotor IκBζ. En otras palabras, los resultados sugirieron que LPS upregulated la expresión del gen IκBζ, consistente con informes anteriores 7,8. La Figura 2 muestra los resultados típicos obtenidos en nuestros experimentos, usando transfección basado en lípidos como un ejemplo. Después de obtener los valores de señal individuales de fiRefly luciferasa y luciferasa de Renilla (Figuras 2A y 2B), las señales de luciferasa de luciérnaga se normalizaron a la señal de luciferasa de Renilla (Figura 2C). La normalización se recomienda debido a la variación acomodado bien en la eficacia de transfección. Para determinar si las condiciones de tratamiento (LPS o LPS + IL-10) alteran las señales reportero, la luciérnaga: relación Renilla (es decir, las señales normalizadas) de los grupos de tratamiento se compararon con el de la no tratada (no estimulada) de la muestra (Figura 2D ). Nuestros datos muestran que el tratamiento de células RAW264.7 con LPS upregulated la actividad del reportero promotor pGL3-IκBζ, lo que indica que LPS aumentó el nivel de transcripción del gen IκBζ. En la presencia de IL-10, el reportero promotor IκBζ tenía la menor actividad, lo que sugiere que la IL-10 fue capaz de inhibir LPS inducido por la transcripción del gen IκBζ. El / transfección basado en poliamina proteína generalmentedio valores más bajos tanto en las señales de luciferasa de Renilla luciferasa de luciérnaga y. La Figura 3 compara la longitud de tiempo de descanso entre la transfección y la estimulación (24 hr o 48 hr), y muestra que las señales de luciferasa disminuyeron con el tiempo. La disminución en la señal no interfirió con la interpretación de los datos cuando se utilizó el reactivo de transfección a base de lípidos (Figura 3A); inducción por LPS y la inhibición por IL-10 todavía se observaron después de 48 horas de descanso. Sin embargo, la disminución de la señal fue más significativo cuando se usó el / reactivo de transfección a base de poliamina proteína (Figura 3B), en especial las señales de luciferasa de Renilla. Como resultado, la diferencia entre los grupos de tratamiento no se observó después de un descanso de 48 horas.
Un efecto no deseado de la transfección es la muerte celular así se evaluó el impacto de cada método de transfección en el grado de apoptosis. Las células fueron transfectadas, o no, y se sometieron a Anexina-V y yoduro de propidio (PI)tinción. También se analizaron los lisados preparados a partir de estas células para la presencia de ADP proteína intacta y se escindió poli ribosa polimerasa (PARP). Análisis de citometría de flujo de las células con anexina-V / PI manchado sugirió que la transfección a base de lípidos aumentó ligeramente la proporción de células positivas Anexina-V en comparación con las células no transfectadas, mientras que la transfección basado poliamina-proteína / no lo hizo (Figura 4A) . Del mismo modo, el lípido-basada transfectadas ligeramente aumentado la proporción de PARP escindida, mientras que la transfección basado poliamina-proteína / no lo hizo (Figura 4B). Sin embargo, a pesar de los números elevados de células apoptóticas, la morfología de las células al microscopio óptico no cambió (Figura 4C). Más importante aún, la respuesta biológica de las células transfectadas a base de lípidos se mantuvo idénticos a los de las células no transfectadas (Figura 4D). Las células fueron estimuladas con LPS ± IL-10, y las cantidades de TNF ^5; secretada en el sobrenadante de cultivo se cuantificaron por ELISA. Tanto las células transfectadas y no transfectadas basados en lípidos hicieron cantidades similares de TNF en respuesta a LPS y se inhibieron mediante la adición de IL10. No TNFa se hizo cuando las células no se estimularon (Figura 4D) lo que sugiere que las células permanecieron naïve después de la transfección.
Figura 1. La transfección basado en lípidos dio una mayor eficiencia de transfección que el / transfección basado en poliamina proteína. (A) las células fueron transfectadas RAW264.7 un plásmido GFP-expresión, ya sea con los basados en lípidos o los reactivos de transfección basados poliamina-proteína /. Señal de las buenas prácticas agrarias se midió por citometría de flujo después de 24 horas. (B) las células RAW264.7 fueron transfectadas con el reportero promotor pGL3-IkBζ. Después de 48 horas de descanso, cells fueron estimuladas con LPS durante 6 horas. Señal de luciferasa de luciérnaga se midió de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Los datos del ensayo de luciferasa típicos. RAW264.7 células fueron transfectadas con TK-Renilla y IkBζ reportero promotor. Después de 24 hr resto, las células fueron estimuladas con LPS ± IL-10 durante 2 h. (A) de la luciferasa de la luciérnaga y (b) las señales de luciferasa de Renilla se midieron de acuerdo con las instrucciones del fabricante luciferasa ensayo. (C) la actividad de reportero se normalizó a la señal de TK-Renilla y se representa como cociente Firefly / Renilla. (D) Doble cambio se calcula dividiendo elluciérnaga:. Renilla relación de las muestras estimuladas por la de la muestra no estimulada Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. La fuerza de la señal de luciferasa es dependiente del tiempo. (B) células basadas poliamina-proteína / transfectadas basados en lípidos y (A) transfectadas se descansaron durante 24 hr o bien 48 horas antes de la estimulación con LPS ± IL-10 durante 2 horas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo descrito aquí no sólo se centran en la eficiencia de la transfección, sino que pretende lograr un equilibrio entre la eficiencia y la conservación de los estados fisiológicos de las células. Específicamente, nuestro procedimiento tiene éxito en la reducción de la toxicidad del reactivo de transfección y la maximización de la señal de luciferasa.
Un paso crítico en el protocolo es la salud de las células. Culturas Cubierto de vegetación no son adecuados para la transfección como sus cambios de la fisiología y el cultivo continuo de células RAW264.7 por un largo período de tiempo también puede cambiar el fenotipo y la función de las células 10. Células recién descongelados que tienen un número bajo de paso se recomienda utilizar para la transfección.
Otra consideración importante es la elección de reactivos de transfección. Reactivos de transfección basados en lípidos se utilizan normalmente en la investigación debido a su facilidad de uso y disponibilidad comercial. Sin embargo, algunos de estos reactivos causados unintended (y por lo general no deseado) cambios en la expresión génica global en las células transfectadas 11,12. Para abordar este problema, sólo las células se incuban con los reactivos de transfección por un par de horas en lugar de la típica O / N, o un reactivo no basado en lípidos se elige para la transfección. Un mayor tiempo de incubación con el reactivo de transfección aumentará la eficiencia de la transfección, pero también puede ser perjudicial para las células ya sea provocando la muerte celular o la activación de células, ambos de los cuales pueden interferir con el diseño experimental. Las figuras 4A y 4B muestran que la proteína / polyamine- transfección basado no causó apoptosis o necrosis, en comparación con las células no transfectadas. La transfección basado en lípidos, incluso con el tiempo de incubación corto, causó un nivel más alto de la muerte celular. Se correlaciona con la mayor eficiencia de transfección del reactivo de transfección a base de lípidos. Sin embargo, cuando se observaron las células transfectadas bajo el microscopio, no hubo cambio morfológico notables (Figura 4C). Los macrófagos activados generalmente adoptan una forma extensa, pero tanto las células no transfectadas y transfectadas no muestran signos de activación antes de la estimulación, indicando que eran en sus estados de reposo. Además, las células transfectadas respondieron de manera similar a LPS e IL-10 como la estimulación de las células no transfectadas (Figura 4D). Estas observaciones en conjunto indican que este procedimiento de transfección no altera el comportamiento natural de las células.
El tiempo entre la transfección y el tratamiento experimental (el tiempo de descanso) también es crucial. Suficiente tiempo necesario tener en cuenta para los genes de luciferasa para expresar y para las células para restablecer su estado de reposo; sin embargo, una larga incubación puede reducir las señales de luciferasa, especialmente cuando la eficiencia de transfección no es alto.
El procedimiento aquí se aplica para el gen informador de la luciferasa específico utilizado en nuestro laboratorio. Ajustes menores serán needed cuando se utiliza otro reportero. Los parámetros que necesitan ser probadas incluyen diferente reportero de luciferasa de luciérnaga: relación de luciferasa de Renilla, el tiempo de descanso entre la transfección y el tratamiento, y las condiciones de tratamiento. Una proporción de 50: 1 de pGL3-IκBζ: phRL-TK se utiliza normalmente, pero la proporción puede variar desde 1: 1 a 100: 1. Se encontró que un resto 24 hr entre la eliminación de la solución de transfección de las células y el comienzo del tratamiento experimental dio la mejor señal. Después de 48 horas, las señales de luciferasa comenzaron en declive, y las diferencias entre los grupos de tratamiento fueron reducidos o incluso abolidas.
El procedimiento de transfección descrito no se limita a los ensayos de reportero de luciferasa. Otros diseños experimentales que no necesitan una población homogénea serán beneficiados; por ejemplo, microscopía de fluorescencia que se basa en observaciones de células individuales. Una desventaja será para localizar las células transfectadas con éxito entre homólogos no transfectadas, pero elbeneficios de ser menos tiempo y mano de obra pueden ser más deseado. En los casos donde se prefieren líneas celulares estables, nuestro protocolo proporciona un medio para los experimentos iniciales en el que procedimiento experimental se puede optimizar cuando se generan líneas celulares estables.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Life Technologies | K210007 | Any maxiprep kit will work |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Life Technologies | 15593-049 | Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container. |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30396.03 | Inactivated at 56 °C water bath for 45 min before use. |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Warm to at least room temperature before use. |
| XtremeGene HP DBA transfection reagent | Roche | 6366236001 | Warm to room temperature before use. |
| GeneJuice | EMD Millipore | 70967 | Warm to room temperature before use. |
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E1941 | 30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 |
References
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