Introduction
Transfectie van nucleïnezuren in cellen heeft een gevarieerde toepassing in het wetenschappelijk onderzoek. Voorbeelden omvatten (1) reporter genen tot de rol van verschillende genen elementen in genexpressie te bestuderen, (2) proteïne-expressieplasmiden om het eiwit van interesse tot overexpressie, en (3) kleine interfererende RNA genexpressie te downreguleren. Door het manipuleren van de expressie van bepaalde genen en het meten van het differentiële effect van dergelijke manipulaties kunnen onderzoekers de genfuncties in het gekozen biologische systemen afleiden. Niet alle transfectie werkwijzen dezelfde transfectie efficiënties, en zelfs dezelfde transfectie methode niet gelijkmatig 1 transfecteren alle celtypes. Vandaar dat verschillende transfectie werkwijzen ontwikkeld zoals calciumfosfaat methode, DEAE dextran, kationisch lipide transfectie, kationische niet lipide polymeer transfectie, elektroporatie, en nucleofectie 2,3.
Transfectie in macrofagen is especieel moeilijk te wijten aan het feit dat macrofagen professionele fagocyten die zeer gevoelig zijn voor vreemde materialen waaronder bacteriën afgeleide (gemethyleerd) DNA 4. Inbrengen van vreemd DNA activeert de Toll-like receptor 9 (TLR9) traject leidt tot de productie van cytokines en stikstofoxide 5,6. Deze geactiveerde macrofagen kan dan minder te reageren op behandeling die de onderzoekers gaan onderzoeken.
Ons laboratorium routinematig transfects de RAW264.7 macrofaag cellijn met luciferase reporter genen, en we hebben een protocol dat is ongevoelig luciferase signaal significant hoger dan de achtergrond zijn ontwikkeld, maar ook zacht genoeg om macrofagen in de rust toestand blijven. Het gedrag van de getransfecteerde cellen werden beoordeeld door een vuurvlieg luciferase reporter gen herbergt het promotorgebied van IκBζ (pGL3 IκBζ). IκBζ expressie opgereguleerd door de bacteriële celwand component lipopolyssacharide (LPS) 7,8 en neerwaarts gereguleerd door de anti-inflammatoire cytokine, interleukine-10 (IL-10) 8. Om rekening te houden transfectie variatie tussen putten, we co-transfecteren een controle-plasmide dat het Renilla luciferasegen (bv phRL-TK) voor normalisatie doeleinden. De beschreven protocol wordt geoptimaliseerd na het testen van verscheidene parameters waaronder timing van transfectie type transfectie reagentia, hoeveelheden transfectie reagentia en plasmide-DNA, en verhouding van transfectiereagens tot DNA plasmide. De twee transfectie reagentia in dit protocol zijn (1) een lipide-gebaseerde transfectie reagens en (2) een eiwit / polyamine gebaseerde transfectie reagens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plasmide DNA Purification
- Extraheer plasmide-DNA met een maxiprep kit volgens het protocol van de fabrikant. Resuspendeer plasmide DNA in 500 pl TE buffer.
- Voer een fenol: chloroform: isoamylalcohol extractie en isopropanol precipitatie om resterende bacteriële verontreinigingen te verwijderen. De aanwezigheid van LPS verstoort transfectie 9.
- Voeg 500 ul fenol: chloroform: isoamylalcohol (25: 24: 1, pH 8) met het plasmide-DNA en schud krachtig gedurende 15 seconden. Fenol veroorzaakt ernstige brandwonden op de huid en is een verdoving, zodat brandwonden worden niet altijd gevoeld totdat er zware schade. Voer fenol: chloroform: isoamyl extractie in de zuurkast en wees voorzichtig.
- Incubeer het mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer bij 13.000 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Transfer 350 ul van de bovenste waterige fase in een nieuwe 1,5 ml collectie buis.
- Voeg 350 ui TE-buffer om de buis die de onderste organische fase bevat. Schud krachtig gedurende 15 sec. Centrifugeer bij 13.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Transfer 350 ul van de bovenste waterige fase naar dezelfde 1,5 ml collectie buis.
- Voeg 70 pl 3 M natriumacetaat (pH 5,2) en meng. Voeg 700 ul 100% isopropanol. Meng goed en incubeer 10 min bij RT. Centrifugeer bij 13.000 xg gedurende 10 Minat 4 ° C. Verwijder het supernatant.
- Voeg 500 pl 75% ethanol aan de pellet. Vortex monsters te mengen en centrifugeer bij 5000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant. DNA in de pellet.
- Open de dop van de buis en de lucht droog de pellet bij kamertemperatuur 5-10 min. De pellet moet doorzichtig geworden. Voeg 500 ui TE-buffer om de DNA pellet te resuspenderen. Verhit bij 50 - 60 ° C gedurende 10 minuten om het DNA pellet lossen.
- Meet de absorptie bij 260 nm (A260) en 280 nm (A280) met een spectrometer. Bereken de concentratie van DNA door de A260 waarde te vermenigvuldigen met 50 ng / ul. Beoordelen van de kwaliteit van het DNA door calculating van de A260 / A280-verhouding. 2.0 - DNA met een hoge kwaliteit moet een A260 / A280-verhouding van 1,8 te geven.
2. Cel Kweken en zaaien
- Culture RAW264.7 cellen in DMEM aangevuld met 9% foetaal kalfsserum (DMEM / 9% FCS) in een 37 ° C, 5% CO2 incubator. Tijdens elke passage, los van de cellen van de plaat door het continu pipetteren met een Pasteur pipet. Passage van de cellen om de 2 dagen, en zaad 1,5-2.000.000 cellen op een 10 cm weefselkweek behandeld gerecht als de voorraad. Ontdooi een nieuwe voorraad van cellen elke 5 - 6 weken.
- Op de dag van transfectie zaad 200.000 cellen per putje in een 24-wells plaat in een volume van 500 pl DMEM / 9% FCS. Incubeer de cellen gedurende 4 uur in 37 ° C incubator.
- Transfecteren cellen hetzij de lipide gebaseerde reagens (stap 3,1) of het eiwit / polyamine gebaseerde reagens (stap 3.2).
3. Transfectie
- Lipide-gebaseerde transfectie:
- Warmen de transfectie reagent Rt in het donker. Opwarmen serumvrij medium en DMEM / 9% FCS tot 37 ° C.
- Voeg 0,5 ug plasmide DNA met 50 gl serumvrij medium in een 1,5 ml buis. Voeg 2 pl transfectie reagens met de pipetpunt onder het oppervlak van de vloeistof. Vortex voor 6 sec.
- Laat het reagens / DNA mengsel in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
- Tijdens de 30 minuten incubatie, verwijder de media uit de put en voeg 250 ul van verse DMEM / 9% FCS aan elk putje.
- Na 30 min, voeg 250 pl DMEM / 9% FCS aan het serum / DNA mengsel. Meng goed door en neer te pipetteren.
- Voeg 300 pi van het verdunde mengsel in elk putje. Incubeer 2-4 uur in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
- Verwijder transfectie-oplossing en voeg 500 pl DMEM / 9% FCS. Incubeer gedurende 24 - 48 uur op 37 ° C, 5% CO 2 incubator voor celstimulatie.
- Protein / polyamine-gebaseerde transfectie:
- Warmen serumvrijmedium en DMEM / 9% FCS tot 37 ° C.
- Voeg 0,75 pl transfectie reagens 18,75 gl serumvrij medium. Vortex kort te mengen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Voeg 0,5 ul van 1 ug / ul DNA in de getransfecteerde verdunde reagens. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
- Tijdens de 10 minuten incubatie, verwijder media uit elk putje van de 24-well plaat en voeg 250 ul vers DMEM / 9% FCS aan elk putje.
- Na 10 min, voeg 250 pl DMEM / 9% FCS in het reagens / DNA mengsel.
- Voeg 270 ul van de verdunde mengsel aan de put. Incubeer in een 37 ° C en 5% CO2 incubator gedurende 2-4 uur.
- Verwijder transfectie-oplossing en voeg 500 pl DMEM / 9% FCS. Incubeer gedurende 24 - 48 uur op 37 ° C, 5% CO2 incubator.
4. cel stimulatie en Luciferase Assay
- Vervang media in de put met 250 ul vers DMEM / 9% FCS.
- Voeg 50 ul van LPS of LPS + IL-10 Bij de gewenste concentraties aan de put. Zet de plaat om de 37 ° C, 5% CO2 incubator. Stimuleer voor 2-6 uur.
- Verwijder stimulatie oplossing door aspiratie, wassen met ijskoud PBS, en voeg 200 ul 1x Passive Lysis Buffer. Rock bij RT gedurende 30 min. Schraap af en breng het lysaat 1,5 ml buisjes en verwijderen celresten door centrifugeren bij 20.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Overdracht 40 ul geklaard lysaat (supernatans) om een witte, heldere bodem 96-well plaat voor de bepaling van luciferase signalen volgens protocol van de fabrikant.
- Lees de luciferase signaal met een luminometer in het gehele zichtbare lichtspectrum.
5. Data Analysis
- Bereken de vuurvlieg: Renilla verhouding door deling van de afzonderlijke waarden van vuurvlieg luciferase door de waarden van Renilla luciferase uit elk putje.
- Bereken de vouw verandering door de vuurvlieg te verdelen: Renilla verhouding van de goed behandeld doordat van de onbehandelde put.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 vergelijkt de transfectie-efficiëntie van de twee transfectie reagentia RAW264.7. De lipide-gebaseerde reagentia gaf typisch ongeveer 25% transfectie terwijl de eiwit / polyamine-gebaseerde transfectie resulteerde in ongeveer 5% efficiency (figuur 1A). Het verschil in transfectie-efficiëntie werd ook waargenomen in luciferase signalen in RAW264.7 cellen getransfecteerd met de pGL3-IκBζ promotor reporter (Figuur 1B). Toevoeging van LPS aan deze getransfecteerde cellen verhoogd vuurvlieg luciferase-signaal, een directe indicatie van verhoogde transcriptie activiteit van de promotor reporter IκBζ. Met andere woorden, de resultaten suggereerden dat LPS opgeregeld de expressie van het gen IκBζ, in overeenstemming met eerdere rapporten 7,8. Figuur 2 toont de typische resultaten verkregen in onze experimenten, met behulp van lipide-gebaseerde transfectie als voorbeeld. Na het behalen van individuele signaal waarden uit firefly luciferase en Renilla luciferase (Figuren 2A en 2B), de vuurvlieg luciferase signalen werden genormaliseerd op de Renilla luciferase-signaal (figuur 2C). Normalisatie wordt aanbevolen als gevolg van well-to-well variatie in transfectie-efficiëntie. Om te bepalen of de behandelingsomstandigheden (LPS of LPS + IL-10) veranderde de reporter signalen, de vuurvlieg: Renilla verhouding (dwz de genormaliseerde signalen) van de behandelingsgroepen werden vergeleken met die van de onbehandelde (niet-gestimuleerde) monster (figuur 2D ). Onze gegevens toonden aan dat de behandeling RAW264.7 cellen met LPS opgeregeld de activiteit van de pGL3-IκBζ promotor reporter, wat aangeeft dat LPS verhoogde het transcriptieniveau van het gen IκBζ. In aanwezigheid van IL-10, de IκBζ promotor reporter hadden lagere activiteit, wat suggereert dat IL-10 kon LPS-geïnduceerde transcriptie van het gen IκBζ remmen. Het eiwit / polyamine-gebaseerde transfectie gewoonlijkgaf lagere waarden in zowel vuurvliegluciferase en Renilla luciferase signalen. Figuur 3 vergelijkt de lengte van de rusttijd tussen transfectie en stimulatie (24 uur of 48 uur), en toont aan dat luciferase signalen afgenomen in de tijd. De afname in signaal niet belemmeren data interpretatie als de lipide gebaseerde transfectie reagens werd gebruikt (figuur 3A); inductie door LPS en remming van IL-10 werden steeds waargenomen na 48 uur rust. De afname in signaal groter was als de eiwit / polyamine gebaseerde transfectie reagens werd gebruikt (figuur 3B), met name de Renilla luciferase signalen. Dientengevolge werd het verschil tussen de behandelingsgroepen niet waargenomen na 48 uur rust.
Een ongewenst effect van transfectie celdood zodat de invloed van elke transfectie methode van de mate van apoptose werd bepaald. Cellen werden getransfecteerd of niet, en onderworpen aan Annexine-V en propidiumjodide (PI)kleuring. Lysaten bereid uit deze cellen werden geanalyseerd op de aanwezigheid van intacte en gesplitst poly ADP ribose polymerase (PARP) eiwit. Flow cytometrische analyse van de Annexine-V / PI gekleurde cellen suggereerde dat het op lipide gebaseerde transfectie licht het gedeelte van Annexine-V positieve cellen in vergelijking met de niet getransfecteerde cellen, terwijl het eiwit / polyamine-gebaseerde transfectie niet (Figuur 4A) . Ook de lipide-gebaseerde licht getransfecteerde het gedeelte van gesplitst PARP terwijl het eiwit / polyamine-gebaseerde transfectie niet (Figuur 4B). Ondanks de verhoogde aantallen apoptotische cellen, de morfologie van de cellen met lichtmicroscopie niet gewijzigd (Figuur 4C). Belangrijker is dat de biologische reactie van het op lipide gebaseerde getransfecteerde cellen bleven identiek aan die van de getransfecteerde cellen (Figuur 4D). De cellen werden gestimuleerd met LPS ± IL-10, en de bedragen van TNF ^5; afgescheiden in de kweek supernatant werden gekwantificeerd door ELISA. Zowel de getransfecteerde en op lipiden gebaseerde getransfecteerde cellen die vergelijkbare hoeveelheden van TNFa in respons op LPS en geremd door toevoeging van IL10. Geen TNFa werd toen de cellen werden niet gestimuleerd (figuur 4D), hetgeen suggereert dat de cellen bleef naïeve na transfectie.
Figuur 1. De lipide-gebaseerde transfectie gaf hogere transfectie-efficiëntie dan de eiwit / polyamine-gebaseerde transfectie. (A) RAW264.7 cellen werden getransfecteerd a-GFP expressie plasmide met ofwel de op lipide gebaseerde of eiwit / polyamine-gebaseerde transfectie reagentia. GFP-signaal werd gemeten door stroming cytometrie na 24 uur. (B) RAW264.7-cellen werden getransfecteerd met de pGL3-IkBζ promotor reporter. Na 48 uur rust, cells werden gestimuleerd met LPS gedurende 6 uur. Vuurvliegluciferase signaal werd gemeten volgens de instructies van de fabrikant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Typische luciferasetest data. RAW264.7-cellen werden getransfecteerd met TK-Renilla en IkBζ promotor reporter. Na 24 uur rusten, werden de cellen gestimuleerd met LPS ± IL-10 gedurende 2 uur. (A) Firefly luciferase en (B) Renilla luciferase signalen werden gemeten volgens de instructies van de fabrikant luciferase assay. (C) Reporter-activiteit werd genormaliseerd tot de TK-Renilla signaal en uitgezet als Firefly / Renilla verhouding. (D) Fold change wordt berekend door devuurvlieg:. Renilla verhouding van de gestimuleerde monsters door die van de niet-gestimuleerde monster Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. De sterkte van de luciferase-signaal is tijdsafhankelijk. (A) op lipide gebaseerde getransfecteerd en (B) Protein / polyamine gebaseerde getransfecteerde cellen werden ofwel rusttijd van 24 uur of 48 uur vóór stimulatie met LPS ± IL-10 2 uur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol hier beschreven is niet alleen richten op transfectie-efficiëntie, maar streeft naar een balans tussen efficiëntie en het behoud van de fysiologische toestand van de cellen te slaan. Specifiek onze procedure slaagt het minimaliseren van de toxiciteit van transfectie reagens en het maximaliseren luciferase-signaal.
Een kritische stap in het protocol is de gezondheid van de cellen. Overwoekerd culturen niet geschikt voor transfectie hun fysiologie veranderingen en continu kweken van RAW264.7 cellen gedurende een langere periode kan het fenotype en de functie van de cellen 10 te wijzigen. Vers ontdooid cellen die een laag passageaantal, worden aanbevolen om te gebruiken voor transfectie.
Een andere belangrijke overweging is de keuze van transfectie reagentia. Lipide-gebaseerde transfectie reagentia worden typisch gebruikt voor onderzoek vanwege het gebruiksgemak en commerciële beschikbaarheid. Sommige van deze reagentia veroorzaakt unintended (en meestal ongewenste) veranderingen in de wereldwijde genexpressie in getransfecteerde cellen 11,12. Om dit probleem aan te pakken, worden cellen geïncubeerd met alleen de transfectie reagentia voor enkele uren in plaats van de typische O / N, of een niet lipide-gebaseerde reagens gekozen voor transfectie. Langere incubatietijd het transfectie reagens transfectie-efficiëntie, maar het kan ook schadelijk voor de cellen ofwel veroorzaken van celdood of celactivatie, die beide kunnen interfereren met de experimentele opzet. De figuren 4A en 4B tonen dat het eiwit / polyamine- gebaseerde transfectie had apoptose of necrose veroorzaken, vergeleken met niet-getransfecteerde cellen. De lipide-gebaseerde transfectie, zelfs met de korte incubatietijd, veroorzaakt hogere celdood. Het houdt verband met de hogere transfectie-efficiëntie van de op lipide gebaseerde transfectie reagens. Echter, wanneer de getransfecteerde cellen werden waargenomen onder de microscoop, waren er geen noemenswaardige morfologische veranderings (Figuur 4C). Geactiveerde macrofagen nemen gewoonlijk een uitgestrekte vorm, maar zowel de niet getransfecteerde en getransfecteerde cellen niet tekenen van activering vertonen voorafgaand aan de stimulatie, wat aangeeft dat zij in hun rust staten waren. Bovendien, de getransfecteerde cellen reageerden vergelijkbaar met LPS en IL-10 stimulatie van de getransfecteerde cellen (Figuur 4D). Deze waarnemingen collectief geven aan dat dit transfectieprocedure natuurlijke gedrag van de cellen 'niet verandert.
De tijd tussen transfectie en experimentele behandeling (de rest tijd) is ook van cruciaal belang. Voldoende tijd moet worden gegeven voor de luciferase genen uit te drukken en om de cellen te herstellen van hun toestand van rust; echter kan een lange incubatietijd luciferase signalen te verminderen, vooral wanneer transfectie efficiëntie is niet hoog.
De procedure Hier geldt voor de specifieke luciferase reportergen in ons lab. Kleine aanpassingen zal nee zijnDED als een reporter wordt gebruikt. Parameters die moeten worden getest onder verschillende vuurvliegluciferase reporter: Renilla luciferase ratio, de rusttijd tussen transfectie en behandeling, en de behandeling. A 50: 1 verhouding van pGL3-IκBζ: phRL-TK wordt kenmerkend gebruikt, maar de verhouding kan variëren van 1: 1 tot 100: 1. Gevonden werd dat een 24 uur rust tussen de verwijdering van transfectieoplossing uit de cellen en het begin van de experimentele behandeling gaf de beste signaalkwaliteit. Na 48 uur, luciferase signalen begon af, en de verschillen tussen de behandelingsgroepen werden verminderd of zelfs afgeschaft.
De beschreven transfectie procedure is niet beperkt tot luciferase reporter assays. Andere experimentele ontwerpen die geen homogene bevolking hoeft zal worden geprofiteerd; bijvoorbeeld fluorescentiemicroscopie die berust op waarnemingen van individuele cellen. Een nadeel zal het de reeds getransfecteerde cellen onder niet-getransfecteerde tegenhangers lokaliseren, maar devoordelen van minder tijdrovend en arbeidsintensief kan meer te wensen over. Wanneer stabiele cellijnen de voorkeur hebben, ons protocol verschaft een middel voor initiële experimenten waarin experimentele procedure kan worden geoptimaliseerd wanneer stabiele cellijnen worden gegenereerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Life Technologies | K210007 | Any maxiprep kit will work |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Life Technologies | 15593-049 | Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container. |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30396.03 | Inactivated at 56 °C water bath for 45 min before use. |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Warm to at least room temperature before use. |
| XtremeGene HP DBA transfection reagent | Roche | 6366236001 | Warm to room temperature before use. |
| GeneJuice | EMD Millipore | 70967 | Warm to room temperature before use. |
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E1941 | 30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 |
References
- Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10 (1), 9-18 (2010).
- Thompson, C. D., Frazier-Jessen, M. R., Rawat, R., Nordan, R. P., Brown, R. T. Evaluation of methods for transient transfection of a murine macrophage cell line RAW 264.7. Biotechniques. 27 (4), 824-835 (1999).
- Kim, T., Eberwine, J. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Stacey, K. J., Sweet, M. J., Hume, D. A. Macrophages ingest and are activated by bacterial DNA. Journal of immunology. 157 (5), 2116-2122 (1996).
- Jiang, W., Reich, I. C., Pisetsky, D. S. Mechanisms of activation of the RAW264.7 macrophage cell line by transfected mammalian DNA. Cell Immunol. 229 (1), 31-42 (2004).
- Jiang, W., Pisetsky, D. S. The induction of HMGB1 release from RAW 264.7 cells by transfected DNA. Mol Immunol. 45 (7), 2038-2046 (2008).
- Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-147 (2009).
- Cheung, S. T., So, E. Y., Chang, D., Ming-Lum, A., Mui, A. L. Interleukin-10 inhibits lipopolysaccharide induced miR-155 precursor stability and maturation. PLoS One. 8 (8), e71336 (2013).
- Weber, M., Moller, K., Welzeck, M., Schorr, J. Short technical reports. Effects of lipopolysaccharide on transfection efficiency in eukaryotic cells. Biotechniques. 19 (6), 930-940 (1995).
- Berghaus, L. J., et al. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 33 (5), 443-456 (2000).
- Fiszer-Kierzkowska, A., et al. Liposome-based DNA carriers may induce cellular stress response and change gene expression pattern in transfected cells. BMC Mol Biol. 12 (1), 27-36 (2011).
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (7), 617-626 (2009).
