Introduction
A transfecção de ácidos nucleicos em células tem uma aplicação variada na pesquisa científica. Exemplos incluem (1) genes repórter para estudar o papel dos diferentes elementos do gene na expressão do gene, (2) expressão da proteína plasmídeos para sobre-expressar a proteína de interesse, e (3) pequeno ARN interferente para regular negativamente a expressão do gene. Ao manipular o nível de expressão de genes particulares e medindo o efeito diferencial de tais manipulações, os investigadores podem-se deduzir as funções de genes em sistemas biológicos seleccionados. Nem todos os métodos de transfecção fornecer a mesma eficiência de transfecção, e mesmo o mesmo método de transfecção não transfectar células igualmente todos os tipos 1. Assim, diferentes métodos de transfecção têm sido desenvolvidos, tais como o método de fosfato de cálcio, DEAE dextrano, transfecção catiónica lípido, polímero catiónico transfecção não com lipidos, electroporação, e nucleofection 2,3.
A transfecção em macrófagos é especialmente difícil devido ao fato de que os macrófagos são fagócitos profissionais que são muito sensíveis a materiais estranhos, incluindo as bactérias derivadas (desnaturado) de ADN 4. A introdução de ADN estranho activa a via do receptor de tipo Toll 9 (TLR9) que conduz à produção de citocinas e 5,6 de óxido nítrico. Estes macrófagos activados podem então ser menos sensível ao tratamento que os investigadores pretende examinar.
O nosso laboratório transfects rotineiramente a linha celular RAW264.7 de macrófagos com genes repórter da luciferase, e temos desenvolvido um protocolo que seja robusto o suficiente para que o sinal de luciferase significativamente mais elevada do que o fundo, mas também suficientemente suave para os macrófagos para permanecer no seu estado de repouso. Os comportamentos das células transfectadas foram avaliados por um gene repórter de luciferase de pirilampo-abrigando a região de promotor de IκBζ (pGL3- IκBζ). IκBζ expressão é regulada positivamente pelo lábio componente da parede celular bacterianaopolyssacharide (LPS) 7,8, e regulados negativamente pela citocina anti-inflamatória, interleucina-10 (IL-10) 8. Para ter em conta a variação entre os poços de transfecção, que co-transfectar um plasmídeo controlo que contém o gene da luciferase de Renilla (por exemplo, phRL-TK) para fins de normalização. O protocolo descrito foi optimizado depois de testar vários parâmetros, incluindo a temporização da transfecção, do tipo de reagentes de transfecção, as quantidades de reagentes de transfecção de ADN e o plasmídeo, bem como a relação de reagente de transfecção de plasmídeo de ADN. Os dois reagentes de transfecção incluídos neste protocolo são (1) um reagente de transfecção à base de lípidos e (2) um / reagente de transfecção à base de poliamina proteína.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. O plasmídeo de ADN A purificação
- Extrair ADN de plasmídeo utilizando um kit maxiprep de acordo com o protocolo do fabricante. Ressuspender o ADN do plasmídeo em 500 ul de tampão TE.
- Execute um fenol: clorofórmio: álcool isoamílico extração e precipitação com isopropanol para remover contaminantes bacterianos residuais. A presença de LPS interfere com transfecção 9.
- Adicionar 500 ul de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25: 24: 1, pH 8) para o ADN de plasmídeo e agitar vigorosamente durante 15 segundos. Fenol provoca queimaduras graves na pele e é um anestésico assim queimaduras não são sempre senti até que haja danos graves. Execute fenol: extração isoamyl no exaustor e tome cuidado: clorofórmio.
- Incubar a mistura durante 5 minutos à temperatura ambiente. Centrifugar a 13.000 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Transferir 350 ul da fase aquosa superior num novo tubo de recolha de 1,5 ml.
- Adicionar 350 ul de tampão TE para o tubo que contém a fase orgânica inferior. Agita-se vigorosamente durante 15 segundos. Centrifugar a 13000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Transferir 350 ul da fase aquosa superior para o mesmo tubo de recolha de 1,5 ml.
- Adicionar 70 ul de acetato de sódio 3 M (pH 5,2) e misture bem. Adicionar 700 mL de isopropanol a 100%. Misturar bem e incubar durante 10 min à temperatura ambiente. Centrifugar a 13.000 xg durante 10 minat 4 ° C. Remover o sobrenadante.
- Adicionar 500 ul de etanol a 75% ao sedimento. Amostras Vortex para misturar e centrifugar a 5000 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante. ADN é no pelete.
- Abrir a tampa do tubo de ar e secar o sedimento à temperatura ambiente durante 5 - 10 min. A pelete deve tornar-se translúcido. Adicionar 500 ul de tampão TE para ressuspender o sedimento de DNA. Aquece-se a 50 - 60 ° C durante 10 min para dissolver o sedimento de DNA.
- Medir a absorvância a 260 nm (A260) e a 280 nm (A280) com um espectrómetro. Calcula-se a concentração de ADN pela multiplicação do valor de A260 de 50 ng / ul. Avaliar a qualidade do DNA por calculating a razão A260 / A280. DNA com alta qualidade deve dar uma razão A260 / A280 de 1,8-2,0.
2. A cultura celular e Sementeira
- Células RAW264.7 Culturas em DMEM suplementado com 9% de soro fetal de vitelo (DMEM / 9% de FCS) em uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2. Durante cada passagem, separar as células a partir da placa por pipetagem contínua, usando uma pipeta de Pasteur. Passage as células a cada dois dias, e semear 1,5-2.000.000 células em um prato de cultura de tecidos tratados 10 centímetros como o estoque. Descongelar um novo estoque de células a cada 5-6 semanas.
- No dia da transfecção, as sementes 200.000 células por poço numa placa de 24 poços num volume de 500 ul de DMEM / 9% de FCS. Incubam-se as células durante 4 horas na temperatura de 37 ° C incubadora.
- Ou transfectar células com o reagente à base de lípidos (passo 3.1) ou o reagente à base de poliamina-proteína / (passo 3.2).
3. Transfecção
- Transfecção à base de lípidos:
- Aqueça o Reagen transfecçãot até à TA no escuro. Aquece-se meio isento de soro e meio DMEM / 9% de FCS a 37 ° C.
- Adicionar 0,5 ug de ADN de plasmídeo e 50 uL de meio isento de soro em um tubo de 1,5 ml. Adicionar 2 l de reagente de transfecção com a ponta da pipeta abaixo da superfície do líquido. Vortex por 6 s.
- Deixar a mistura de reagente / ADN no escuro à temperatura ambiente durante 30 min.
- Durante os 30 minutos de incubação, remova a mídia do bem e adicionar 250 mL de fresco DMEM / FCS 9% a cada poço.
- Após 30 min, adicionar 250 ul de DMEM / FCS a 9% à mistura reagente / ADN. Misture bem, pipetando cima e para baixo.
- Adicionar 300 ul da mistura diluída para cada poço. Incubar durante 2-4 horas numa temperatura de 37 ° C, 5% de CO2.
- Remover solução de transfecção e adicionar 500 ul de DMEM / 9% de FCS. Incubar durante 24-48 h num banho a 37 ° C, 5% de CO2 antes da estimulação das células.
- Proteína / transfecção com base em poliamina:
- Aqueça-se livre de soroe meio DMEM / 9% de FCS a 37 ° C.
- Adicionar 0,75 mL de reagente de transfecção de 18,75 ul de meio isento de soro. Vortex brevemente para misturar. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Adicionar 0,5 uL de 1 ug / ul de ADN no reagente transfectadas diluída. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
- Durante a incubação de 10 min, remover o meio de cada poço da placa de 24 cavidades e adicionar 250 ul de DMEM fresco / 9% de FCS a cada poço.
- Após 10 min, adicionar 250 ul de DMEM / FCS a 9% na mistura reagente / ADN.
- Adicionar 270 ul da mistura diluída para o poço. Incubar em 37 ° C e 5% de CO2 durante 2-4 horas.
- Remover solução de transfecção e adicionar 500 ul de DMEM / 9% de FCS. Incubar durante 24-48 h num banho a 37 ° C, 5% de CO2.
4. Estimulação celular e ensaio de luciferase
- Substituir mídia nos bem com 250 ul de DMEM fresco / 9% FCS.
- Adicionar 50 ul de LPS ou LPS + IL-10 Nas concentrações desejadas no bem. E volta a placa para a temperatura de 37 ° C, 5% de CO2. Estimular para 2-6 horas.
- Remover solução estimulação por aspiração, lava-se com PBS arrefecido em gelo, e adicionar 200 ul de 1x tampão de lise passivo. Rocha à temperatura ambiente durante 30 min. Raspar e transferir o lisado para tubos de 1,5 ml e remover os detritos celulares por centrifugação a 20.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Transferir 40 uL de ligado clarificado (sobrenadante) para um branco, claro fundo placa de 96 cavidades para a determinação de sinais de luciferase de acordo com o protocolo do fabricante.
- Ler o sinal de luciferase com um luminómetro em todo o espectro de luz visível.
Análise 5. Dados
- Calcular o pirilampo: rácio de Renilla dividindo os valores individuais da luciferase do pirilampo por os valores de Renilla luciferase de cada poço.
- Calcule a variação vezes dividindo o vaga-lume: Renilla razão do bem tratados pelosque do poço não tratado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A Figura 1 compara a eficiência da transfecção dos dois reagentes de transfecção em RAW264.7. O reagente à base de lípidos deu tipicamente cerca de 25% a taxa de transfecção, enquanto a transfecção com base em poliamina proteína / resultou em cerca de 5% de eficiência (Figura 1A). A diferença na eficiência de transfecção foi também observada em sinais de luciferase em células RAW264.7 transfectadas com o repórter do promotor pGL3-IκBζ (Figura 1B). A adição de LPS para estas células transfectadas aumentado sinal da luciferase do pirilampo, uma indicação directa do aumento da actividade de transcrição do promotor repórter IκBζ. Em outras palavras, os resultados sugerem que o LPS regulada positivamente a expressão do gene IκBζ, consistentes com relatos anteriores 7,8. A Figura 2 mostra os resultados típicos obtidos nas nossas experiências, utilizando transfecção à base de lípidos como um exemplo. Depois de obter valores de sinal individuais de filuciferase refly e luciferase de Renilla (Figuras 2A e 2B), os sinais de luciferase do pirilampo foram normalizados para o sinal de luciferase de Renilla (Figura 2C). A normalização é recomendado devido à variação poço-a-poço da eficiência de transfecção. Para determinar se as condições de tratamento (LPS ou LPS + IL-10) alterou os sinais repórter, a firefly: rácio de Renilla (isto é, os sinais normalizados) dos grupos de tratamento foram comparados com o do não tratado (não estimulada) da amostra (Figura 2D ). Os nossos dados mostraram que o tratamento de células com LPS RAW264.7 regulada positivamente a actividade do promotor repórter pGL3-IκBζ, indicando que o LPS aumentou o nível de transcrição do gene IκBζ. Na presença de IL-10, o promotor repórter IκBζ tinha menor actividade, sugerindo que a IL-10 foi capaz de inibir a transcrição induzida por LPS do gene IκBζ. A / transfecção com base em poliamina proteína normalmentederam valores mais baixos em ambos luciferase de pirilampo e Renilla luciferase sinais. A Figura 3 compara o comprimento de tempo de repouso entre a transfecção e a estimulação (24 h ou 48 h), e mostra que os sinais de luciferase diminuiu ao longo do tempo. A diminuição do sinal de não interferir com a interpretação dos dados, quando o reagente de transfecção à base de lípidos foi usado (Figura 3A); indução por LPS e inibição por IL-10 ainda foram observados após 48 horas de descanso. No entanto, a diminuição do sinal foi mais significativa quando a / o reagente de transfecção à base de poliamina proteína foi usado (Figura 3B), especialmente os sinais de luciferase Renilla. Como resultado, a diferença entre os grupos de tratamento não foi observada após um repouso de 48 horas.
Um efeito indesejável de transfecção é a morte celular de modo que o impacto de cada método de transfecção com o grau de apoptose foi avaliada. As células foram transfectadas, ou não, e submetido a Anexina-V e iodeto de propídio (PI)coloração. Os lisados preparados a partir destas células também foram analisadas para a presença de ADP ribose polimerase (PARP) poli proteína intacta e clivada. A análise de citometria de fluxo das células Anexina-V / PI coradas sugerido que a transfecção à base de lípidos aumentou ligeiramente a proporção de células positivas para a Anexina-V, em comparação com as células não transfectadas, enquanto a transfecção com base em poliamina proteína / não (Figura 4A) . De igual modo, baseada em lípidos a transfectadas aumentou ligeiramente a proporção de PARP clivada enquanto que a transfecção com base em poliamina proteína / não (Figura 4B). No entanto, apesar de os números elevados de células apoptóticas, a morfologia das células por microscopia de luz não se alterou (Figura 4C). Mais importante ainda, a resposta biológica das células transfectadas à base de lípidos permaneceu idênticos aos das células não transfectadas (Figura 4D). As células foram estimuladas com LPS ± IL-10, e as quantidades de TNF ^5; segregado para o sobrenadante da cultura foi quantificado por ELISA. Tanto as células transfectadas e não transfectadas feita à base de lipidos quantidades similares de TNF em resposta a LPS e foram inibidas pela adição de IL10. Nenhuma TNFa foi feito quando as células não foram estimuladas (Figura 4D), sugerindo que as células permaneceram naïve após a transfecção.
Figura 1. A transfecção baseada em lípidos deu uma eficiência mais elevada do que a transfecção / transfecção com base em poliamina proteína. (A) As células foram transfectadas RAW264.7 um plasmídeo que expressa GFP, quer com os baseados em lípidos ou os reagentes de transfecção à base de poliamina proteína /. Sinal de GFP foi medida por citometria de fluxo após 24 h. (B) As células foram transfectadas com RAW264.7 o repórter do promotor pGL3-IkBζ. Após 48 horas de descanso, cells foram estimuladas com LPS durante 6 h. Sinal de luciferase de pirilampo foi medida de acordo com as instruções do fabricante. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Os dados do ensaio de luciferase. Típicas células RAW264.7 foram transfectadas com TK-Renilla e IkBζ promotor repórter. Após 24 horas de repouso, as células foram estimuladas com LPS ± IL-10 durante 2 h. (A) da luciferase do pirilampo e (B), sinais de luciferase Renilla foram medidos de acordo com as instruções do fabricante de ensaio de luciferase. (C) a actividade repórter foi normalizado em relação ao sinal de TK-Renilla e representada graficamente em relação Firefly / Renilla. (D) Fold mudança é calculado dividindo-se ovaga-lume:. relação Renilla das amostras estimuladas por que da amostra não estimulada por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. A intensidade do sinal da luciferase é dependente do tempo. (A) transfectadas à base de lípidos e (b) células transfectadas com base em poliamina Proteína / ou foram de repouso de 24 h ou 48 h antes da estimulação com LPS ± IL-10 durante 2 h. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O protocolo descrito aqui não incidir exclusivamente sobre a eficiência de transfecção, mas tem o objetivo de estabelecer um equilíbrio entre eficiência e preservação dos estados fisiológicos das células. Especificamente, o nosso procedimento consegue minimizar a toxicidade do reagente de transfecção e maximização de sinal da luciferase.
Um passo essencial no protocolo é a saúde das células. Culturas crescidas não são adequados para a transfecção quanto suas alterações fisiologia, e cultura contínua de células RAW264.7 por um longo período de tempo pode também alterar o fenótipo e função das células 10. Células recém-descongeladas que têm um número baixo passagem são recomendados para uso para a transfecção.
Outra consideração importante é a escolha de reagentes de transfecção. Os reagentes de transfecção à base de lípidos são tipicamente utilizados em pesquisa, devido à sua facilidade de utilização e à disponibilidade comercial. No entanto, alguns destes reagentes causada unintended (e geralmente não desejado) mudanças na expressão gênica global em células transf 11,12. Para resolver este problema, as células são incubadas unicamente com os reagentes de transfecção durante algumas horas, em vez de o típico O / N ou um reagente à base de não-lipídico é escolhido para a transfecção. Maior tempo de incubação com o reagente de transfecção aumenta a eficiência de transfecção, mas também pode ser prejudicial para as células de ou causando a morte celular ou a activação das células, ambos os quais podem interferir com o desenho experimental. As Figuras 4A e 4B mostram que a proteína / polyamine- transfecção baseado não causar apoptose ou necrose, em comparação com células não transf ectadas. A transfecção à base de lípidos, até mesmo com o tempo de incubação curto, causou maior nível de morte celular. Ele está correlacionada com a maior eficiência de transfecção do reagente de transfecção à base de lípidos. No entanto, quando as células transf ectadas foram observadas ao microscópio, não houve alteração morfológica notávels (Figura 4C). Os macrófagos activados normalmente adoptar uma forma extensa, mas tanto as células não transfectadas e transfectadas não mostrou sinais de activação antes da estimulação, indicando que eles estavam no seu estado de repouso. Além disso, as células transfectadas responderam de forma semelhante a LPS e IL-10 como a estimulação as células não transfectadas (Figura 4D). Estas observações indicam coletivamente que este procedimento de transfecção não altera o comportamento natural das células.
O tempo entre a transfecção e tratamento experimental (o tempo de repouso) é também crucial. Tempo suficiente deve ser dada para os genes de luciferase para expressar e para as células para restabelecer seu estado de repouso; No entanto, um longo incubação podem reduzir sinais de luciferase, especialmente quando a eficiência de transfecção não é alta.
O procedimento aqui descrito é aplicável para o gene repórter de luciferase específica usada no nosso laboratório. Pequenos ajustes serão needed quando outro repórter é usado. Parâmetros que precisam ser testados incluem diferente repórter da luciferase do pirilampo: rácio de luciferase de Renilla, o resto do tempo entre a transfecção e tratamento, e as condições de tratamento. Uma proporção de 50: 1 de pGL3-IκBζ: phRL-TK é normalmente utilizado, mas a razão pode variar de 1: 1 a 100: 1. Verificou-se que um repouso de 24 horas entre a remoção da solução de transfecção das células e o início do tratamento experimental deu o melhor sinal. Após 48 horas, sinais luciferase começou a declinar, e as diferenças entre os grupos de tratamento foram reduzidos ou mesmo suprimidos.
O procedimento de transfecção descrito não se limita a ensaios de repórter de luciferase. Outros projetos experimentais que não precisam de uma população homogênea serão beneficiados; por exemplo, microscopia fluorescente que se baseia na observação de células individuais. Uma desvantagem será para localizar as células transfectadas com sucesso entre contrapartes não transfectadas, mas obenefícios de ser menos demorado e trabalhoso pode ser mais desejado. Nos casos em que são preferidas linhas celulares estáveis, o nosso protocolo proporciona uma média para as experiências iniciais em que procedimento experimental pode ser optimizadas quando as linhas de células estáveis são gerados.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Life Technologies | K210007 | Any maxiprep kit will work |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Life Technologies | 15593-049 | Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container. |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30396.03 | Inactivated at 56 °C water bath for 45 min before use. |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Warm to at least room temperature before use. |
| XtremeGene HP DBA transfection reagent | Roche | 6366236001 | Warm to room temperature before use. |
| GeneJuice | EMD Millipore | 70967 | Warm to room temperature before use. |
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E1941 | 30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 |
References
- Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10 (1), 9-18 (2010).
- Thompson, C. D., Frazier-Jessen, M. R., Rawat, R., Nordan, R. P., Brown, R. T. Evaluation of methods for transient transfection of a murine macrophage cell line RAW 264.7. Biotechniques. 27 (4), 824-835 (1999).
- Kim, T., Eberwine, J. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Stacey, K. J., Sweet, M. J., Hume, D. A. Macrophages ingest and are activated by bacterial DNA. Journal of immunology. 157 (5), 2116-2122 (1996).
- Jiang, W., Reich, I. C., Pisetsky, D. S. Mechanisms of activation of the RAW264.7 macrophage cell line by transfected mammalian DNA. Cell Immunol. 229 (1), 31-42 (2004).
- Jiang, W., Pisetsky, D. S. The induction of HMGB1 release from RAW 264.7 cells by transfected DNA. Mol Immunol. 45 (7), 2038-2046 (2008).
- Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-147 (2009).
- Cheung, S. T., So, E. Y., Chang, D., Ming-Lum, A., Mui, A. L. Interleukin-10 inhibits lipopolysaccharide induced miR-155 precursor stability and maturation. PLoS One. 8 (8), e71336 (2013).
- Weber, M., Moller, K., Welzeck, M., Schorr, J. Short technical reports. Effects of lipopolysaccharide on transfection efficiency in eukaryotic cells. Biotechniques. 19 (6), 930-940 (1995).
- Berghaus, L. J., et al. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 33 (5), 443-456 (2000).
- Fiszer-Kierzkowska, A., et al. Liposome-based DNA carriers may induce cellular stress response and change gene expression pattern in transfected cells. BMC Mol Biol. 12 (1), 27-36 (2011).
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (7), 617-626 (2009).
