Transfektion RAW264.7 Celler med en luciferasereportergen

Introduction

Transfektion af nukleinsyrer i celler har et mangfoldigt program i videnskabelig forskning. Eksempler indbefatter (1) reportergener at undersøge rollen af ​​de forskellige gen-elementer i gen-ekspression, (2) protein ekspressionsplasmider at overudtrykke proteinet af interesse, og (3) små interfererende RNA at nedregulere genekspression. Ved at manipulere ekspressionsniveauet af bestemte gener og måle forskellen virkningen af ​​sådanne manipulationer kan forskerne udlede de genfunktioner i de udvalgte biologiske systemer. Ikke alle transfektionsfremgangsmåder giver samme transfektionseffektiviteter, og selv den samme transfektion metode ikke transficere alle celletyper ligeligt ^1. Derfor er der blevet udviklet forskellige transfektionsmetoder, såsom calciumphosphat-metoden, DEAE-dextran, kationisk lipid transfektion, kationisk ikke-lipid polymer transfektion, elektroporering og nucleofection ^2,3.

Transfektion ind makrofager er ESPEcielt vanskelig på grund af det faktum, at makrofager er professionelle fagocytter, der er meget følsomme over for fremmede materialer herunder bakterier afledt (methyleret) DNA ^4. Introduktion af fremmed DNA aktiverer Toll-like receptor 9 (TLR9), der fører til produktion af cytokiner og nitrogenoxid ^5,6. Disse aktiverede makrofager kan så være mindre lydhøre over for behandling, at forskerne har til hensigt at undersøge.

Vores laboratorium rutinemæssigt transfects den RAW264.7 makrofagcellelinie med luciferase reportergener, og vi har udviklet en protokol, der er robust nok til at have luciferase signal betydeligt højere end baggrunden, men også blide nok til makrofager til at forblive på deres hviletilstand. Adfærd af de transficerede celler blev evalueret af en ildflue-luciferase reportergen huser promotorregionen af ​​IκBζ (pGL3- IκBζ). IκBζ udtryk opreguleres af den bakterielle cellevæg komponent læbeopolyssacharide (LPS) ^7,8, og nedreguleres af anti-inflammatoriske cytokin, interleukin-10 (IL-10) ^8. At tage højde for transfektion variation blandt brønde, vi co-transficere en kontrol plasmid indeholdende Renilla-luciferase-genet (f.eks phRL-TK) til normaliserings- formål. Den beskrevne protokol er optimeret efter afprøvning af forskellige parametre, herunder timingen af ​​transfektion, type transfektionsreagenser, mængderne af transfektionsreagenser og plasmid-DNA, såvel som forholdet mellem transfektionsreagens til plasmid-DNA. De to transfektionsreagenser inkluderet i denne protokol er (1) en lipid-baserede transfektionsreagens og (2) et protein / polyamin-baserede transfektionsreagens.

Protocol

1. Plasmid-DNA Purification

1. Ekstrahere plasmid-DNA under anvendelse af et maxiprep kit ifølge producentens protokol. Resuspender plasmid-DNA i 500 pi TE-buffer.
2. Udfør en phenol: chloroform: isoamylalkohol-ekstraktion og isopropanol udfældning at fjerne resterende bakterielle kontaminanter. Tilstedeværelsen af LPS forstyrrer transfektion ^9.
   1. Tilføj 500 pi phenol: chloroform: isoamylalkohol (25: 24: 1, pH 8) til plasmid-DNA og rystes kraftigt i 15 sekunder. Phenol forårsager alvorlige forbrændinger og er et bedøvelsesmiddel, så forbrændinger ikke altid følt, indtil der er alvorlige skader. Udfør phenol: chloroform: isoamyl udsugning i stinkskab og bruge forsigtighed.
3. Inkuber blandingen i 5 minutter ved stuetemperatur. Centrifuger ved 13.000 xg i 10 minutter ved stuetemperatur. Overføre 350 pi øvre vandige fase overføres til et nyt 1,5 ml opsamlingsrør.
4. Tilføj 350 pi TE-buffer til røret, der indeholder den nedre organiske fase. Rystes kraftigt i 15 sekunder. Centrifuger ved 13.000 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Overføre 350 pi øvre vandige fase til den samme 1,5 ml opsamlingsrør.
5. Tilføje 70 pi 3 M natriumacetat (pH 5,2) og blandes godt. Tilføj 700 pi 100% isopropanol. Bland godt og inkuber 10 minutter ved stuetemperatur. Centrifuger ved 13.000 xg i 10 minat 4 ° C. Fjern supernatanten.
6. Tilsættes 500 pi 75% ethanol til pelleten. Vortex prøver at blandes og centrifugeres ved 5.000 xg i 5 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten. DNA er i pelleten.
7. Åbn hætten af ​​røret og lufttørre pillen ved RT i 5 - 10 min. Pelleten bør blive gennemskinnelig. Tilsættes 500 pi TE-buffer for at opblande DNA-pelleten. Der opvarmes til 50-60 ° C i 10 minutter for at opløse DNA-pelleten.
8. Absorbansen ved 260 nm (A260) og 280 nm (A280) med et spektrometer. Beregning af koncentrationen af ​​DNA ved at gange A260 værdi med 50 ng / pl. Vurdere kvaliteten af ​​DNA ved calculating A260 / A280-forhold. DNA med høj kvalitet bør give et A260 / A280-forhold på 1,8 til 2,0.

2. Cell Dyrkning og Seeding

1. Kultur RAW264.7-celler i DMEM suppleret med 9% føtalt kalveserum (DMEM / 9% FCS) i et 37 ° C, 5% _CO2 inkubator. Under hver passage, løsne cellerne fra pladen ved kontinuerlig pipettering under anvendelse af en Pasteur-pipette. Passage cellerne hver 2 dage, og frø 1,5-2.000.000 celler på en 10 cm vævskulturbehandlede skålen som bestanden. Tø en ny bestand af celler hver 5 - 6 uger.
2. På dagen for transfektion frø 200.000 celler per brønd i en 24-brønds plade i et volumen på 500 pi DMEM / 9% FCS. Inkubér cellerne i 4 timer i 37 ° C inkubator.
3. Transficere celler enten med lipid-baserede reagens (trin 3.1) eller protein / polyamin-baseret reagens (trin 3.2).

3. Transfektion

1. Lipidbaseret transfektion:
   1. Varm op transfektionsblandingen reagent til stuetemperatur i mørke. Varme op serum-frit medium og DMEM / 9% FCS til 37 ° C.
   2. Tilsæt 0,5 ug plasmid-DNA til 50 pi serum-frit medium i et 1,5 ml rør. Tilsæt 2 pi transfektionsreagens med pipettespidsen under overfladen af ​​væsken. Vortex i 6 sek.
   3. Forlade reagens / DNA-blandingen i mørke ved stuetemperatur i 30 minutter.
   4. Under den 30 minutters inkubation, fjerne mediet fra brønden, og der tilsættes 250 pi frisk DMEM / 9% FCS til hver brønd.
   5. Efter 30 min tilsættes 250 ul DMEM / 9% FCS til reagenset / DNA-blandingen. Bland godt ved pipettering op og ned.
   6. Der tilsættes 300 pi af den fortyndede blanding til hver brønd. Der inkuberes i 2 - 4 timer i en 37 ° C, 5% _CO2 inkubator.
   7. Fjern transfektion og der tilsættes 500 pi DMEM / 9% FCS. Der inkuberes i 24-48 timer i en 37 ° C, 5% _CO2 inkubator før cellestimulering.
2. Protein / polyamin-baseret transfektion:
   1. Varme op serumfritmedium og DMEM / 9% FCS til 37 ° C.
   2. Tilføj 0,75 pi transfektionsreagens til 18,75 pi serum-frit medium. Vortex kort at blande. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min. Tilsæt 0,5 pi 1 pg / pl DNA i den fortyndede transficerede reagens. Inkuber ved stuetemperatur i 10 min.
   3. Under 10 min inkubation fjernes mediet fra hver brønd af 24-brønds plade og tilsæt 250 pi frisk DMEM / 9% FCS til hver brønd.
   4. Efter 10 min tilsættes 250 ul DMEM / 9% FCS ind i reagens / DNA-blandingen.
   5. Tilføj 270 pi af den fortyndede blanding til brønden. Inkuber i et 37 ° C og 5% _CO2 inkubator i 2 - 4 timer.
   6. Fjern transfektion og der tilsættes 500 pi DMEM / 9% FCS. Der inkuberes i 24-48 timer i en 37 ° C, 5% _CO2 inkubator.

4. cellestimulering og Luciferase Assay

1. Erstatte medier i brønd med 250 pi frisk DMEM / 9% FCS.
2. Der tilsættes 50 pi LPS eller LPS + IL-10 Ved de ønskede koncentrationer til brønden. Returnere pladen til 37 ° C, 5% _CO2 inkubator. Stimulere til 2 - 6 timer.
3. Fjern stimulation opløsning ved aspiration, vask med iskold PBS, og der tilsættes 200 pi 1x Passive Lysis Buffer. Rock ved stuetemperatur i 30 min. Skrabe og overføre lysat til 1,5 ml rør og fjerne cellerester ved centrifugering ved 20.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
4. Overførsel 40 pi klaret lysat (supernatant) til en hvid, klar bund plade med 96 brønde til bestemmelse af luciferase signaler ifølge producentens protokol.
5. Læs luciferase signal med et luminometer tværs af hele det synlige lysspektrum.

5. Data Analysis

1. Beregn ildflue: Renilla-forhold ved at dividere individuelle værdier for ildflueluciferase ved værdierne af Renilla-luciferase fra hver brønd.
2. Beregn gange ændring ved at dividere den ildflue: Renilla forholdet mellem den behandlet godt afden for den ubehandlede brønd.

Representative Results

Figur 1 sammenligner transfektionseffektiviteten af de to transfektionsreagenser i RAW264.7. Lipid-baserede reagens typisk gav omkring 25% transfektion sats mens protein / polyamin-baseret transfektion resulterede i% effektivitet omkring 5 (figur 1A). Forskellen i transfektionseffektiviteten blev også observeret i luciferase signaler i RAW264.7-celler transficeret med pGL3-IκBζ promoter reporter (figur 1B). Tilsætning af LPS på disse transficerede celler steg ildflueluciferase signal, en direkte indikation af øget transkription aktivitet af IκBζ promotoren reporter. Med andre ord resultaterne antydede, at LPS opreguleres ekspressionen af IκBζ genet, i overensstemmelse med tidligere rapporter ^7,8. Figur 2 viser de typiske resultater opnået i vore forsøg, under anvendelse af lipid-baserede transfektion som eksempel. Efter opnåelse af individuelle signalværdier fra firefly luciferase og Renilla luciferase (figur 2A og 2B), de ildflue-luciferase-signaler blev normaliseret til Renilla-luciferase signal (figur 2C). Normalisering anbefales på grund af brønd-til-brønd variation i transfektionseffektiviteten. For at bestemme om behandlingsbetingelserne (LPS eller LPS + IL-10) ændrede reporter signaler, Firefly: Renilla-forhold (dvs. de normaliserede signaler) af behandlingsgrupperne blev sammenlignet med den for ubehandlede (ustimulerede) prøve (figur 2D ). Vores data viser, at behandling RAW264.7-celler med LPS opreguleres aktiviteten af ​​pGL3-IκBζ promoter reporter, hvilket indikerer, at LPS forøgede transkriptionen af ​​den IκBζ genet. I nærværelse af IL-10, den IκBζ promotoren reporter havde lavere aktivitet, hvilket antyder, at IL-10 kunne inhibere LPS-induceret transkription af IκBζ genet. Protein / polyamin-baseret transfektion sædvanligvisgav lavere værdier i både ildflue-luciferase og Renilla luciferase signaler. Figur 3 sammenligner længden af hviletiden mellem transfektion og stimulering (24 timer eller 48 timer), og viser, at luciferase signaler faldt over tid. Faldet i signal ikke forstyrre datafortolkning når lipidbaserede transfektionsreagens blev anvendt (figur 3A); induktion med LPS og inhibering af IL-10 blev stadig observeret efter 48 timers hvile. Imidlertid faldet i signalet var mere markant, når proteinet / polyamin-baserede transfektionsreagens blev anvendt (figur 3B), især Renilla luciferase signaler. Som et resultat blev forskellen mellem behandlingsgrupperne ikke observeret efter en 48 timers hvile.

En uønsket effekt af transfektion er celledød og indvirkningen af ​​hver transfektion metode på graden af ​​apoptose blev vurderet. Celler blev transficeret, eller ikke, og underkastet Annexin-V og propidiumiodid (PI)farvning. Lysater fremstillet ud fra disse celler blev også analyseret for tilstedeværelsen af ​​intakt og spaltet poly ADP ribose polymerase (PARP) protein. Flowcytometrisk analyse af Annexin-V / PI farvede celler antydede, at lipidbaserede transfektion steget lidt andelen af Annexin V-positive celler i sammenligning med de ikke-transfekterede celler, mens protein / polyamin-baseret transfektion ikke gjorde (figur 4A) . Tilsvarende lipidbaserede lidt transficeret øget andelen af spaltet PARP mens protein / polyamin-baseret transfektion ikke gjorde (figur 4B). Men trods de forhøjede antal apoptotiske celler, morfologien af cellerne ved lysmikroskopi ændrede ikke (figur 4C). Hvad vigtigere er, det biologiske respons af lipidbaserede transficerede celler forblev identiske med de ikke-transficerede celler (figur 4D). Cellerne blev stimuleret med LPS ± IL-10, og de mængder af TNF ^5; secerneret i kultursupernatanten blev kvantificeret ved ELISA. Både de ikke-transficerede og lipidbaserede transficerede celler fremstillet tilsvarende mængder af TNFa som reaktion på LPS og blev inhiberet ved tilsætning af IL10. Nr TNFa blev gjort når cellerne ikke var stimuleret (figur 4D) antyder, at cellerne forblev naive efter transfektion.

Figur 1. lipidbaserede transfektion gav højere transfektionseffektivitet end protein / polyamin-baseret transfektion. (A) RAW264.7-celler blev transficeret en GFP-udtrykkende plasmid med enten lipidbaserede eller protein / polyamin-baserede transfektionsreagenser. GFP signal blev målt ved flowcytometri efter 24 timer. (B) RAW264.7-celler blev transficeret med pGL3-IkBζ promoter reporter. Efter 48 timers hvile, calen blev stimuleret med LPS i 6 timer. Ildflueluciferase signal blev målt i henhold til producentens anvisninger. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Typiske luciferase assay data. RAW264.7-celler blev transficeret med TK-Renilla og IkBζ promoter reporter. Efter 24 timers hvile blev cellerne stimuleret med LPS ± IL-10 i 2 timer. (A) Firefly luciferase og (B) Renilla luciferase signaler blev målt ifølge luciferaseanalyse producentens anvisninger. (C) Reporter aktivitet blev normaliseret til TK-Renilla signal og plottet som Firefly / Renilla-forhold. (D) Fold ændring beregnes ved at dividereildflue:. Renilla forholdet mellem de stimulerede prøver ved den for ustimulerede prøve Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Styrken af luciferase signal er tidsafhængig. (A) lipidbaserede transficeret og (B) Protein / polyamin-baserede transficerede celler blev hvile i enten 24 timer eller 48 timer før stimulering med LPS ± IL-10 i 2 timer. Klik her for at se en større version af dette tal.

(A) RAW264.7-celler blev transficeret med IkBζ promoter reporter. Efter 24 timers hvile, blev celledød vurderet ved Annexin-V og propidiumiodid (PI) farvning på et flowcytometer. (B) Transficerede celler blev underkastet immunblotting analyse for PARP (fuld længde og spaltes) og GAPDH (lastning kontrol). Båndintensiteter blev derefter kvantificeres ved hjælp imaging software. L = lipidbaseret transfektion, P = protein / polyamin-baseret transfektion, STP = 0,1 uM staurosporin. (C) Mikroskop billeder af celler transficeret med lipid-baserede transfektionsreagens. (D) Celler transficeret med lipid-baserede transfektionsreagens blev stimuleret med LPS ± IL-10 i 6 timer, og niveauerne af de pro-inflammatoriske cytokin TNF blev målt under anvendelse af ELISA. Venligst klik hanre at se en større udgave af dette tal.

Discussion

Protokollen beskrevet her ikke udelukkende fokusere på transfektion effektivitet, men har til formål at finde en balance mellem effektivitet og bevarelse af de fysiologiske tilstande af cellerne. Specifikt vores procedure lykkes med at minimere toksiciteten af ​​transfektionsreagens og maksimere luciferase signal.

Et afgørende skridt i protokollen er sundhed af cellerne. Tilgroet kulturer er ikke egnede til transfektion som deres fysiologi forandringer, og kontinuerlig dyrkning af RAW264.7-celler i en længere tidsperiode kan også ændre fænotypen og funktion af cellerne ^10. Frisk optøede celler, der har en lav passage nummer anbefales at bruge til transfektion.

En anden vigtig overvejelse er valget af transfektionsreagenser. Lipid-baserede transfektionsreagenser anvendes typisk i forskning på grund af sin brugervenlighed og kommercielle tilgængelighed. Imidlertid har nogle af disse reagenser forårsaget unintended (og som regel uønsket) ændringer i den globale genekspression i transficerede celler ^11,12. For at løse dette problem, er cellerne kun inkuberet med transfektionsreagenser i et par timer i stedet for den typiske O / N, eller et ikke-lipid-baserede reagens er valgt til transfektion. Længere inkubationstid med transfektionsreagens vil øge transfektionseffektivitet, men det kan også være skadelige for cellerne enten forårsager celledød eller celleaktivering, som begge kan forstyrre det eksperimentelle design. Figurerne 4A og 4B viser, at proteinet / polyamine- baseret transfektion forårsagede ikke apoptose eller nekrose, sammenlignet med utransficerede celler. Lipid-baserede transfektion, selv med den korte inkubationstid, forårsagede højere niveau af celledød. Det er korreleret til højere transfektionseffektivitet af lipidbaserede transfektionsreagens. Men når de transficerede celler blev observeret under mikroskop, der var ingen bemærkelsesværdige morfologisk ændrings (figur 4C). Aktiverede makrofager normalt vedtage en sprællende form, men både de utransficerede og transficerede celler viste ikke tegn på aktivering forud for stimulation, hvilket indikerer, at de var i deres hvile stater. Desuden svarede de transficerede celler på samme måde som LPS og IL-10-stimulering som de ikke-transficerede celler (figur 4D). Disse observationer kollektivt indikerer, at denne transfektion procedure ikke ændrer cellernes naturlige adfærd.

Tiden mellem transfektion og eksperimentel behandling (resten tid) er også afgørende. Nok tid skal gives til de luciferase gener til at udtrykke og for cellerne at genetablere deres hviletilstand; dog kan en lang inkubation reducere luciferase signaler, især når transfektionseffektivitet er ikke høj.

Proceduren her gælder det specifikke luciferasereportergenet anvendes i vores laboratorium. Mindre justeringer vil være needed når en anden reporter anvendes. Parametre, der skal testes omfatter forskellige ildflueluciferase reporter: Renilla luciferase ratio, resten tid mellem transfektion og behandling, og behandling betingelser. A 50: 1-forhold mellem pGL3-IκBζ: phRL-TK anvendes typisk, men forholdet kan ligge i området fra 1: 1 til 100: 1. Det konstateredes, at en 24 timers hvile mellem fjernelsen af ​​transfektion opløsning fra cellerne og starten af ​​eksperimentel behandling gav det bedste signal. Efter 48 timer, begyndte luciferase signaler faldende, og forskellene mellem behandlingsgrupper blev reduceret eller endog afskaffet.

Den beskrevne transfektion procedure er ikke begrænset til luciferase reporter assays. Andre eksperimentelle design, der ikke har brug for en homogen befolkning vil blive nydt; for eksempel, fluorescerende mikroskopi som bygger på observationer fra de enkelte celler. En ulempe er at lokalisere held transficerede celler blandt ikke-transfekterede modstykker, menfordelene ved at være mindre tidskrævende og arbejdskrævende kan mere ønsket. I tilfælde, hvor stabile cellelinjer foretrækkes, vores protokol giver en middelværdi for indledende forsøg, hvor eksperimentelle procedure kan optimeres, når stabile cellelinjer genereres.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit	Life Technologies	K210007	Any maxiprep kit will work
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol	Life Technologies	15593-049	Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container.
DMEM	Thermo Scientific	SH30243.01	Warm in 37 °C water bath before use.
Fetal bovine serum	Thermo Scientific	SH30396.03	Inactivated at 56 °C water bath for 45 min before use.
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070	Warm to at least room temperature before use.
XtremeGene HP DBA transfection reagent	Roche	6366236001	Warm to room temperature before use.
GeneJuice	EMD Millipore	70967	Warm to room temperature before use.
5x Passive Lysis Buffer	Promega	E1941	30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System
Dual Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1910