Introduction
La trasfezione di acidi nucleici nelle cellule ha un'applicazione diversificata nella ricerca scientifica. Gli esempi includono (1) geni reporter per studiare il ruolo dei diversi elementi di gene espressione genica, (2) plasmidi di espressione proteica per overexpress la proteina di interesse, e (3) small interfering RNA downregulate espressione genica. Manipolando il livello di espressione di particolari geni e misurando l'effetto differenziale di tali manipolazioni, i ricercatori possono dedurre le funzioni geniche nei sistemi biologici scelti. Non tutti i metodi di trasfezione forniscono la stessa efficienza di trasfezione, e anche lo stesso metodo di trasfezione non trasfettare tutti i tipi cellulari parimenti 1. Quindi, diversi metodi di trasfezione sono stati sviluppati come metodo di fosfato di calcio, DEAE destrano, cationico lipidi trasfezione, cationico trasfezione polimero non lipidi, elettroporazione, e nucleofection 2,3.
Transfection in macrofagi è especialmente difficile a causa del fatto che i macrofagi sono fagociti professionali che sono molto sensibili a materiali estranei, tra cui i batteri derivati (metilato) DNA 4. Introduzione di DNA estraneo attiva la via Toll-like receptor 9 (TLR9) che porta alla produzione di citochine e ossido nitrico 5,6. Questi macrofagi attivati possono quindi essere meno sensibili al trattamento che i ricercatori intendono esaminare.
Il nostro laboratorio transfects regolarmente la linea cellulare di macrofagi RAW264.7 con geni reporter luciferasi, e abbiamo sviluppato un protocollo che è abbastanza robusto per avere segnale luciferasi significativamente superiore a quello di fondo, ma anche abbastanza delicato per i macrofagi di rimanere al loro stato di riposo. I comportamenti delle cellule trasfettate sono state valutate da un gene reporter luciferasi di lucciola-ospitare la regione del promotore di IκBζ (pGL3- IκBζ). Espressione IκBζ è upregulated dalla parete cellulare batterica componente labbroopolyssacharide (LPS) 7,8, e downregulated dalla citochina anti-infiammatoria, interleuchina-10 (IL-10) 8. Per tenere conto delle variazioni trasfezione tra pozzi, abbiamo co-trasfettare un plasmide di controllo che contiene il gene della luciferasi Renilla (ad esempio, phRL-TK) a fini di normalizzazione. Il protocollo descritto è ottimizzato dopo test vari parametri tra cui tempi di trasfezione, tipo di reagenti di trasfezione, quantità di reagenti e trasfezione di DNA plasmidico, così come rapporto di reagente di trasfezione di DNA plasmidico. I due reagenti di trasfezione compresi in questo protocollo sono (1) un reagente di trasfezione base lipidica e (2) una proteina / basato poliammina-trasfezione reagente.
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Protocol
1. plasmide DNA Purification
- Estrarre DNA plasmidico utilizzando un kit maxiprep secondo il protocollo del produttore. Risospendere plasmide DNA in 500 ml di tampone TE.
- Eseguire un fenolo: cloroformio: estrazione di alcool isoamilico e isopropanolo precipitazioni per rimuovere i contaminanti batterici residue. La presenza di LPS interferisce con trasfezione 9.
- Aggiungere 500 ml di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25: 24: 1, pH 8) al DNA plasmide e agitare energicamente per 15 sec. Fenolo provoca gravi ustioni cutanee ed è un anestetico così ustioni non sono sempre sentito fino a quando vi è un danno grave. Eseguire fenolo: estrazione isoamilico nella cappa e usare cautela: cloroformio.
- Incubare la miscela per 5 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare a 13.000 xg per 10 min a RT. Trasferire 350 ml di fase acquosa superiore in una nuova provetta di raccolta da 1,5 ml.
- Aggiungere 350 microlitri di tampone TE alla provetta che contiene la fase organica inferiore. Agitare energicamente per 15 sec. Centrifugare a 13.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Trasferire 350 ml di fase acquosa superiore allo stesso tubo di raccolta da 1,5 ml.
- Aggiungere 70 ml di 3 M acetato di sodio (pH 5.2) e mescolare bene. Aggiungere 700 ml di isopropanolo al 100%. Mescolare bene e incubare 10 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare a 13.000 xg per 10 minat 4 ° C. Rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 500 ml di etanolo al 75% al pellet. Campioni Vortex di mescolare e centrifugare a 5000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante. DNA è in pellet.
- Aprire il tappo del tubo e asciugare il pellet a temperatura ambiente per 5 - 10 min. Il pellet dovrebbe diventare trasparente. Aggiungere 500 ml di tampone TE per risospendere il pellet di DNA. Riscaldare a 50 - 60 ° C per 10 minuti per sciogliere il pellet di DNA.
- Misurare l'assorbanza a 260 nm (A260) e 280 nm (A280) con uno spettrometro. Calcolare la concentrazione di DNA moltiplicando il valore A260 da 50 ng / ml. Valutare la qualità del DNA da parte calculating il rapporto A260 / A280. DNA con alta qualità dovrebbe dare un rapporto A260 / A280 di 1,8-2,0.
2. Coltura cellulare e Seeding
- Culture cellule RAW264.7 in DMEM supplementato con siero fetale di vitello 9% (DMEM / 9% FCS) a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. Durante ogni passaggio, staccare le cellule dalla piastra pipettando continuo utilizzando una pipetta Pasteur. Passage le celle ogni 2 giorni, e sementi 1,5-2.000.000 cellule su un piatto di coltura di tessuti trattati 10 centimetri come il magazzino. Scongelare un nuovo stock di cellule ogni 5-6 settimane.
- Il giorno della trasfezione, sementi 200.000 cellule per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti in un volume di 500 ml di DMEM / 9% FCS. Incubare le cellule per 4 ore in C incubatore 37 °.
- Cellule transfect sia con il reagente a base lipidica (passo 3.1) o del reattivo a base di poliammine proteine / (punto 3.2).
3. Trasfezione
- A base di lipidi trasfezione:
- Riscaldare il reagen trasfezionet a Rt nel buio. Warm up mezzo privo di siero e DMEM / 9% FCS a 37 ° C.
- Aggiungere 0,5 pg di DNA plasmidico a 50 ml di mezzo privo di siero in una provetta da 1,5 ml. Aggiungere 2 ml di reagente di trasfezione con la punta della pipetta di sotto della superficie del liquido. Vortex per 6 secondi.
- Lasciare la miscela reagente / DNA al buio a temperatura ambiente per 30 min.
- Durante la 30 min di incubazione, rimuovere il supporto dal bene e aggiungere 250 ml di fresco DMEM / 9% FCS per ogni bene.
- Dopo 30 min, aggiungere 250 ml di DMEM / 9% FCS per la miscela reagente / DNA. Mescolare bene pipettando su e giù.
- Aggiungere 300 microlitri della miscela diluita in ciascun pozzetto. Incubare per 2 - 4 ore a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
- Rimuovere la soluzione di trasfezione e aggiungere 500 ml di DMEM / 9% FCS. Incubare per 24 - 48 ore a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore prima stimolazione cellulare.
- Proteine / a base di poliammine-trasfezione:
- Warm up privo di sieromedio e DMEM / 9% FCS a 37 ° C.
- Aggiungere 0,75 ml di reagente di trasfezione a 18,75 ml di terreno privo di siero. Vortex brevemente per miscelare. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Aggiungere 0,5 ml di 1 mg / ml di DNA nel reagente transfettate diluito. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
- Durante i 10 minuti di incubazione, rimuovere il supporto da ciascun pozzetto della piastra da 24 pozzetti e aggiungere 250 microlitri DMEM fresco / 9% FCS per ogni bene.
- Dopo 10 min, aggiungere 250 ml di DMEM / 9% FCS nella miscela reagente / DNA.
- Aggiungere 270 microlitri della miscela diluita al pozzo. Incubare in un incubatore CO 2 37 ° C e 5% per 2-4 ore.
- Rimuovere la soluzione di trasfezione e aggiungere 500 ml di DMEM / 9% FCS. Incubare per 24 - 48 ore a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
4. La stimolazione cellulare e luciferasi Assay
- Sostituire media negli bene con 250 ml di fresco DMEM / 9% FCS.
- Aggiungere 50 ml di LPS o LPS + IL-10 Alle concentrazioni desiderate al pozzo. Riportare la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. Stimolare per 2-6 ore.
- Rimuovere la soluzione stimolazione mediante aspirazione, lavare con ghiaccio freddo PBS e aggiungere 200 ml di 1x Passive Lysis Buffer. Roccia a temperatura ambiente per 30 min. Raschiare e trasferire il lisato provette da 1,5 ml e rimuovere i detriti cellulari per centrifugazione a 20.000 xg per 10 min a 4 ° C.
- Trasferimento 40 ml di lisato eliminato (surnatante) a una, chiara fondo piastra a 96 pozzetti bianco per la determinazione di segnali luciferasi secondo il protocollo del produttore.
- Leggere il segnale luciferasi con un luminometro attraverso l'intero spettro della luce visibile.
Analisi 5. I dati
- Calcolare la lucciola: rapporto Renilla dividendo valori individuali di luciferasi di lucciola dai valori di Renilla luciferasi da ogni pozzetto.
- Calcolare il fold change dividendo la lucciola: Renilla rapporto tra il trattato bene daquella del pozzo non trattato.
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Representative Results
Figura 1 confronta l'efficienza di trasfezione dei due reagenti di trasfezione in RAW264.7. Il reagente a base lipidica tipicamente dato circa il 25% tasso trasfezione mentre la trasfezione basata poliammina-proteina / portato in circa il 5% di efficienza (Figura 1A). La differenza in termini di efficienza di trasfezione è stata anche osservata in segnali luciferasi in cellule RAW264.7 trasfettate con il promotore giornalista pGL3-IκBζ (Figura 1B). L'aggiunta di LPS a queste cellule trasfettate aumentato segnale lucciola luciferasi, una indicazione diretta di una maggiore attività di trascrizione del promotore giornalista IκBζ. In altre parole, i risultati suggeriscono che LPS upregulated l'espressione del gene IκBζ, coerente con precedenti rapporti 7,8. La Figura 2 mostra i risultati tipici ottenuti nei nostri esperimenti, utilizzando trasfezione base lipidica come esempio. Dopo aver ottenuto valori di segnale individuali da filuciferasi refly e Renilla luciferasi (Figure 2A e 2B), i segnali lucciola luciferasi sono stati normalizzati al segnale luciferasi Renilla (Figura 2C). La normalizzazione è raccomandato a causa di well-to-bene variazione efficienza di trasfezione. Per determinare se le condizioni di trattamento (LPS o LPS + IL-10) alterati i segnali reporter, il lucciola: rapporto di Renilla (cioè, i segnali normalizzati) dei gruppi di trattamento sono stati confrontati con quello del non trattato (non stimolate) campione (Figura 2D ). I nostri dati hanno mostrato che il trattamento con LPS cellule RAW264.7 upregulated l'attività del promotore giornalista pGL3-IκBζ, indicando che LPS aumentato il livello di trascrizione del gene IκBζ. In presenza di IL-10, il promotore giornalista IκBζ aveva minore attività, suggerendo che IL-10 era in grado di inibire LPS-indotti trascrizione del gene IκBζ. La proteina / trasfezione basata poliamina di solitodato valori più bassi sia luciferasi di lucciola e segnali luciferasi renilla. Figura 3 confronta la lunghezza del tempo di riposo tra transfezione e la stimolazione (24 ore o 48 ore), e dimostra che i segnali luciferasi diminuiscono nel tempo. La diminuzione del segnale di non interferire con l'interpretazione dei dati quando la trasfezione reattivo a base lipidica è stata utilizzata (figura 3A); induzione da LPS e inibizione da parte di IL-10 erano ancora osservata dopo 48 ore di riposo. Tuttavia, la diminuzione del segnale era più significativo quando la proteina / basato poliammina-trasfezione reagenti è stato usato (figura 3B), in particolare i segnali luciferasi Renilla. Come risultato, la differenza tra i gruppi di trattamento non è stata osservata dopo un riposo 48 hr.
Un effetto indesiderato di trasfezione è morte cellulare così è stato valutato l'impatto di ogni metodo di trasfezione sul grado di apoptosi. Le cellule sono state transfettate, o no, e sottoposte ad annessina V e propidio ioduro (PI)colorazione. I lisati preparati da queste cellule sono stati analizzati per la presenza di poli ADP ribosio polimerasi (PARP) proteina intatta e spaccati. Analisi citofluorimetrica delle cellule / PI macchiato annessina V ha suggerito che la trasfezione base lipidica leggermente aumentato la percentuale di cellule positive annessina V rispetto alle cellule untransfected, mentre la trasfezione basata poliammina-proteina / no (Figura 4A) . Analogamente, il lipide-basata trasfettate lieve aumento della PARP spaccati mentre la trasfezione basata poliammina-proteina / no (Figura 4B). Tuttavia, nonostante i numeri elevati di cellule apoptotiche, la morfologia delle cellule mediante microscopia ottica non è cambiato (Figura 4C). Ancora più importante, la risposta biologica delle cellule trasfettate base di lipidi rimasta identica a quelle delle cellule untransfected (Figura 4D). Le cellule sono state stimolate con LPS ± IL-10, e la quantità di TNF ^5; secreta nel supernatante di coltura sono stati quantificati mediante ELISA. Sia le cellule trasfettate untransfected e base di lipidi fatti simili quantità di TNFa in risposta a LPS e sono stati inibiti dall'aggiunta di IL10. No TNFa è stata fatta quando le cellule non sono state stimolate (Figura 4D) suggerendo che le cellule rimaste naive dopo la trasfezione.
Figura 1. La transfezione basata lipidi dato maggiore efficienza di trasfezione di proteina / trasfezione basata poliammina-. (A), le cellule sono state trasfettate RAW264.7 un plasmide GFP che esprimono sia con i reagenti di trasfezione basati poliammine proteine / a base di lipidi o. Segnale GFP è stata misurata mediante citometria a flusso dopo 24 ore. (B), le cellule sono state trasfettate RAW264.7 con il promotore giornalista pGL3-IkBζ. Dopo 48 ore di riposo, cells sono state stimolate con LPS per 6 ore. Segnale luciferasi Firefly è stata misurata secondo le istruzioni del produttore. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. I dati di analisi della luciferasi tipici. RAW264.7 cellule sono state trasfettate con TK-Renilla e IkBζ promotore giornalista. Dopo 24 ore di riposo, le cellule sono state stimolate con LPS ± IL-10 per 2 ore. (A) Firefly luciferasi e (B) segnali luciferasi Renilla sono stati misurati in base alle istruzioni del produttore luciferasi test. (C) Attività di Reporter è stata normalizzata per il segnale di TK-Renilla e tracciati come rapporto Firefly / Renilla. (D) Piegare variazione è calcolato dividendo ilFirefly:. Rapporto Renilla dei campioni stimolati da quella del campione non stimolato Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. La forza del segnale luciferasi è dipendente dal tempo. (A) Lipid basata trasfettate e (B), le cellule trasfettate basati poliammina Protein / stati di riposo di 24 ore o 48 ore o prima della stimolazione con LPS ± IL-10 per 2 ore. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo qui descritto non si concentra esclusivamente sulla efficienza di trasfezione, ma ha lo scopo di trovare un equilibrio tra efficienza e la conservazione degli stati fisiologici delle cellule. In particolare, la nostra procedura riesce a ridurre al minimo la tossicità di reagente di trasfezione e massimizzare il segnale luciferasi.
Un passo critico nel protocollo è la salute delle cellule. Culture Overgrown non sono adatti per la trasfezione come loro cambiamenti fisiologia e coltura continua di cellule RAW264.7 per un lungo periodo di tempo possono anche modificare il fenotipo e la funzione delle cellule 10. Cellule appena scongelati che hanno un numero basso di passaggio si consiglia di utilizzare per la trasfezione.
Un'altra considerazione importante è la scelta di reagenti di trasfezione. Reagenti di transfezione a base di lipidi sono tipicamente utilizzati nel campo della ricerca per la sua facilità d'uso e la disponibilità commerciale. Tuttavia, alcuni di questi reagenti causato unintended (e di solito indesiderati) cambiamenti nell'espressione genica globale in cellule trasfettate 11,12. Per risolvere questo problema, le cellule vengono incubate solo con i reagenti di trasfezione per poche ore invece della tipica O / N, o un reagente a base di lipidi non viene scelto per la trasfezione. Tempo di incubazione più lunghi con il reagente di trasfezione aumenterà l'efficienza di trasfezione, ma può anche essere dannoso per le cellule o causare morte cellulare o l'attivazione delle cellule, entrambi i quali possono interferire con il disegno sperimentale. Figure 4A e 4B mostrano che la proteina / polyamine- trasfezione base non ha causato apoptosi o necrosi, rispetto alle cellule untransfected. La trasfezione base lipidica, anche con il tempo di incubazione breve, causato alto livello di morte cellulare. Esso è correlato alla maggiore efficienza di trasfezione della trasfezione reattivo a base lipidica. Tuttavia, quando le cellule trasfettate sono state osservate al microscopio, non c'erano cambiamento morfologico notevoles (Figura 4C). Macrofagi attivati solitamente adottano una forma tentacolare, ma entrambe le cellule untransfected e transfettate non hanno mostrato segni di attivazione prima di stimolazione, indicando che erano nei loro stati di riposo. Inoltre, le cellule trasfettate risposto in modo simile a LPS e IL-10 stimolazione come le cellule untransfected (Figura 4D). Queste osservazioni indicano collettivamente che questa procedura di trasfezione non altera comportamento naturale delle cellule.
Il tempo tra transfezione e trattamento sperimentale (il tempo di riposo) è fondamentale. Abbastanza tempo deve essere data per i geni luciferasi per esprimere e per le cellule per ristabilire il loro stato di riposo; tuttavia, una lunga incubazione può ridurre segnali luciferasi, soprattutto quando l'efficienza di trasfezione non è elevato.
La procedura si applica allo specific gene reporter della luciferasi utilizzato nel nostro laboratorio. Piccole modifiche saranno needed quando si utilizza un altro giornalista. I parametri che devono essere testati comprendono diversi giornalista luciferasi di lucciola: rapporto luciferasi Renilla, il tempo di riposo tra transfezione e il trattamento, e condizioni di trattamento. A 50: 1 rapporto di pGL3-IκBζ: phRL-TK è tipicamente utilizzato, ma il rapporto può variare da 1: 1 a 100: 1. Si è constatato che un periodo di riposo 24 ore tra la rimozione della soluzione di trasfezione delle cellule e l'inizio del trattamento sperimentale ha dato il miglior segnale. Dopo 48 ore, segnali luciferasi iniziato in calo, e le differenze tra i gruppi di trattamento sono stati ridotti o addirittura aboliti.
La procedura di trasfezione descritto non è limitato ai saggi luciferasi. Altri disegni sperimentali che non hanno bisogno di una popolazione omogenea sarà beneficiato; per esempio, la microscopia a fluorescenza che si basa su osservazioni da cellule singole. Uno svantaggio è quello di individuare le cellule transfettate con successo tra controparti untransfected, ma lavantaggi di essere meno in termini di tempo e di intensità di lavoro possono essere più desiderati. Nei casi in cui si preferiscono le linee cellulari stabili, il nostro protocollo prevede una media per esperimenti iniziali in cui procedura sperimentale può essere ottimizzato quando vengono generate linee cellulari stabili.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Life Technologies | K210007 | Any maxiprep kit will work |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Life Technologies | 15593-049 | Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container. |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30396.03 | Inactivated at 56 °C water bath for 45 min before use. |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Warm to at least room temperature before use. |
| XtremeGene HP DBA transfection reagent | Roche | 6366236001 | Warm to room temperature before use. |
| GeneJuice | EMD Millipore | 70967 | Warm to room temperature before use. |
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E1941 | 30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 |
References
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