Abstract
La capacité à différencier les cellules souches embryonnaires de souris (ESC) pour progéniteurs neuronaux, permet l'étude des mécanismes de contrôle de la spécification de neurones ainsi que la génération de types de cellules neurales matures pour complément d'étude. Dans ce protocole, nous décrivons un procédé pour la différenciation de cellules progénitrices neurales ESC à l'aide de la culture en monocouche sans sérum. Le procédé est évolutive, efficace et aboutit à la production de ~ 70% de cellules progénitrices neurales à l'intérieur de 4-6 jours. Il peut être appliqué à l'ESC de diverses souches cultivées dans une variété de conditions. Progéniteurs neuronaux peuvent être autorisés à différencier en neurones fonctionnels et cellules gliales ou analysés par microscopie, cytométrie en flux ou moléculaires techniques. Le processus de différenciation est prête à la microscopie time-lapse et peut être combiné avec l'utilisation de lignes de rapporteurs pour surveiller le processus de spécification de neurones. Nous fournissons des instructions détaillées sur la préparation des milieux et de l'optimisation de la densité des cellules pour permettre au processus à be appliquée à la plupart des lignées de CSE et une variété de récipients de culture cellulaire.
Introduction
Les cellules souches embryonnaires sont des cellules pluripotentes dérivées de l'embryon précoce ayant la capacité de proliférer indéfiniment in vitro, tout en conservant la capacité de se différencier en tous les types cellulaires adulte suivantes réintroduction dans un embryon au stade approprié (par formation d'une chimère), l'injection dans syngéniques ou immunodéprimés hôtes (en formant un tératome) ou in vitro soumis à des indices appropriés 1. La différenciation in vitro de souris des cellules souches embryonnaires dans des lignées neurales a été décrite la première fois en 1995 et a impliqué la formation d'agrégats multicellulaires de suspension (corps embryoïdes, EB) dans des milieux contenant du sérum supplémenté avec de l'acide rétinoïque morphogène 2-4. Depuis lors, un grand nombre de protocoles ont été développés pour permettre la différenciation de neurones 5. Beaucoup utilisent encore l'agrégation, d'autres co-culture avec induisant types de cellules et plusieurs impliquent l'utilisation de milieux sans sérum. Tous les protocoles ont des avantages d'une inconvénients et la nature précise des neurones ou des cellules neuronales produites varie également selon le protocole utilisé.
Le protocole idéal serait robuste, évolutive et faire usage des médias et des substrats entièrement définis, se prêter à la surveillance non invasive du processus de différenciation et entraîner la génération de populations pures de progéniteurs neuronaux pouvant être modelée par des indices externes et de différencier dans tous les sous-types neuronales et gliales avec une grande efficacité et le rendement dans un temps relativement court. Dans les douze dernières années, nous avons utilisé une méthode pour générer des progéniteurs neuronaux et les neurones de souris ESC dans une faible densité, la culture de monocouche adhérente sans sérum 6-10. Ce protocole répond à la plupart des critères énoncés ci-dessus: dans nos mains l'efficacité de la différenciation a été assez constante au cours de nombreuses années et une variété de lignées cellulaires, il peut être agrandie ou réduite (nous utilisons avec succès les navires des plaques à 96 puits à 15 cm de diamètre dishes) et les supports utilisés sont bien définis. Le procédé se prête à la microscopie Timelapse pour le contrôle de la différenciation et une variété de structuration indices peuvent être ajoutés pour induire la production de différents types de sous-types de neurones (par exemple, Shh et Fgf8 pour les neurones dopaminergiques 6).
Néanmoins, il ya des défis à l'application réussie de ce protocole. Un des aspects clés est une préparation minutieuse des médias. Nous préparons toujours les médias en interne malgré la disponibilité d'alternatives commerciales. Un des suppléments utilisés (N2; voir le protocole) a plus de modifications à la norme de versions disponibles dans le commerce. Enfin, l'une des étapes les plus importantes pour l'application réussie de cette méthode est la densité cellulaire optimale au placage. Ceci est principalement parce que tandis que la nature autocrine de l'un des signaux induisant (FGF4 11) exige que suffisamment de cellules sont présents pour permettre VIABIL optimalelité et la différenciation, à la différenciation trop élevées des densités de dépréciation (éventuellement en partie due à la production autocrine de FRV 12). Il est donc important que la préparation des deux médias et le placage de cellules sont réalisées avec soin et de manière cohérente afin de garantir des résultats optimaux.
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Protocol
1. Préparation des médias
NOTE: Le protocole repose sur l'utilisation d'un mélange de deux supports séparés: DMEM / F12 additionné de supplément N2 modifié et Neurobasal additionné de supplément B27, typiquement dans un rapport de 1: 1.
- Préparer le supplément N2 modifié en mélangeant les composants dans un tube de 15 ml. Ne pas vortex ou filtrer cette; mélanger en inversant le tube jusqu'à ce que la solution est claire.
- Commencez par pipetage 7,2 ml de DMEM / F12, puis ajouter 1 ml de 25 mg / ml d'insuline (constitué dans HCl 0,01 M) et bien mélanger en inversant le tube. Il prend quelques minutes jusqu'à ce que la solution est claire.
- Ajouter 1 ml de 100 mg / ml apo-transferrine (préparés dans l'eau), 33 pi de 0,6 mg / ml progesternone (faites dans de l'éthanol), 100 pi de 160 mg / ml (1 M) putrescine (composé dans l'eau ), 10 pl de sélénite 3 mM de sodium (préparés dans l'eau) et 666 ul de 7,5% d'albumine de sérum bovin et bien mélanger le tube. Aliquote dans 2,5 ml et conserver à -20 °C pendant jusqu'à 2 mois.
- Préparer les médias.
- Pour 250 ml de DMEM / F12 ajouter 2,5 ml de N2. Mélangez bien, mais ne pas secouer ou le filtre.
- Pour 250 ml de Neurobasal médias ajouter 5 ml de supplément de B27. Mélangez bien, mais ne pas secouer ou le filtre.
- Mélanger les médias à partir des étapes 1.2.1 et 1.2.2 dans un rapport de 1: 1. Dans certains cas, un 1: mélange 3 peut être nécessaire (complétée le mélange 1: 1 à l'étape 1.2.4).
- Pour le mélange ajouter 0,5 ml de L-glutamine (concentration finale 0,2 mM) et 3,5 pi de 2-mercaptoéthanol (concentration finale 0,1 mM) et bien mélanger sans agitation. Entreposer le support à 4 ° C pendant jusqu'à trois semaines et ne pas exposer à la lumière. Ce mélange final est appelé N2B27.
- Préparer la solution de gélatine.
- Préparer une solution de gélatine à 1% dans de l'eau ultrapure et autoclave à 121 ° C, 15 psi, pendant 15 minutes. Il est important que la bouteille utilisée pour cela est complètement propre des détergents ou des désinfectants, il est donc recommandé qu'une nouvelle bouteille estutilisé pour cela et est seulement jamais rincé à l'eau ultra pure entre les utilisations. Aliquoter la solution à 1% en portions de 50 ml et de garder à 4 ° C pendant des mois.
- Chauffer une partie aliquote de 1% de gélatine dans un bain d'eau à 37 ° jusqu'à dissolution et ajouter à 500 ml de solution saline tiède tamponnée au phosphate (PBS). Mélangez bien et pipette assez pour couvrir le fond de chaque puits ou d'une plaque. Autoriser la gélatine pour enrober la surface pendant au moins 30 min.
2. Placage des cellules
NOTE: Ce protocole vaut également pour ESC de souris cultivées dans 10% de sérum avec le facteur inhibiteur de la leucémie (LIF), le remplacement de sérum avec un FRV ou un milieu sans sérum avec LIF et la protéine morphogénétique osseuse 4 (BMP4) ou inhibiteurs de MEK et GSK3 (médias 2i) avec ou sans FRV. Toutefois, le moment et l'efficacité de la différenciation peuvent varier selon les médias et les cellules (voir la discussion). Pour les expériences présentées ici nous avons utilisé la ligne 46C souris ESC (qui a un rapporteur de l'EGFP a frappé en on des allèles SOX1 endogènes), cultivés dans du GMEM avec 10% de sérum et LIF. Pour des résultats optimaux, il est important que les cellules sont dissociées et replaquées dans le milieu N2B27; changeant simplement de médias de GMEM / sérum / FRV à N2B27 aboutit toujours à une efficacité réduite par rapport à la différenciation les plaquant les cellules.
- Cultiver les cellules dans GMEM avec 10% de sérum, du pyruvate de sodium 1 mM, acides aminés non essentiels 1x, 0,1 M de 2-mercaptoéthanol, et 100 unités / ml de LIF 13. Pour obtenir une culture subconfluente de souris ESC, plaque 1 x 10 6 cellules dans un flacon de culture T25 qui aura 2 - 3 jours.
- Respecter les cellules sous champ lumineux microscope. Lorsque les cellules sont sous-confluente et prêt à passage, rincer deux fois dans du PBS. Ajouter 1 ml de cellules réactif de dissociation et revenir à l'incubateur pendant 2 - 5 min. Bien que la trypsine et d'autres enzymes peuvent également être utilisés pour la dissociation des cellules, elles peuvent avoir un impact négatif sur la fixation des cellules de sorte que les densités de placage devront être ADJUsted.
- Une fois que les cellules commencent à soulever de la plaque, appuyez sur le navire pour les déloger dans une suspension cellulaire unique. Recueillir les cellules dans un total de 10 ml de médias et de dissociation cellulaire réactif et de la pipette dans un tube de 15 ml centrifugeuse.
- Faites tourner les cellules à 300 g pendant 3 min à température ambiante.
- Aspirer délicatement le surnageant et remettre le culot dans 10 ml de pré-chauffé N2B27 par aspiration et refoulement 3 - 5 fois. Lorsque la suspension pipetage vers le bas, contre le bord pipette du tube pour éviter de créer des bulles. Compter les cellules avec un compteur de cellules automatisé ou un hémocytomètre et enregistrer la concentration.
- Préparer une suspension de cellules contenant le nombre désiré de cellules par unité de volume à être plaqué par puits dans préchauffé N2B27. Une densité de 10 500 cellules par cm 2 dans un plat à 6 puits (par exemple, 1 x 10 5 cellules par puits d'un plat à 6 puits) est optimale. Voir le tableau 1 pour suggéré nombre de cellules par cm 2 et plaTing volumes de médias pour une variété de récipients de culture cellulaire.
- Aspirer la gélatine à partir de la cuve de culture et de la plaque de la suspension cellulaire en fonction de la densité et le volume suggéré dans le Tableau 1. Ne pas agiter les plaques comme cela va concentrer les cellules vers le centre. Placez les cultures dans un incubateur humide à 37 ° C, 5% CO 2.
- Changer de support tous les 1 - 2 jours en remplaçant tous les médias avec N2B27 frais. Pipette doucement rinçage des cellules pourrait affecter la densité et de réduire l'efficacité de la différenciation dans les jours suivants. Où viabilité initiale après l'étalement est pauvre, plaque les cellules dans un 1: 3 mélange des médias N2 et B27-complétées et changer cette N2B27 après les deux premiers jours. Les cellules commencent à se différencier et doivent montrer l'expression de Sox1 (visible par fluorescence verte de la journaliste dans la lignée cellulaire 46C utilisé ici) dans les 4 - 6 jours.
3. Coloration immunofluorescente
NONTE: Le protocole peut être appliqué à n'importe quel type de navire. Le volume de chaque réactif est décrite par puits de plaque de 6 puits et peut être adapté à toute surface. Réensemencement est pas recommandé en raison de la faible viabilité après.
- Retirer le milieu de différenciation et de fixer les cellules par addition de 500 ul de 4% (v / v) de paraformaldehyde, laisser pendant 15 minutes.
- Laver et perméabiliser les cellules avec 2 ml de PBS-T (solution saline tamponnée au phosphate avec 0,5% (v / v) de Tween-20) à deux reprises. Les cellules peuvent être maintenues dans du PBS-T pendant jusqu'à 2 mois à 4 ° C.
- Remplacer PBS-T avec 1 ml de PBS-T contenant 10% (v / v) de sérum (de la même espèce que l'anticorps secondaire). Incuber 1 h sur la bascule de la plaque à la température ambiante pour bloquer toute liaison non spécifique.
- Après 1 h, laver les cellules deux fois avec 2 ml de PBS-T, et incuber dans 500 ul d'IgG de souris contre ßlll-tubuline (dilué à 1: 1000 dans du PBS-T avec 10% de sérum). Mettez sur la bascule de la plaque et laisser O / N à 4 ° C.
- De cette étape, toujours protéger le navirede la lumière. Laver les cellules deux fois avec du PBS-T, puis ajouter 500 ul d'anticorps IgG anti-souris marqué par fluorescence (dilué à 2 pg / ml dans du PBS-T avec 10% de sérum). Mettez-le sur la bascule de la plaque pendant 1 heure à température ambiante.
- Rincer les cellules deux fois avec du PBS-T, puis ajouter 500 ul de DAPI (dilué à 0,5 ug / ml dans du PBS-T) et laisser reposer pendant 5 min.
- Laver les cellules à nouveau et les garder dans PBS-T. Les cellules sont prêts à être photographiés et peuvent être conservés pendant un maximum de 2 semaines à 4 ° C. Notez que le signal de la GFP disparaît au fil du temps il est donc inapproprié de comparer l'intensité de la GFP de cellules fixes et vivants ou des cellules fixées à des moments différents.
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Representative Results
Dans cette expérience, nous avons utilisé la lignée cellulaire 46C 14, les cellules souches embryonnaires de souris avec une endogène Sox1-GFP journaliste, pour suivre la différenciation neuronale. En utilisant cette lignée cellulaire, l'expression de Sox1, un marqueur pour les progéniteurs neuronaux, peut être détectée par la fluorescence verte. Placage densité est un facteur critique pour atteindre la différenciation neuronale. Souris des cellules souches embryonnaires ont été étalées dans plaque de 6 puits à différentes densités variant de 10 500 à 88 500 cellules / cm 2. Figure 1A montre l'efficacité de différenciation obtenus par les différentes densités de placage dans une plaque à 6 puits. Au jour 6 de la différenciation, les cellules ont été fixées dans du paraformaldehyde à 4% et colorées pour le marqueur neuronal ßlll-tubuline. A la densité optimale (10 500 cellules / cm 2), les cellules différenciées de progéniteurs neuronaux et les neurones. Ceci a été observé par le signal fluorescent vert de Sox1-GFP journaliste et immunofluorescence contre le marqueur neuronal, ßlll-tubuline. A lodensité de placage wer a conduit à la mort des cellules dans les 3 jours. Toutefois, le placage à densité trop élevée (> 36 500 cellules / cm2) a entraîné une diminution de la proportion de cellules vertes et les cellules positives ßlll-tubuline. Figure 1B montre une expérience réalisée dans une plaque de 96 puits qui a nécessité environ 10 fois la densité cellulaire supérieure à atteindre l'optimal (155 000 cellules / cm 2) et le trop confluentes (362 500 cellules / cm 2) niveau.
Densité optimale peut être différent entre les préparations de médias, composante de médias et de lots de cellules, les types de cellules, ou des conditions de culture précédentes. Il est recommandé d'optimiser la densité de placage pour chaque expérience. Le tableau 1 fournit des gammes de densités de placage efficaces dans diverses plates-formes qui devraient être inclus dans l'étape d'optimisation. Dans cette gamme, il devrait être possible d'obtenir une densité qui donne un bon rendement de différenciation au sein de 4 - 6 jours.
Au cours de la différenciation ESC a progressivement changer leur morphologie. Figure 2 montre cellulaire et morphologie des colonies du jour 1 au jour 6 après placage en plaque de 6 puits à 10 500 cellules / cm 2. Les cellules ont été cultivées dans des conditions de différenciation et photographiées tous les jours. Il est pas rare de voir la mort cellulaire significative sur les quelques premiers jours en raison du changement extrême dans des conditions de culture. Cependant, les cellules restantes sont encore capables de se différencier. Le jour 4, les cellules ont commencé à devenir progéniteurs neuronaux en vert signal fluorescent provenant Sox1-rapporteur GFP semblaient tout d'abord. Cependant, même le jour 6, toutes les cellules ne sont Sox1 positif. L'existence de certaines cellules non-neuronales est attendue, cependant, dans les conditions appropriées, la majorité des cellules sera neural.
Figure 1. L'effet de la densité de placage sur l'efficacité de différenciation. Deux différentedensités de cellules rapporteurs SOX1-GFP (46C) ont été étalées et différenciés selon le protocole pour 6 jours. (A) la différenciation dans une plaque à 6 puits. (B) La différenciation dans une plaque de 96 puits. Barre d'échelle:. 100 um S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. morphologies cellulaires durant le processus de différenciation. 46C ESC ont été différenciés à 10 500 cellules par cm 2 dans une plaque de culture de 6 puits et photographiés quotidiennement pour observer les changements dans la morphologie des cellules. Barre d'échelle:. 300 um S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Plate-forme | Gamme de densité effective (cellules / cm 2) | Gamme du nombre de cellules à l'assiette | Volume de support initial suggéré (ul) | Volume suggéré des médias après jour 1 (pl) |
| Plaque de 6 puits | 10,500 - 36,500 | 99 750 - 346 750 | 1000 | 2000 |
| Plaque de 24 puits | 15 600 - 46 800 | 29,640 - 88,920 | 500 | 1000 |
| Plaque de 96 puits | 103,500 - 260,000 | 33 120 - 83 200 | 100 | 200 |
Tableau 1. suggérés placage densités et des volumes de supports pour différentes tailles de navires. Les densités de placage dans ce tableau ont été déterminées en utilisant la lignée cellulaire 46C. Pour des résultats optimaux la densité de placage de chaque ligne individuelle peut être adjusted.
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Discussion
Le protocole de différenciation neurale monocouche a été en usage depuis plus d'une décennie 6. Le protocole est très efficace, composée d'un milieu défini, et fait dans un système de monocouche qui rend le système plus applicable pour préclinique (par exemple, le criblage de médicaments) utilise. Toutefois, il existe certains facteurs critiques qui déterminent l'efficacité de différenciation. Cet article souligne les facteurs et la solution pour chaque obstacle.
La densité des cellules après l'étalement à l'état de différenciation est peut-être le facteur le plus critique. Placage des cellules à une densité trop élevée réduit l'efficacité de la différenciation, tandis que le placage à densité trop faible conduit à la mort cellulaire. Ce phénomène est vraisemblablement dû à la signalisation du facteur de croissance autocrine. FGF4 est un facteur de croissance autocrine qui active la cascade MAPK et entraîne la différenciation 11 ESC. FRV est une autre cytokine produite par ESC. Il active la voie de STAT3 et favorise l'auto-renouvellement <sup> 15. Ce protocole fait usage de N2B27 de faire des cellules neurales. N2B27 contient divers facteurs qui permettent la survie de l'ESC et favorise la croissance des cellules neuronales, et ne contient pas non plus FRV ou BMP4 qui inhibent la différenciation neurale 6. De la bonne densité, un équilibre convenable de FGF4 et FRV signalisation est maintenue qui permet de différencier ESC. À haute densité, excès de FRV autocrine et la différenciation d'inhibition BMP. En revanche, les cellules à densité trop faible ont entravé la survie dans ces milieux assez minimes. Ainsi, lorsqu'un grand nombre de cellules sans différenciation apparaissent le nombre de placage doit être réduite, tandis qu'une augmentation du nombre de cellules de placage est nécessaire si la mort cellulaire significative est observée.
En plus du nombre de cellules, il existe d'autres facteurs qui affectent indirectement la densité de placage. Le premier facteur est la concentration de la cellule locale, en fonction de la technique utilisée pour répartir uniformément les cellules au-dessus de la surfacerégion. Nous avons constaté que le tourbillonnement est bien pas idéal car il concentre les cellules au centre du puits et rend la densité au centre trop élevé, tandis que sur la périphérie de la densité devient trop faible. D'autres techniques de mélange, par exemple, en mélangeant les médias avec les cellules avant l'ensemencement ou à bascule du côté-à-côté plaque sont recommandés. En outre, quand un récipient est placé dans l'incubateur, un chauffage inégal du milieu provoque une force de convection qui attire les cellules au centre du puits, ce qui entraîne la distribution des cellules selon un motif d'anneau concentrique. Un volume plus faible des médias le jour de placage est recommandé de réduire cet effet. Laissant la plaque en dehors de l'incubateur pendant 30 minutes pour laisser les cellules attachent, ainsi que l'échauffement du milieu avant de les mélanger peut également aider à atteindre une densité de placage homogène.
D'autre part, le type de récipient affecte également placage densité. La figure 1 montre clairement que le nombre de cellules / puits peut ne pas être linéairement scaconduit à la zone de surface de différents navires (en d'autres termes, le même nombre de cellules / surface spécifique ne peut être appliqué à tout type de récipient). Un récipient plus petit (avec un rapport plus grand volume / surface) est affectée plus par la tension de surface de support qui fait une surface concave de support, le ménisque dite. La tension superficielle pousse les cellules vers le bord du puits et la densité diminue au centre. En outre, car le volume des médias dans le petit bâtiment est faible, les médias se réchauffent rapidement, réduisant la force de convection. Par conséquent, les cellules dans un petit navire se déplacera à bord par l'effet du ménisque, et ne seront pas déplacer vers le centre par les forces de convection. Ainsi, plus le navire est élevée, plus la densité de placage nécessaire pour obtenir la densité optimale au centre.
Troisièmement, l'état des cellules avant le placage affecte aussi indirectement densité de placage et de l'efficacité de la différenciation. Nous avons trouvé une variation de la densité optimale dans certaines expériences. Les expériences avectaux de mortalité plus élevé le premier jour nécessaire densité plus élevée de différenciation efficace. Cultures ESC dans le sérum et LIF sont composés d'une population hétérogène de cellules pluripotentes naïves, les cellules pluripotentes apprêtées, et même un petit nombre de cellules différenciées 16. Les cellules de ce type ont une capacité différente de survivre et de se différencier dans des conditions de différenciation. Depuis le protocole dicte sur le nombre, mais pas l'état des cellules, certaines expériences pourraient commencer avec des cellules plus différenciées qui vont mourir sur les quelques premiers jours, conduisant à une densité plus faible que prévu. Pour éviter cette variation, la culture cohérente de l'ESC est nécessaire pour faire en sorte que la proportion constante entre chaque état est maintenu.
En dehors de la densité, le timing est un autre facteur pour atteindre la différenciation efficace. Dans cette publication, nous décrivons la production de progéniteurs neuronaux dans les 6 jours. Cependant, le temps peut être différent en fonction de l'état dela culture ESC de départ. Comme décrit ci-dessus, les cultures du CES sont des populations mixtes qui peuvent répondre différemment à la condition de différenciation. Non seulement la survie des cellules, mais également, le temps de différenciation seront affectés par la composition de la culture. Ce protocole peut être appliquée à la plupart des conditions de culture ESC par exemple, dans des milieux contenant du LIF et N2B27 BMP4, ou 2i et LIF. Cependant, si il n'y a plus de cellules naïves dans la culture, un délai plus long peut être nécessaire pour la différenciation efficace. Ceci est parce que les cellules naïves auront besoin de plus de temps pour passer à un état apprêté et ensuite se différencier pour progéniteurs neuronaux.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-074 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| B-27 Supplement, serum free | Life Technologies | 17504-044 | |
| Insulin | Sigma | I6634 | Reconstitute with sterile 0.01 M HCl |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | Reconstitute with sterile water |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Reconstitute with ethanol |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Reconstitute with sterile water |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | Reconstitute with sterile water |
| Bovine albumin fraction V | Life Technologies | 15260-037 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented |
| Gelatine | Sigma | G1890 | |
| 6-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 140675 | |
| 24-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 142475 | |
| 96-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 167008 | |
| GMEM | Life Technologies | 11710-035 | |
| MEM Non-essential amino acids solution | Life Technologies | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Leukaemia inhibitory factor | prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Protect from light |
| Mouse anti βIII tubulin IgG antibody | Covance | MMS-435P | |
| Fluorescence-labelled anti-mouse IgG antibody | Life Technologies | A31571 | Protect from light |
| 25 cm2 tissue culture flask | Thermo Scientific | 156367 |
References
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