Abstract
Evnen til å skille mus embryonale stamceller (ESC) til nevrale stamceller tillater studiet av mekanismene som kontrollerer nevrale beskrivelsen så vel som dannelsen av moden nervecelletyper for videre studier. I denne protokollen beskriver vi en fremgangsmåte for differensiering av nevrale stamceller ESC til ved anvendelse av serum-fritt, monolagskultur. Metoden er skalerbar, effektiv og resulterer i produksjon av ~ 70% nevrale stamceller innen 4-6 dager. Det kan brukes på ESC fra forskjellige stammer dyrket under forskjellige betingelser. Nevrale stamceller kan få lov til å skille videre inn funksjonelle nerveceller og gliaceller eller analysert ved mikroskopi, flowcytometri eller molekylære teknikker. Differensieringsprosessen er mottagelig for time-lapse mikroskopi og kan kombineres med bruk av rapportør linjer for å overvåke det nevrale spesifikasjonen prosessen. Vi gir detaljerte instruksjoner om media forberedelse og celletettheten optimalisering for å tillate at prosessen til be påføres på de fleste ESC linjer og en rekke cellekulturflasker.
Introduction
Embryonale stamceller er pluripotente celler avledet fra tidlig embryo med kapasitet til å proliferere in vitro på ubestemt tid og samtidig beholde evnen til å differensiere til alle voksne celletyper etter gjeninnføring i et passende trinn embryo (ved å danne en chimaera), injeksjon inn i syngeniske eller immunkompromitterte verter (ved å danne en teratom), eller in vitro under gjeldende signaler 1. Den in vitro differensiering av mus embryonale stamceller i nerve linjene ble først beskrevet i 1995, og som er involvert i dannelsen av flercellede opphengs aggregater (embryoide legemer, EBS) i serum-inneholdende medium supplert med morphogen retinsyre 2-4. Siden da har en rekke protokoller er blitt utviklet for å tillate nevrale differensiering 5. Mange fremdeles utnytte aggregering, andre ko-kultur med induserende celletyper og flere innebære bruk av serumfritt medium. Alle protokoller har fordeler ennd ulemper og nøyaktige natur neural eller nerveceller produsert også varierer i henhold til protokollen som brukes.
Det ideelle ville være robust protokoll, skalerbart og gjøre bruk av fullt definerte medier og substrater, være mottakelig for ikke-invasiv overvåking av differensieringsprosessen og resultere i generering av rene populasjoner av nevrale stamceller kan være mønstret av eksterne signaler, og for å differensiere inn i alle neuronale og gliale undergrupper med høy effektivitet og utbytte i en forholdsvis kort tid. I løpet av de siste tolv årene har vi brukt en metode for generering av nevrale stamceller og nevroner fra mus ESC i en lav tetthet, serum-free tilhenger enlagskultur 6-10. Denne protokollen oppfyller mange av kriteriene ovenfor: i våre hender effektiviteten av differensiering har vært ganske konsekvent over mange år, og en rekke cellelinjer, kan det bli skalert opp eller ned (vi lykkes med å bruke fartøy fra 96-brønners plater til 15 cm diameter dishes) og media som brukes er godt definert. Fremgangsmåten er mottagelig for timelapse mikroskopi for overvåking av differensiering og en rekke mønster signaler kan bli tilsatt for å indusere dannelsen av forskjellige typer av neuronale undertyper (f.eks Shh og Fgf8 for dopaminerge neuroner 6).
Likevel er det noen utfordringer til den vellykkede anvendelse av denne protokollen. En av de viktigste aspektene er grundige forberedelser av media. Vi forbereder alltid media in-house tross for tilgjengeligheten av kommersielle alternativer. En av kosttilskudd brukes (N2, se Protocol) har modifikasjoner over standard kommersielt tilgjengelige versjoner. Endelig er en av de viktigste trinn for vellykket bruk av denne metoden er den optimale celletettheten ved plating. Dette er hovedsakelig fordi mens den autokrine karakter av en av de induserer signaler (Fgf4 11) krever at tilstrekkelig antall celler er til stede for å tillate optimal viabilligheten og differensiering, ved for høye tettheter differensiering er svekket (muligens delvis på grunn autocrine produksjon av LIF 12). Det er derfor viktig at både media forberedelse og celle plating utføres nøye og konsekvent for å sikre optimale resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Media Forberedelse
MERK: Protokollen er avhengig av bruk av en blanding av to separate medier: DMEM / F12 supplert med modifisert N2 supplement og Neurobasal supplert med B27 supplement, vanligvis i et 1: 1 forhold.
- Fremstille den modifiserte N2 supplement ved å blande komponentene i et 15 ml rør. Ikke vortex eller filtrere dette; blandes ved å snu røret inntil løsningen er klar.
- Start ved å pipettere 7,2 ml av DMEM / F12, og deretter legge 1 ml 25 mg / ml insulin (fremstilt i 0,01 M HCl) og bland godt ved å snu røret. Det tar et par minutter til oppløsningen er klar.
- Tilsett 1 ml 100 mg / ml apo-transferrin (laget opp i vann), 33 pl 0,6 mg / ml progesternone (laget opp i etanol), 100 pl 160 mg / ml (1 M) putrescin (tatt opp i vann ), 10 ul 3 mM natriumselenitt (tatt opp i vann), og 666 pl av 7,5% bovint serumalbumin og bland røret brønnen. Delmengde inn 2,5 ml og oppbevar ved -20 °C i opptil to måneder.
- Klargjør media.
- Til 250 ml av DMEM / F12 legge til 2,5 ml av N2. Bland godt, men ikke rist eller filter.
- 250 ml Neurobasal media legge 5 ml B27 supplement. Bland godt, men ikke rist eller filter.
- Bland media fra trinn 1.2.1 og 1.2.2 i et 1: 1-forhold. I noen tilfeller kan en 1: 3 blanding kan være påkrevet (supplementert som 1: 1-blanding i trinn 1.2.4).
- Til blanding tilsett 0,5 ml L-glutamin (sluttkonsentrasjon 0,2 mM) og 3,5 pl av 2-merkaptoetanol (endelig konsentrasjon 0,1 mM) og bland godt uten risting. Oppbevar media ved 4 ° C i opptil tre uker, og unngå å utsette for lys. Denne endelige miksen kalles N2B27.
- Forbered gelatinoppløsning.
- Tilbered en 1% gelatin-oppløsning i ultrarent vann, og autoklav ved 121 ° C, 15 psi i 15 min. Det er viktig at flasken brukes for dette er helt rene for vaskemidler eller desinfeksjonsmidler, så er det anbefalt at en ny flaske erbrukes til dette, og er bare noen gang skylles i ultrarent vann mellom hver bruk. Aliquot av 1% oppløsning i 50 ml aliquoter og holde ved 4 ° C i flere måneder.
- Varm en delmengde av 1% gelatin i et 37 ° C vannbad til det er oppløst og tilsett til 500 ml varm fosfatbufret saltoppløsning (PBS). Bland godt og pipettér nok til å dekke bunnen av hver brønn eller plate. La gelatin for å belegge overflaten i minst 30 min.
2. Plating Cellene
MERK: Denne protokollen gjelder både mus ESC vokst i 10% serum med leukemi hemmende faktor (LIF), serum erstatning med LIF eller serum-frie medier med LIF og benmorfogent protein 4 (BMP4) eller MEK og GSK3p hemmere (2i media) med eller uten LIF. Imidlertid kan timingen og effektiviteten av differensiering variere avhengig av mediet og cellene (se diskusjon). For forsøkene vist her brukte vi 46C muse ESC linje (som har en EGFP reporter banket til one av de endogene Sox1 alleler), dyrket i GMEM med 10% serum og LIF. For optimalt resultat er det viktig at cellene blir dissosiert og replated i N2B27 media; bare å endre medie fra GMEM / serum / LIF å N2B27 resulterer alltid i en redusert differensiering effektivitet sammenlignet med replating cellene.
- Dyrke cellene i GMEM med 10% serum, 1 mM natriumpyruvat, 1 x ikke-essensielle aminosyrer, 0,1 M 2-merkaptoetanol, og 100 enheter / ml 13 LIF. For å få en Subkonfluente kultur av mus ESC, plate 1 x 10 6 celler i en T25 kultur kolbe som tar 2 - 3 dager.
- Observer celler under lyse-feltet mikroskop. Når cellene er Subkonfluente og klar til passering, skyll dem to ganger i PBS. Tilsett 1 ml celledissosiasjon reagens og gå tilbake til inkubatoren i 2 - 5 min. Selv om trypsin og andre enzymer kan også brukes for celledissosiasjon, de kan ha en negativ innvirkning på cellebinding, slik at pletteringstettheter må være justerbainvest.
- Når cellene begynner å løfte fra platen, trykker du på fartøyet for å løsne dem inn i en enkelt celle suspensjon. Utlevering av cellene i totalt 10 ml media og celledissosiasjon reagens og pipette inn i et 15 ml sentrifugerør.
- Spin cellene ved 300 xg i 3 min ved RT.
- Aspirer nøye supernatanten og resuspender pelleten i 10 ml forvarmet N2B27 ved å pipettere opp og ned 3-5 ganger. Ved pipettering av suspensjonen ned til pipette mot siden av røret unngå å skape bobler. Tell cellene med en automatisk celleteller, eller et hemocytometer og registrere konsentrasjonen.
- Fremstille en cellesuspensjon inneholdende det ønskede antall celler pr volumenhet som skal bli belagt per brønn i forvarmet N2B27. En tetthet på 10 500 celler per cm2 i en 6-brønners skål (dvs. en 5 x 10 celler per brønn i en 6-brønners skål) er optimal. Se tabell 1 for slått antall celler pr cm2 og plaelle medie volumer for en rekke cellekultur fartøy.
- Aspirer gelatin fra kulturbeholderen og plate cellesuspensjonen i henhold til den foreslåtte tetthet og volum i tabell 1. Ikke virvel platene, da dette vil konsentrere cellene til sentrum. Plasser kulturer i en fuktig inkubator ved 37 ° C, 5% CO2.
- Endre media hver 1 - 2 dager ved å erstatte all media med frisk N2B27. Pipetten forsiktig så spyle cellene kan påvirke tetthet og minske differensiering effektivitet i de følgende dagene. Hvor innledende levedyktighet etter plating er dårlig, plate cellene i en 1: 3 blanding av N2 og B27-supplert media og endre dette til N2B27 etter de to første dagene. Celler vil begynne å differensiere og bør vise Sox1 uttrykk (synlig ved grønn fluorescens av reporteren i 46C cellelinje som brukes her) innen 4 - 6 dager.
3. Immunofluorescent Farging
NEITE: Protokollen kan brukes på ethvert fartøy type. Volumet av hvert reagens er beskrevet per brønn av seks-brønners plate og kan skaleres til en hvilken som helst overflate. Replating anbefales ikke på grunn av den lave levedyktighet etterpå.
- Fjern differensiering medium og fikser cellene ved tilsetning av 500 ul 4% (v / v) paraformaldehyd, la for 15 min.
- Vask og permeabilisere cellene med 2 ml PBS-T (fosfatbufret saltvann med 0,5% (v / v) Tween-20) to ganger. Celler kan holdes i PBS-T for opptil to måneder ved 4 ° C.
- Erstatt PBS-T med 1 ml PBS-T med 10% (v / v) serum (fra den samme art som det sekundære antistoff). Inkuber 1 time på plate vippe ved RT for å blokkere en hvilken som helst ikke-spesifikk binding.
- Etter 1 time, vaskes cellene to ganger med 2 ml PBS-T, og inkuber i 500 mikroliter muse IgG mot SIII-tubulin (fortynnet 1: 1000 i PBS-T med 10% serum). Satt på plate rocker, og la O / N ved 4 ° C.
- Fra dette trinn alltid beskytte fartøyetmot lys. Vask cellene to ganger med PBS-T, og deretter legge til 500 mL av fluorescens-merket anti-muse-IgG-antistoff (fortynnet til 2 pg / ml i PBS-T med 10% serum). Sett det på plate rocker for en time ved RT.
- Rens cellene to ganger med PBS-T, og deretter legge til 500 mL av DAPI (fortynnet til 0,5 ug / ml i PBS-T) og la stå i 5 min.
- Vask cellene igjen og holde dem i PBS-T. Cellene er klar til å bli fotografert og kan oppbevares i opptil 2 uker ved 4 ° C. Merk at GFP signal blekner over tid slik at det er upassende å sammenligne GFP intensitet av faste og levende celler eller celler fast på ulike tidspunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette forsøk brukte vi 46C-cellelinjen 14, mus embryonale stamceller med et endogent Sox1-GFP reporter, for å spore nevrale differensiering. Ved å bruke denne cellelinjen, ekspresjon av Sox1, en markør for neural progenitor, kan detekteres ved grønn fluorescens. Plating tetthet er en kritisk faktor for å oppnå neuronal differensiering. Muse embryonale stamceller ble sådd ut i 6-brønns plate ved forskjellige tettheter varierende fra 10 500 til 88 500 celler / cm2. Figur 1A viser differensieringsvirkningsgrader som oppnås ved forskjellige pletteringstettheter i en 6-brønns plate. På dag 6 av differensiering, ble cellene fiksert i 4% paraformaldehyd og farget for neuronal markør SIII-tubulin. Ved optimal tetthet (10500 celler / cm2), cellene differensieres til nevrale stamceller og nerveceller. Dette ble observert av grønt fluorescerende signal fra Sox1-GFP reporter og immunofluorescent mot neuronal markør, SIII-tubulin. A lower plating tettheten førte til celledød innen 3 dager. Imidlertid plettering ved for høy tetthet (> 36 500 celler / cm2) resulterte i redusert andel av grønne celler og SIII-tubulin-positive celler. Figur 1B viser et eksperiment utført i en 96-brønns plate som krevde ca 10 ganger høyere celletetthet til nå den optimale (155000 celler / cm 2) og også sammenflytende (362 500 celler / cm2) nivå.
Optimal tetthet kan være forskjellig mellom medie preparater, media komponent og celle grupper, celletyper, eller tidligere dyrkningsforhold. Det anbefales å optimalisere plating tettheten for hvert forsøk. Tabell 1 gir utvalgene av effektive plating tettheter i ulike plattformer som bør inkluderes i optimalisering trinn. Innenfor dette område, bør det være mulig å få en densitet som gir en god differensiering effektivitet i 4 - 6 dager.
Under differensiering ESC gradvis endrer deres morfologi. Figur 2 viser cellen og kolonimorfologi fra dag 1 til dag 6 etter utplating i 6-brønners plate ved 10 500 celler / cm2. Celler ble dyrket i differensiering betingelser og fotografert hver dag. Det er ikke uvanlig å se betydelig celledød på de første dagene på grunn av ekstrem endring i kultur tilstand. Men de resterende cellene er fortsatt i stand til å skille. På dag fire, begynte celler til å bli nevrale stamceller som grønn fluorescerende signal fra Sox1-GFP reporter først dukket opp. Men selv på dag 6, ikke alle cellene er Sox1-positive. Eksistensen av noen ikke-nevrale celler er forventet, likevel, i de riktige forhold, vil de fleste av cellene være neural.
Figur 1. Effekt av pletteringstetthet på differensiering effektivitet. To forskjelligetettheter av Sox1-GFP rapportør celler (46c) ble belagt og differensiert i henhold til protokollen i 6 dager. (A) Differensiering i en 6-brønns plate. (B) Differensiering i en 96-brønns plate. Skala:. 100 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Celle morfologi i løpet av differensieringsprosessen. 46C ESC ble differensiert ved 10 500 celler per cm2 i en 6-brønners kulturplate og fotografert daglig for å observere forandringer i cellemorfologi. Skala:. 300 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Platform | Utvalg av effektiv tetthet (celler / cm 2) | Utvalg av celle nummer til plate | Forslag til innledende medievolumet (pl) | Forslag til medievolumet etter dag 1 (ul) |
| 6-brønns plate | 10500 - 36500 | 99750 - 346750 | 1000 | 2000 |
| 24-brønns plate | 15600 - 46800 | 29640 - 88920 | 500 | 1000 |
| 96-brønns plate | 103 500 - 260 000 | 33120 - 83200 | 100 | 200 |
Tabell 1. Forslag til plating tettheter og medie volumer for ulike fartøystørrelser. De plating tettheter i denne tabellen ble bestemt ved hjelp av 46C cellelinje. For optimale resultater plating tettheten av hver enkelt linje må kanskje adjusted.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Monolaget nevrale differensiering protokollen har vært i bruk i over et tiår 6. Protokollen er svært effektiv, sammensatt av definert medium, og utført i et monosjikt system som gjør systemet mer anvendelig for preklinisk (f.eks narkotika screening) bruker. Det er imidlertid noen kritiske faktorer som bestemmer differensiering effektivitet. Denne artikkelen påpeker disse faktorene og løsningen for hvert hinder.
Tettheten av cellene etter utplating i differensieringen tilstand er kanskje den mest kritiske faktoren. Plating av cellene ved for høy tetthet reduserer differensiering effektivitet, mens plettering ved for lav tetthet fører til celledød. Dette fenomen skyldes sannsynligvis autokrin vekstfaktor signalering. Fgf4 er en autokrin vekstfaktor som aktiverer MAPK kaskade og stasjoner ESC differensiering 11. LIF er en annen cytokin produsert av ESC. Den aktiverer STAT3 sti og fremmer selvfornyelse <sup> 15. Denne protokollen gjør bruk av N2B27 å lage nerveceller. N2B27 inneholder ulike faktorer som tillater ESC overlevelse og fremmer neural cellevekst, og ikke inneholder enten LIF eller BMP4 som hemmer nevrale differensiering 6. Ved riktig tetthet, er en passende balanse mellom Fgf4 og LIF signaleopprettholdt som gjør det mulig å skille ESC. Ved høy tetthet, overskytende mengde av autokrine LIF og BMP hemmer differensiering. I motsetning til dette, har cellene ved for lav tetthet svekket overlevelse i disse ganske minimalt medium. Således, når et stort antall celler uten differensiering vises pletteringsnummeret skal reduseres, mens en økning av pletteringscelletallet er nødvendig hvis signifikant celledød observeres.
I tillegg til celletallet er der noen andre faktorer som indirekte påvirker pletteringstetthet. Den første faktor er den lokale cellekonsentrasjonen, avhengig av den teknikk som benyttes for å fordele cellene over overflatenområde. Vi fant at virvler brønnen ikke er ideell, fordi den konsentrerer cellene til midten av brønnen, og gjør tettheten ved senteret for høy, mens ved periferien tettheten blir for lav. Andre blandingsteknikker, for eksempel blande media med cellene før plating, eller rocking platen side-til-side anbefales. Dessuten, når et fartøy er plassert i inkubator, forårsaker ujevn oppvarming av mediet en konveksjon kraft som trekker cellene til midten av brønnen, noe som resulterer i fordeling av cellene i et konsentrisk ringmønster. En lavere medievolumet på plating dag er anbefalt for å redusere denne effekten. Forlater platen utenfor inkubatoren i 30 minutter for å la cellene feste, samt å varme opp mediet før blanding kan også bidra til å oppnå en homogen plating tetthet.
For det andre, den fartøytype påvirker også plating tetthet. Figur 1 viser klart at det antall celler / brønn ikke kan være lineært SCAført til overflaten forskjellige beholdere (med andre ord, ikke kan brukes det samme antall celler / overflateareal til hver fartøytype). En mindre beholder (med større volum / arealforhold) blir påvirket mer av mediene overflatespenning som gjør en konkav overflate av mediet, den såkalte menisk. Overflatespenningen presser cellene til kanten av brønnen og reduserer tettheten i midten. I tillegg, siden medievolumet i små kar er lav, medier varmes opp raskt, noe som reduserer styrken konveksjon. Derfor vil cellene i et lite fartøy flytte til kanten av menisken effekt, og vil ikke flytte til sentrum med konveksjon krefter. Således, jo mindre fartøyet, jo høyere pletteringstetthet som kreves for å få den optimale tetthet i midten.
For det tredje, tilstanden til cellene før plette også indirekte påvirker pletteringstetthet og differensiering effektivitet. Vi har funnet en variasjon av den optimale tetthet i noen eksperimenter. Forsøkene medhøyere dødsrate på den første dagen trengte høyere tetthet for effektiv differensiering. ESC kulturer i serum og LIF er sammensatt av en heterogen populasjon av naive pluripotente celler, primet pluripotente celler, og selv et lite antall differensierte celler 16. Celler av denne type har forskjellig evne til å overleve og differensiere i henhold til differensierings betingelser. Siden protokollen dikterer på antallet, men ikke tilstanden til cellene, kunne noen eksperimenter begynne med mer differensierte celler som vil dø på de første dagene, fører til en lavere tetthet enn forventet. For å unngå denne varianten, er konsistent kultur for ESC er nødvendig for å sørge for at den konstante forhold mellom hver stat opprettholdes.
Bortsett fra tetthet, er timing annen faktor for å oppnå effektiv differensiering. I denne publikasjonen beskriver vi generering av nevrale stamceller innen 6 dager. Imidlertid kan tiden være forskjellig avhengig av statenstart ESC kultur. Som beskrevet ovenfor, MGP kulturer er blandede bestander som kan reagere forskjellig på differensiering tilstand. Ikke bare celleoverlevelse, men også tidspunktet for differensieringen vil bli påvirket av sammensetningen kulturen. Denne protokollen kan brukes på de fleste ESC dyrkningsforhold for eksempel i N2B27 medier som inneholder LIF og BMP4, eller 2i og LIF. Imidlertid, hvis det er mer naive celler i kultur, et lengre tidsrom kan være nødvendig for effektiv differensiering. Dette er fordi naive celler vil trenge mer tid for å bytte til en primet staten og deretter differensiere til nevrale stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-074 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| B-27 Supplement, serum free | Life Technologies | 17504-044 | |
| Insulin | Sigma | I6634 | Reconstitute with sterile 0.01 M HCl |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | Reconstitute with sterile water |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Reconstitute with ethanol |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Reconstitute with sterile water |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | Reconstitute with sterile water |
| Bovine albumin fraction V | Life Technologies | 15260-037 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented |
| Gelatine | Sigma | G1890 | |
| 6-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 140675 | |
| 24-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 142475 | |
| 96-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 167008 | |
| GMEM | Life Technologies | 11710-035 | |
| MEM Non-essential amino acids solution | Life Technologies | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Leukaemia inhibitory factor | prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Protect from light |
| Mouse anti βIII tubulin IgG antibody | Covance | MMS-435P | |
| Fluorescence-labelled anti-mouse IgG antibody | Life Technologies | A31571 | Protect from light |
| 25 cm2 tissue culture flask | Thermo Scientific | 156367 |
References
- Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Fraichard, A., et al. In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).
- Strubing, C., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons. Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).
- Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).
- Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
- Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation. Development. 137, 881-890 (2010).
- Speakman, C. M., et al. Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition. Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).
- Kunath, T., et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development. 134, 2895-2902 (2007).
- Dani, C., et al. Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway. Dev Biol. 203, 149-162 (1998).
- Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).
- Aubert, J., et al. Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, Suppl 1. 11836-11841 (2003).
- Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).
- Silva, J., Smith, A.
