Abstract
Evnen til at differentiere muse embryonale stamceller (ESC) til neurale progenitorer muliggør studiet af de mekanismer, der styrer neurale specifikation samt generering af modne neurale celletyper til yderligere undersøgelse. I denne protokol beskriver vi en fremgangsmåde til differentiering af ESC til neurale progenitorer anvendelse af serum-frit, monolagskultur. Fremgangsmåden er skalerbar, effektiv og resulterer i produktion af ~ 70% neurale progenitorceller inden 4 - 6 dage. Det kan anvendes til ESC fra forskellige stammer, der dyrkes under forskellige betingelser. Neurale progenitorer kan tillades at differentiere yderligere i funktionelle neuroner og glia eller analyseres ved mikroskopi, flowcytometri eller molekylære teknikker. Differentieringsprocessen kan underkastes time-lapse mikroskopi og kan kombineres med anvendelsen af reporter linjer til at overvåge neurale specifikation processen. Vi giver detaljerede instruktioner om forberedelse medier og celletæthed optimering at lade processen til be anvendt på de fleste ESC linjer og en række celle dyrkningsbeholdere.
Introduction
Embryonale stamceller er pluripotente celler afledt fra den tidlige embryon med kapacitet til at proliferere på ubestemt tid in vitro, mens evnen til at differentiere til alle voksne celletyper efter genindførsel i et passende trin embryo (ved at danne en kimære), injektion i syngene eller immunkompromitterede værter (ved at danne en teratom) eller in vitro underlagt passende tidskoder 1. In vitro differentiering af muse embryonale stamceller i neurale afstamninger blev først beskrevet i 1995 og involverede dannelsen af flercellede suspension aggregater (embryoide legemer, EB) i serum-holdige medier suppleret med morfogenet retinsyre 2-4. Siden da en række protokoller er blevet udviklet for at muliggøre neural differentiering 5. Mange stadig udnytter sammenlægning, andre co-kultur med at fremkalde celletyper og flere indebære brug af serum-frie medier. Alle protokoller har fordele ennd ulemper og den nøjagtige karakter af neurale eller neuronale celler produceres også varierer alt efter den anvendte protokol.
Den ideelle protokol ville være robust, skalerbar og gøre brug af fuldt definerede medier og substrater kunne godtage ikke-invasiv overvågning af differentiering processen og resultere i dannelsen af rene populationer af neurale stamceller i stand til at være mønstret af eksterne signaler og til at differentiere i alle neuronale og gliale undertyper med høj effektivitet og udbytte på relativt kort tid. I de sidste snes år har vi brugt en metode til generering neurale stamceller og neuroner fra mus ESC i en lav tæthed, serumfrit vedhængende monolagskultur 6-10. Denne protokol opfylder mange af de kriterier, der er anført ovenfor: i vores hænder effektiviteten af differentiering har været ret konsekvent over mange år, og en række forskellige cellelinjer, kan det skaleres op eller ned (vi med succes anvender skibe fra 96-brønds plader til 15 cm i diameter dishes) og de anvendte medier er veldefineret. Processen kan underkastes timelapse mikroskopi for overvågning af differentieringen og en række mønsterdannende stikord kan tilsættes for at inducere dannelsen af forskellige former for neuronale undertyper (f.eks Shh og FGF8 for dopaminerge neuroner 6).
Ikke desto mindre er der nogle udfordringer for vellykket anvendelse af denne protokol. Et af de centrale aspekter er omhyggelig forberedelse af medierne. Vi forbereder altid medierne internt trods af tilgængeligheden af kommercielle alternativer. En af de kosttilskud, der anvendes (N2, se protokollen) har ændringer over standard kommercielt tilgængelige versioner. Endelig er et af de vigtigste skridt for en vellykket anvendelse af denne metode er den optimale celledensitet på plating. Dette er hovedsageligt fordi mens autokrine karakter af en af de inducerende signaler (FGF4 11) kræver, at der er tilstrækkelige celler er til stede for at give optimal viability og differentiering, ved for høje tætheder differentiering er svækket (eventuelt delvis skyldes autokrine produktion af LIF 12). Derfor er det vigtigt, at forberedelsen begge medier og celle plating udføres omhyggeligt og konsekvent for at sikre optimale resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Media Forberedelse
BEMÆRK: Protokollen bygger på anvendelsen af en blanding af to separat medie: DMEM / F12 suppleret med modificeret N2 supplement og Neurobasal suppleret med B27 supplement, typisk i et 1: 1 forhold.
- Forberede den modificerede N2 supplement ved at blande komponenterne i en 15 ml rør. Undlad at slynge eller filtrere denne; blandes ved at vende røret, indtil opløsningen er klar.
- Starte ved pipettering 7,2 ml DMEM / F12, hvorefter der tilsættes 1 ml 25 mg / ml insulin (fremstilles i 0,01 M HCl) og blandes godt ved at vende røret. Det tager et par minutter, indtil opløsningen er klar.
- Tilsæt 1 ml 100 mg / ml apo-transferrin (fremstillet i vand), 33 pi 0,6 mg / ml progesternone (konfektioneret i ethanol), 100 pi af 160 mg / ml (1 M) putrescin (fremstillet i vand ), 10 pi 3 mM natriumselenit (bestående i vand) og 666 pi 7,5% bovint serumalbumin og bland røret godt. Portion i 2,5 ml og opbevares ved -20 °C i op til 2 måneder.
- Forbered medierne.
- Til 250 ml DMEM / F12 tilsættes 2,5 ml N2. Bland godt, men ikke ryste eller filter.
- Til 250 ml Neurobasal medier tilsættes 5 ml B27 supplement. Bland godt, men ikke ryste eller filter.
- Bland medier fra trin 1.2.1 og 1.2.2 i et 1: 1 forhold. I nogle tilfælde kan en 1: kan kræves 3 mix (suppleret som 1: 1 blanding i trin 1.2.4).
- Til mix tilsættes 0,5 ml L-glutamin (slutkoncentration 0,2 mM) og 3,5 pi 2-mercaptoethanol (slutkoncentration 0,1 mM) og blandes godt uden omrystning. Opbevar mediet ved 4 ° C i op til 3 uger, og undgå at udsætte for lys. Denne endelige blanding kaldes N2B27.
- Forbered gelatineopløsning.
- Der fremstilles en 1% gelatineopløsning i ultrarent vand og autoklaveres ved 121 ° C, 15 psi, i 15 minutter. Det er vigtigt, at flasken anvendes til dette er helt ren fra detergenter eller desinfektionsmidler, så det anbefales, at en ny flaske eranvendes til dette, og er altid kun skylles i ultrarent vand mellem anvendelser. Alikvot den 1% opløsning i 50 ml portioner og holde ved 4 ° C i flere måneder.
- Varm en alikvot på 1% gelatine i en 37 ° C vandbad indtil opløsning og tilføje til 500 ml varm phosphatbufret saltvand (PBS). Bland godt og pipetteres nok til at dække bunden af hver brønd eller plade. Tillad gelatine til at overtrække overfladen i mindst 30 min.
2. Plating cellerne
BEMÆRK: Denne protokol gælder også for mus ESC dyrket i 10% serum med leukæmi faktor (LIF), serum udskiftning med LIF eller serum-frie medier med LIF og knoglemorfogenetisk protein 4 (BMP4) eller MEK og GSK3 inhibitorer (2i medier) med eller uden LIF. Timing og effektivitet differentiering kan dog variere efter medier og celler (se diskussionen). For eksperimenterne vist her brugte vi 46C musen ESC linje (der har en EGFP reporter bankede ind one af de endogene Sox1 alleler), dyrkes i GMEM med 10% serum og LIF. For at opnå optimale resultater, er det vigtigt, at cellerne er dissocieret og genudplades i N2B27 medier; blot at ændre af medier fra GMEM / serum / LIF til N2B27 altid resulterer i en reduceret differentiering virkningsgrad sammenlignet med genudplade cellerne.
- Dyrke cellerne i GMEM med 10% serum, 1 mM natriumpyruvat, 1x ikke-essentielle aminosyrer, 0,1 M 2-mercaptoethanol og 100 enheder / ml LIF 13. For at få en subkonfluerende kultur af mus ESC, plade 1 x 10 6 celler i en T25 dyrkningskolbe som vil tage 2 - 3 dage.
- Observere celler under lyse-felt mikroskop. Når cellerne er subkonfluerende og klar til passage, skyl dem to gange i PBS. Der tilsættes 1 ml celle dissociation reagens og vende tilbage til inkubatoren i 2 - 5 min. Selvom trypsin og andre enzymer også kan bruges til celle dissociation, kan de have en negativ indvirkning på cellebinding så plating tætheder skal være Grndplace.
- Når cellerne begynder at løfte fra pladen ved at trykke på fartøjet at fordrive dem til en enkelt cellesuspension. Opsamle cellerne i alt 10 ml af medier og celledissociering reagens og pipette i et 15 ml centrifugerør.
- Spin cellerne ved 300 x g i 3 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirere omhyggeligt supernatanten, og pellet resuspenderes i 10 ml forvarmet N2B27 ved pipettering op og ned 3-5 gange. Når pipettering af suspensionen ned, at pipette mod siden af røret undgå at skabe bobler. Tæl cellerne med en automatiseret celle counter eller et hæmocytometer og registrere koncentrationen.
- Der fremstilles en cellesuspension indeholdende det ønskede antal celler pr volumenenhed der skal pletteres per brønd i forvarmet N2B27. En densitet på 10.500 celler pr cm 2 i en 6-brønds skål (dvs. 1 x 10 5 celler pr brønd i en 6-brønds skål) er optimal. Se Tabel 1 for foreslået antal celler pr cm 2 og plaTing medier mængder for en række forskellige cellekultur fartøjer.
- Sug gelatine fra dyrkningsbeholderen og pladen cellesuspensionen ifølge den foreslåede densitet og volumen i tabel 1. Ikke swirl pladerne, da dette vil koncentrere cellerne til centrum. Placere kulturerne i en fugtig inkubator ved 37 ° C, 5% CO2.
- Skift medier hver 1 - 2 dage ved at udskifte alle medier med frisk N2B27. Pipette skånsomt som rødmen cellerne kan påvirke tæthed og mindske differentiering effektivitet i de følgende dage. Hvor indledende levedygtighed efter plating er dårlig, plade cellerne i en 1: 3 blanding af N2 og B27-suppleret medier og ændre dette til N2B27 efter de to første dage. Celler vil begynde at differentiere og skal vise Sox1 udtryk (synlig ved grøn fluorescens af reporter i 46C cellelinje anvendes her) inden 4 - 6 dage.
3. immunfluorescensfarvning
NOTE: Protokollen kan anvendes på enhver skibstype. Volumenet af hvert reagens er beskrevet per brønd af 6-brønds plade og kan skaleres til enhver overfladeareal. -genudpladning Anbefales ikke på grund af den lave rentabilitet bagefter.
- Fjern differentiering medium og løse cellerne ved at tilsætte 500 pi 4% (v / v) paraformaldehyd, orlov i 15 min.
- Vask og permeabilisere cellerne med 2 ml PBS-T (phosphatpufret saltvand med 0,5% (v / v) Tween-20) to gange. Celler kan opbevares i PBS-T i op til 2 måneder ved 4 ° C.
- Erstat PBS-T med 1 ml PBS-T med 10% (v / v) serum (fra den samme art som det sekundære antistof). Inkuber 1 time på pladen rocker ved stuetemperatur for at blokere ikke-specifik binding.
- Efter 1 time vaskes cellerne to gange med 2 ml PBS-T, og der inkuberes i 500 pi muse-IgG mod βIII-tubulin (fortyndet 1: 1.000 i PBS-T med 10% serum). Sæt på pladen rocker, og lad O / N ved 4 ° C.
- Fra dette trin, altid beskytte fartøjetmod lys. Vask cellerne to gange med PBS-T, hvorefter der tilsættes 500 pi fluorescens-mærket anti-muse-IgG-antistof (fortyndet til 2 ug / ml i PBS-T med 10% serum). Sæt det på pladen rocker i 1 time ved stuetemperatur.
- Skyl cellerne to gange med PBS-T, hvorefter der tilsættes 500 ul DAPI (fortyndet til 0,5 mg / ml i PBS-T) og henstår i 5 min.
- Vask cellerne igen og holde dem i PBS-T. Celler er klar til at blive fotograferet og kan opbevares i op til 2 uger ved 4 ° C. Bemærk, at GFP-signalet svinder over tid, så det er uhensigtsmæssigt at sammenligne GFP intensiteten af faste og levende celler eller af celler faste på forskellige tidspunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette forsøg anvendte vi 46C cellelinje 14, muse embryonale stamceller med et endogent Sox1-GFP reporter, for at spore neural differentiering. Ved at bruge denne cellelinie, ekspression af Sox1, en markør for neural progenitor, kan detekteres ved grøn fluorescens. Plating massefylde er en kritisk faktor for at opnå neuronal differentiering. Mus embryonale stamceller blev udpladet i 6-brønds plade ved forskellige densiteter, der varierer fra 10.500 til 88.500 celler / cm2. Figur 1A viser differentiering effektivitet opnås ved forskellige plating densiteter i en 6-brønds plade. På dag 6 af differentiering blev celler fikseret i 4% paraformaldehyd og farvet for neuronal markør βIII-tubulin. Ved den optimale densitet (10.500 celler / cm2), celler differentieres til neurale progenitorer og neuroner. Dette blev observeret af grønt fluorescerende signal fra Sox1-GFP reporter og immunfluorescerende mod neuronal markør, βIII-tubulin. En lower udpladningsdensitet førte til celledød inden for 3 dage. Imidlertid udpladning ved for høj densitet (> 36.500 celler / cm2) resulterede i nedsat andelen af grønne celler og βIII-tubulin-positive celler. Figur 1B viser et eksperiment udført i en 96-brønds plade, der krævede ca. 10 gange højere celledensitet til nå den optimale (155.000 celler / cm2) og også konfluente (362.500 celler / cm2) niveau.
Optimal tæthed kan være forskellig mellem medier præparater, medier komponent og celle batches, celletyper eller tidligere dyrkningsbetingelser. Det anbefales at optimere udpladningsdensitet for hvert forsøg. Tabel 1 indeholder intervaller af effektive plating tætheder i forskellige platforme, som bør indgå i optimeringen trin. Inden for dette område, bør det være muligt at få en tæthed, der giver en god differentiering effektivitet inden 4 - 6 dage.
Under differentiering ESC gradvist ændre deres morfologi. Figur 2 viser celle- og kolonimorfologi fra dag 1 til dag 6 efter udpladning i 6-brønds plade ved 10.500 celler / cm2. Celler blev dyrket i differentieringstilstande og fotograferet dagligt. Det er ikke usædvanligt at se en betydelig celledød på de første par dage på grund af ekstrem ændring i kulturen tilstand. Imidlertid er de resterende celler stadig i stand til at differentiere. På dag 4, begyndte cellerne at blive neurale progenitorer som grønt fluorescerende signal fra Sox1-GFP reporter først optrådte. Men selv på dag 6, ikke alle cellerne er Sox1-positive. Forventes eksistensen af nogle ikke-neurale celler, ikke desto mindre, i de rette betingelser, vil de fleste af cellerne være neurale.
Figur 1. Virkningen af udpladningsdensitet på differentiering effektivitet. To forskelligetætheder af Sox1-GFP reporter celler (46C) blev belagt og differentieret efter protokollen for 6 dage. (A) Differentiering i en 6-brønds plade. (B) Differentiering i en 96-brønds plade. Målestok:. 100 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Cell morfologier løbet differentieringsprocessen. 46C ESC blev differentieret ved 10.500 celler pr cm 2 i en 6-brønds dyrkningsplade og fotograferet dagligt for at observere ændringer i cellemorfologi. Målestok:. 300 um Klik her for at se en større version af dette tal.
| Perron | Række effektive densitet (celler / cm2) | Vifte af celle nummer til pladen | Foreslået indledende medier volumen (pl) | Foreslåede medier volumen efter dag 1 (pl) |
| 6-brønds plade | 10.500 - 36.500 | 99.750 - 346.750 | 1.000 | 2.000 |
| Plade med 24 brønde | 15.600 - 46.800 | 29.640 - 88.920 | 500 | 1.000 |
| Plade med 96 brønde | 103.500 - 260.000 | 33.120 - 83.200 | 100 | 200 |
Tabel 1. Foreslåede plating tætheder og medier mængder til forskellige skibsstørrelser. Klædningen tæthed i denne tabel blev bestemt ved hjælp af 46C cellelinje. For at opnå optimale resultater klædningen tæthed af hver enkelt linie måske skal adjusted.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den monolag neural differentiering protokol har været i brug i over et årti 6. Protokollen er meget effektiv, sammensat af defineret medium, og udført i et monolag, som gør systemet mere anvendeligt til præklinisk (f.eks lægemiddelscreening) anvendelser. Der er dog nogle kritiske faktorer, der bestemmer differentiering effektivitet. Denne artikel påpeger disse faktorer og løsningen for hver forhindring.
Densitet af cellerne efter udpladning i differentieringen tilstand er måske den mest kritiske faktor. Udpladning af cellerne ved for høj tæthed reducerer differentiering effektivitet, mens udpladning ved for lav densitet fører til celledød. Dette fænomen skyldes sandsynligvis autokrin vækstfaktor signalering. FGF4 er en autokrin vækstfaktor, der aktiverer MAPK kaskade og driver ESC differentiering 11. LIF er et andet cytokin produceret af ESC. Det aktiverer STAT3 vej og fremmer selv-fornyelse <sup> 15. Denne protokol gør brug af N2B27 at gøre neurale celler. N2B27 indeholder forskellige faktorer, som tillader ESC overlevelse og fremmer neural cellevækst, og ikke indeholder hverken LIF eller BMP4 som inhiberer neural differentiering 6. På det rette tæthed, er en passende balance mellem FGF4 og LIF signalering opretholdes der tillader ESC til at differentiere. Ved høj densitet, overskydende mængde af autokrin LIF og BMP inhiberer differentiering. I modsætning hertil har cellerne ved for lav densitet forringet overlevelse i disse temmelig minimale medier. Således når et stort antal celler uden differentiering synes klædningen nummer skal reduceres, mens en stigning i klædningen celle nummer er påkrævet, hvis der observeres en betydelig celledød.
Ud over det celleantal er der nogle andre faktorer, som indirekte påvirker udpladningsdensitet. Den første faktor er den lokale koncentration celle, afhængig af den anvendte teknik at fordele cellerne over overfladenområde. Vi fandt, at hvirvlende brønden er ikke ideel, da den koncentrerer cellerne til centrum af brønden og gør densiteten i centrum for høj, mens ved periferien massefylden bliver for lav. Andre blanding teknikker, for eksempel blande medierne med cellerne før plettering eller rokkende pladen side til side anbefales. Desuden, når et fartøj er placeret i inkubatoren, ujævn opvarmning af mediet forårsager en konvektion kraft, der trækker cellerne til centrum af brønden, hvilket resulterer i fordeling af cellerne i en koncentrisk ring mønster. Der anbefales en lavere medier volumen på klædningen dagen for at reducere denne effekt. Lade pladen uden inkubatoren i 30 min for at lade cellerne vedhæfte, samt opvarmning af mediet før blanding kan også bidrage til at opnå en homogen udpladningsdensitet.
For det andet skibstypen påvirker også udpladningsdensitet. Figur 1 viser klart, at antallet af celler / brønd ikke kan være lineært scaførte til overfladearealet af forskellige fartøjer (med andre ord kan det samme antal celler / overfladeareal ikke anvendes på hver skibstype). En mindre fartøj (med større volumen / arealforhold) påvirkes mere af medierne overfladespænding som gør en konkav overflade af mediet, det såkaldte menisken. Overfladespændingen skubber cellerne til kanten af brønden og nedsætter densitet ved midten. Eftersom medier volumen i den lille beholder er lav, medier varme op hurtigt, hvilket reducerer konvektion kraft. Derfor vil cellerne i en lille fartøj flytte til kanten af menisken effekt, og vil ikke flytte til centrum med konvektion kræfter. Således, at jo mindre fartøj, jo højere udpladningsdensitet kræves for at få den optimale densitet i centrum.
For det tredje, den tilstand af cellerne før plettering også indirekte påvirker udpladningsdensitet og differentiering effektivitet. Vi fandt en variation af den optimale tæthed i nogle forsøg. Forsøgene medhøjere dødelighed på den første dag havde brug for højere tæthed for effektiv differentiering. ESC kulturer i serum og LIF er sammensat af en heterogen population af naive pluripotente celler, primede pluripotente celler, og selv et lille antal differentierede celler 16. Celler af disse typer har forskellig evne til at overleve og differentiere under differentieringstilstande. Da protokollen dikterer om størrelsen, men ikke tilstanden af cellerne, kan nogle eksperimenter starte med mere differentierede celler, der vil dø på de første par dage, hvilket fører til en lavere massefylde end forventet. For at undgå denne variation, er konsistent kultur af ESC forpligtet til at sørge for, at konstant andel mellem hver stat bevares.
Bortset fra tæthed, timing er en anden faktor til at opnå en effektiv differentiering. I denne publikation beskriver vi dannelsen af neurale stamceller inden for 6 dage. Dog kan den tid være forskellige afhængigt af tilstanden afudgangs ESC kultur. Som beskrevet ovenfor, ESC kulturer er blandede populationer, der kan reagere forskelligt på differentiering tilstand. Ikke kun cellens overlevelse, men også timingen af differentiering vil blive påvirket af kulturen sammensætning. Denne protokol kan anvendes på de fleste ESC dyrkningsbetingelser fx i N2B27 medier indeholdende LIF og BMP4 eller 2i og LIF. Men hvis der er flere naive celler i kulturen, kan kræves en længere frist for effektiv differentiering. Dette skyldes naive celler har brug for mere tid til at skifte til en primet tilstand og derefter differentiere til neurale stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-074 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| B-27 Supplement, serum free | Life Technologies | 17504-044 | |
| Insulin | Sigma | I6634 | Reconstitute with sterile 0.01 M HCl |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | Reconstitute with sterile water |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Reconstitute with ethanol |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Reconstitute with sterile water |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | Reconstitute with sterile water |
| Bovine albumin fraction V | Life Technologies | 15260-037 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented |
| Gelatine | Sigma | G1890 | |
| 6-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 140675 | |
| 24-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 142475 | |
| 96-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 167008 | |
| GMEM | Life Technologies | 11710-035 | |
| MEM Non-essential amino acids solution | Life Technologies | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Leukaemia inhibitory factor | prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Protect from light |
| Mouse anti βIII tubulin IgG antibody | Covance | MMS-435P | |
| Fluorescence-labelled anti-mouse IgG antibody | Life Technologies | A31571 | Protect from light |
| 25 cm2 tissue culture flask | Thermo Scientific | 156367 |
References
- Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Fraichard, A., et al. In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).
- Strubing, C., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons. Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).
- Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).
- Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
- Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation. Development. 137, 881-890 (2010).
- Speakman, C. M., et al. Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition. Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).
- Kunath, T., et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development. 134, 2895-2902 (2007).
- Dani, C., et al. Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway. Dev Biol. 203, 149-162 (1998).
- Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).
- Aubert, J., et al. Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, Suppl 1. 11836-11841 (2003).
- Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).
- Silva, J., Smith, A.
