Abstract
nöral progenitörlerin fare embriyonik kök hücreleri ayırt etmek yeteneği (ESC) nöral özellikleri yanı sıra, daha fazla çalışma için olgun nöral hücre tiplerinin üretimini kontrol eden mekanizmaların çalışmasını sağlar. Bu protokolde serum serbest, tek tabaka kültürü kullanarak sinir atalarıdır için ESC farklılaşması için bir yöntem açıklanmaktadır. yöntem, etkili, ölçeklenebilir ve 4 içinde% 70 nöral projenitör hücrelerinin ~ üretimi ile sonuçlanır - 6 gün. Bu, çeşitli koşullar altında yetiştirilen çeşitli suşlardan ESC uygulanabilir. Sinir progenitörler, mikroskopla fonksiyonel nöronlar ve glia veya analiz içine daha ayırt sitometri veya moleküler teknikler akmasına izin verilebilir. farklılaşma süreci zaman atlamalı mikroskopi için uygun olduğunu ve nöral şartname sürecini izlemek üzere raportör hatlarının kullanımı ile kombine edilebilir. Biz sürecin b izin medya hazırlanması ve hücre yoğunluğu optimizasyonu hakkında ayrıntılı yönergeler sağlarE en ESC hatları ve hücre kültür kapları çeşitli uygulanan.
Introduction
Embriyonik kök hücreler, sinjeneik ya da bağışıklık yetersizliği konaklara (a Kimera oluşturarak) uygun bir aşamada embriyo yeniden yerleştirilmesi, aşağıdaki tüm yetişkin hücre tiplerine farklılaşma yetisine, enjeksiyon koruyarak, in vitro olarak sonsuza çoğalma kapasitesi ile erken embriyodan türetilen pluripotent hücreler (Bir teratom oluşturarak) ya da uygun işaretlere 1 in vitro konu. Nöral soy içine fare embriyonik kök hücrelerinin in vitro farklılaşması ve 1995 tarif edilmiştir ve morfojen retinoik asit ile takviye edilmiş 2-4 serum ihtiva eden ortam içinde çok-hücreli süspansiyon agregatların oluşumunu (embriyoid organları, EBS) yer aldı. O zamandan bu yana çeşitli protokoller nöral farklılaşma 5 izin vermek için geliştirilmiştir. Hala toplanmasını kullanmak Birçok diğerleri hücre tipleri indükleyici ile-kültür co ve çeşitli serum serbest medya kullanımını içerir. Tüm protokoller avantajlara bir olmasınd dezavantajları ve sinirsel hassas doğası veya nöronal hücreleri de kullanılan protokole göre değişir üretti.
İdeal protokol, sağlam ölçeklenebilir olması ve tam olarak tanımlanmış medya ve yüzeylerde faydalanmak, farklılaşma sürecinin non-invazif izleme için uygun olmalı ve mümkün sinirsel atalarıdır saf popülasyonlarının nesil neden dış ipuçlarının tarafından ve ayırt desenli olmak istiyorum nispeten kısa bir süre içinde yüksek verim ve verim bütün nöronal ve glial alt tiplere. Son düzine yıllarda biz bir düşük yoğunluklu, serum serbest yapışık tek tabaka kültürü 6-10 fare ESC nöral atalarıdır ve nöronlar üretmek için bir yöntem kullanıyoruz. Bu protokol, yukarıda belirtilen kriterler içinde, birçok yerine getirir: Elimizdeki farklılaşma verimliliği oldukça uzun yıllar boyunca tutarlı ve hücre çizgileri, çeşitli olmuştur, bu yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir edilebilir (başarıyla 96 oyuklu plakalar, damar kullanımı 15 cm çapında dio kız) ve kullanılan ortam iyi tanımlanmış bulunmaktadır. süreci (dopaminerjik nöronların 6 örneğin, Shh ve FGF8) nöronal alt tiplerinin farklı tiplerinin üretimini indüklemek için ilave edilebilir farklılaşma izlenmesi ve desen ipuçlarının çeşitli timelapse mikroskopi elverişlidir.
Yine, bu protokolün başarılı bir uygulama için bazı zorluklar vardır. Anahtar yönlerinden biri medyanın dikkatli bir hazırlık olduğunu. Biz her zaman ticari alternatiflerin varlığına rağmen içi ortam hazırlar. Kullanılan takviyeleri biri (N2; Protokolü bakınız) standart piyasada mevcut sürümleri üzerinde değişiklikler vardır. Son olarak, bu yöntemin başarılı bir uygulama için en önemli adımlardan biri kaplama optimum hücre yoğunluğudur. Uyaran sinyallerin biri (Fgf4 11) otokrin yapısı gerektirirken, bu yeterli hücre uygun viabil izin vermek için mevcut olması esas olarakçok yüksek yoğunlukları farklılaşma de Sığ ve farklılaşma, (nedeniyle LIF 12 otokrin üretimine muhtemelen kısmen) bozulur. Hem medya hazırlama ve hücre kaplama özenle yapılır ve sürekli optimum sonuçlar sağlamak için bu nedenle önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Medya Hazırlık
Not:: 1 oranında, tipik olarak 1, B27 eki ile takviye modifiye N2 ek ve Neurobasal ile desteklenmiş DMEM / F12: Protokol iki ayrı ortam karışımı kullanımına dayanır.
- 15 ml'lik bir tüp içinde bileşenlerin karıştırılması ile değiştirilmiş N2 ek hazırlayın. Vorteks veya bu filtre etmeyin; çözüm netleşene kadar tersini tüp karıştırın.
- Daha sonra, (0.01 M HCl içinde yapılır) 25 mg / ml insülin 1 ml ilave edilir ve tersini tüp iyice karıştırın, DMEM / F12 içinde 7.2 ml pipetleme başlayın. Çözelti berrak olana kadar bu birkaç dakika sürer.
- (Su içinde oluşan), 100 mg, 1 ml / ml apo-transferrin, mi progesternone (etanol içinde oluşan) / 0.6 mg 33 ul, 160 mg / ml (1 M), putreskin, 100 ul (su içinde yapılan ), 10, su içinde yapılır 3 mM sodyum selenit () ve% 7.5 sığır serum albümini 666 ul ul ve de tüp karıştırın. -20 ° 2.5 ml kısım ve mağaza2 aya kadar ısıtılır.
- Ortamı hazırlayın.
- DMEM / F12 içinde 250 ml'lik bir N2 2.5 ml. İyice karıştırın ama sallamak ya da filtre yoktur.
- Neurobasal 250 ml'lik ortam B27 ek 5 ml ekleyin. İyice karıştırın ama sallamak ya da filtre yoktur.
- : 1 oranında bir 1 adım 1.2.1 ve 1.2.2 medya karıştırın. 1 Bazı durumlarda: 3 karışım gerekebilir (: Adım 1.2.4 1 mix 1 olarak desteklenmiş).
- Karışımına L-glutamin (son konsantrasyon 0.2 mM) ve 2-merkaptoetanol (nihai konsantrasyon 0.1 mM) 3.5 ul 0.5 ml ilave edilir ve çalkalamadan iyice karıştırın. En fazla 3 hafta boyunca 4 ° C'de muhafaza edilir ve ortam ışığına maruz kaçının. Bu son karışım N2B27 olarak adlandırılır.
- Jelatin çözeltisi hazırlayın.
- 15 dakika boyunca, 121 ° C, 15 psi, ultra saf su ve otoklav içinde% 1 jelatin çözeltisi hazırlayın. Bunun için kullanılan şişe deterjan veya dezenfektan tamamen temiz olması önemlidir, bu yüzden yeni bir şişe tavsiye edilirBu işlem için kullanılan ve sadece hiç kullanımlar arasında, aşırı saf su içinde çalkalanır. 50 ml'lik miktarlar halinde% 1 çözeltisi eş-payı ve ay için 4 ° C'de tutun.
- Çözülene kadar 37 ° C su banyosu içinde,% 1 jelatin bir kısım ısıtın ve ılık fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) 500 ml ekle. İyice karıştırın ve iyi ya da plaka her alt karşılamak için yeterli pipetlemeyin. En az 30 dakika süreyle kaplamak için jelatin satıh izin verir.
2. Hücreler Kaplama
NOT: Bu protokol, lösemi önleyici faktör (LİF), LİF ve kemik morfogenetik protein 4 (BMP4) veya MEK ve GSK3 inhibitörlerinin (2R ortam) sahip LIF ve serumsuz ortam ile, serum yerine% 10 serum içinde yetiştirilen fare ESC için de geçerlidir veya LİF yoktur. Bununla birlikte, farklılaşma zamanlaması ve verimlilik ortam ve hücreler (tartışmaya bakınız) bağlı olarak değişebilir. Burada gösterilen deneyler için biz bir EGFP muhabiri o içine çaldı vardır (46C fare ESC hattını kullanılan% 10 serum ve LİF ile GMEM yetiştirilen endojen Sox1 allel NE). En iyi sonuçlar için, hücreler ayrılmış ve N2B27 ortam içinde yeniden kaplanmıştır olması önemlidir; N2B27 zaman hücrelerin şarjı ile karşılaştırıldığında daha düşük bir farklılaşma verimi ile sonuçlanır basitçe GMEM / serum / LİF ortamların değiştirilmesi.
- % 10 serum, 1 mM sodyum piruvat, 1 x esansiyel olmayan amino asitler ile GMEM hücreler büyümek 0.1 M 2-merkaptoetanol ve 100 birim / ml LİF 13. Fare ESC, plaka SUBCONFLUENT kültürünü almak için 2 götürecek bir T25 kültür balona 1 x 10 6 hücre - 3 gün.
- Aydınlık alan mikroskobu altında hücreleri gözlemleyin. Hücreler geçişine SUBCONFLUENT ve hazır olduğunuzda, PBS içinde iki kez yıkayın. Hücre ayrışma reaktifi 1 ml ilave edilir ve 2 için inkübatöre geri - 5 dak. Tripsin ve diğer enzimler de hücre ayrılma için kullanılabilmesine rağmen kaplama yoğunlukları olması gerekir, bu yüzden onlar Adju hücre eki üzerinde olumsuz bir etkisi olabilirsted.
- Hücreler plaka kaldırmaya başlıyor sonra, tek bir hücre süspansiyonu içine çıkarmak için gemi dokunun. 15 ml'lik bir santrifüj tüpü içine ortam ve hücre ayrışma reaktif ve pipet 10 ml toplam içine hücreleri toplamak.
- Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g'de hücreleri dönerler.
- Dikkatle süpernatant aspire ve aşağı 3 yukarı pipetleme tarafından önceden ısıtılmış N2B27 10 ml pelletini - 5 kez. Aşağı süspansiyon pipetleme yaparken, tüpün kenarına pipet hava kabarcıkları oluşturarak önlemek için. Otomatik hücre sayacı veya haemocytometer ile hücre sayımı ve konsantrasyon kaydedin.
- Birim hacim başına hücre istenen sayıda ihtiva eden bir hücre süspansiyonu önceden ısıtılmış N2B27 içinde oyuk başına kaplama için hazırlayın. 6-çukurlu tabak cm2 başına 10,500 hücre olan bir yoğunlukta (yani, 6-çukurlu tabak oyuk başına 1 x 10 5 hücre) en uygunudur. Cm2 ve pla başına hücre önerilen sayıda Tablo 1'e bakınızHücre kültürü damarlarının çeşitli ting medya hacimleri.
- Kültür kabından jelatin aspire ve Tablo 1'de önerilen yoğunluğu ve hacmine göre hücre süspansiyonu plaka. Bu merkeze hücreleri konsantre olacak gibi plakaları girdap etmeyin. 37 ° C'de,% 5 CO2 de nemli bir inkübatörde kültür yerleştirin.
- Taze N2B27 ile tüm medya değiştirerek 2 gün - her 1 ortam değiştirin. Pipet hafifçe yoğunluğunu etkiler ve önümüzdeki günlerde farklılaşma verimliliği azaltmak olabilir hücreleri kızarma olarak. Kaplama sonraki ilk canlılık yoksul olduğu durumlarda, 1 hücreleri plaka: N2 ve B27-desteklenmiş medya 3 karışımı ve ilk iki gün sonra N2B27 bu değiştirin. Hücreler ayırt başlayacak ve 4 içinde (burada kullanılan 46C hücre hattında muhabiri yeşil floresan görünür) Sox1 ifadesini göstermesi gerekir - 6 gün.
3. Immunofluorescent Boyama
HAYIRTE: protokol her gemi tipine uygulanabilir. her reaktif hacmi 6-çukurlu plaka içinde çukur başına anlatılan herhangi bir yüzey alanına ölçeklendirilebilir. Şarjı sonradan düşük canlılığı nedeniyle tavsiye edilmez.
- Farklılaşma Ortamı çıkarın ve 4,% 500 ul (h / h) paraformaldehit eklenerek hücrelerin tespit, 15 dakika boyunca bırakın.
- Yıkayıp ((hac / hac) Tween-20% 0.5 fosfat tamponlu tuzlu su), iki kez PBS-T 2 ml hücre geçirgenliği. Hücreler, 4 ° C'de 2 aya kadar PBS-T içinde tutulabilir.
- % 10 (sekonder antikor ile aynı türden) (v / v) serumu ile PBS-T, 1 ml PBS-T değiştirin. Herhangi bir spesifik olmayan bağlanma bloke etme oda sıcaklığında levha rocker 1 saat inkübe edin.
- 1 saat sonra, PBS-T 2 ml hücreler iki kez yıkayın ve βIII-tubulin karşı 500 ul fare IgG inkübe (:% 10 serum ile PBS-T içinde 1000: 1 seyreltilmiş). Plaka rocker koyun ve 4 ° C'de O / N bırakın.
- Bu adımdan itibaren, her zaman gemiyi korumakışıktan. Daha sonra (% 10 serum ile PBS-T içinde 2 ug / ml'ye seyreltilmiş) floresan-etiketli anti-fare IgG antikoru 500 ul PBS-T ile hücreler iki kez yıkanır. Oda sıcaklığında 1 saat plaka rocker koy.
- Daha sonra DAPI 500 ul PBS-T ile hücreler iki kez yıkayın (PBS-T içinde 0.5 ug / ml'ye seyreltilmiş) ve 5 dakika boyunca bırakın.
- Tekrar hücreleri yıkayın ve PBS-T saklayın. Hücreler çekilmeye hazır olduğunu ve 4 ° C'de 2 haftaya kadar saklanabilir. Bu sabit ve canlı hücre ya da farklı zamanlarda, sabit hücrelerde GFP yoğunluğunu karşılaştırma uygunsuz şekilde GFP sinyali, zaman içerisinde kaybolur edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu deneyde, nöral farklılaşma izlemek için, bir endojen Sox1-GFP raportör ile, fare embriyonik kök hücreleri 46C hücre hattı 14 kullanılır. Sox1 nöral progenitor için bir marker Bu hücre hattı, ifade kullanılarak, yeşil floresan tespit edilebilir. Yoğunluğu Kaplama nöronal farklılaşma elde etmek için kritik bir faktördür. Fare embriyonik kök hücreleri / cm2 10,500 88.500 hücre arasında değişen farklı yoğunluklarda 6-çukurlu plaka içinde plakalanmıştır. Şekil 1A, 6-çukurlu plaka içindeki farklı kaplama yoğunlukları elde farklılaşma verimi gösterir. Farklılaşma 6. günde, hücreler% 4 paraformaldehid içinde sabitlendi ve nöronal belirteç βIII-tubulin için boyandı. Optimal yoğunluğu (10.500 hücre / cm 2), hücreler sinir atalarıdır ve nöronlara farklılaşmış. Bu nöronal marker, βIII-tübülin karşı Sox1-GFP raportör ve immunofloresans yeşil flüoresan sinyali ile gözlenmiştir. A loWer kaplama yoğunluğu 3 gün içinde hücre ölümüne neden oldu. Bununla birlikte, çok yüksek yoğunlukta kaplama (> 36,500 hücre / cm2), yeşil hücreler ve βIII-tubulin pozitif hücrelerin azalan oranı ile sonuçlanmıştır. Şekil 1B ila yaklaşık 10 kat daha fazla hücre yoğunluğu gerekli 96-çukurlu plaka içinde gerçekleştirilen bir deneyi gösterir Optimal (155,000 hücre / cm2) ve (362.500 hücre / cm2) düzeyinde çok konfluent ulaşır.
Optimal yoğunluğu Ortam preparatlanmn, ortam bileşeni ve hücre gruplar, hücre tipleri, ya da önceki kültür koşulları arasında farklı olabilir. Her bir deney için kaplama yoğunluğu etkin kılmak için tavsiye edilir. Tablo 1, iyileştirme adımı dahil edilmelidir çeşitli platformlarda etkili kaplama yoğunlukları aralıklarını içerir. 6 gün - bu aralıkta, bu 4 içinde iyi bir farklılaşma verimliliği sağlayan bir yoğunluğa almak mümkün olmalıdır.
Farklılaşma E sırasındaKademeli. Morfoloji değiştirme Şekil 2, SC 10500 hücre / cm2, de 6-oyuklu bir plaka içerisinde kaplama sonrası günden 6. güne 1 hücre ve koloni morfolojisi gösterir. Hücreler, farklılaşma koşullarında kültürlenmiş ve her gün fotoğraflandı. Nedeniyle kültür durumda aşırı değişime ilk birkaç gün önemli hücre ölümünü görmek alışılmadık bir durum değildir. Ancak, geri kalan hücreler hala ayırt edebiliyoruz. 4. günde, hücreler öncelikle ortaya Sox1-GFP muhabiri yeşil floresan sinyali olarak nöral atalarıdır olmaya başladı. Ancak, daha 6. günde, tüm hücreleri, Sox1-pozitiftir. Bazı olmayan sinir hücrelerinin varlığı yine de, uygun koşullar altında, hücrelerin çoğunluğunun nöral olacaktır beklenmektedir.
Şekil 1. farklılaşma verimliliği kaplama yoğunluğunun etkisi. İki farklıSox1-GFP raportör hücrelerinin (46C) yoğunlukları 6 gün için olan protokole uygun olarak kaplanmıştır ve farklılaştırılmıştır. 6-çukurlu plaka içinde (A) Farklılaşma. Bir 96-yuvalı plaka içinde (B) Farklılaşma. Ölçek çubuğu:. 100 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Farklılaşma sürecinde Şekil 2. Hücre morfolojisi. 46C ESC 6 kuyu kültür plaka cm2 başına 10.500 hücre farklılaşmış ve hücre morfolojisi değişiklikleri gözlemek için günlük fotoğraflandı. Ölçek çubuğu:. 300 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Platform | Etkili yoğunluk aralığı (hücre / cm 2) | Hücre sayısı aralığı plaka | Önerilen başlangıç medya hacmi (ul) | Gün 1 (ul) sonra Önerilen ortam hacmi |
| 6-çukurlu plaka | 10,500 - 36,500 | 99.750 - 346.750 | 1000 | 2,000 |
| 24-çukurlu plaka | 15.600 - 46.800 | 29.640 - 88.920 | 500 | 1000 |
| 96-çukurlu plaka | 103.500 - 260.000 | 33120 - 83200 | 100 | 200 |
Tablo 1. Farklı damar boyutları için yoğunluklara ve ortam hacimleri kaplama tavsiye edilir. Bu tabloda kaplama yoğunlukları 46C hücre soyu kullanılarak tespit edilmiştir. En iyi sonuçlar için, her bir hattın kaplama yoğunluğu adj gerekebilirusted.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
tek tabaka sinir farklılaşma protokolü on üzerinden 6 kullanımda olmuştur. Protokol tanımlanan ortam oluşan ve pratik için sistem daha uygulanabilir kılan bir tek-tabakalı sistemde yapılır, yüksek verimli (örneğin, ilaç tarama) kullanır. Ancak, farklılaşma etkinliğini belirleyen bazı kritik faktörler vardır. Bu makalede, bu faktörleri ve her engel için çözüm işaret ediyor.
Farklılaşma durumu kaplama sonrası hücrelerin yoğunluğu belki de en önemli faktördür. Çok düşük yoğunlukta kaplama hücre ölümüne neden olurken çok yüksek bir yoğunlukta hücreler kaplama, farklılaşma verimini azaltır. Bu olgu nedeniyle otokrin büyüme faktörü sinyal muhtemeldir. Fgf4 MAPK kaskadı aktive ESC farklılaşmasını 11 tahrik eden bir otokrin büyüme faktörüdür. LIF ESC tarafından üretilen bir başka sitokindir. Bu <STAT3 yolunu aktive eder ve kendini yenileme teşviksup> 15. Bu protokol N2B27 kullanımı nöral hücreleri yapmak için yapar. N2B27 ESC sürdüreceği çeşitli faktörler içerir ve nöral hücre büyümesini teşvik ve nöral farklılaşma 6 inhibe lif ya BMP4 da içermez. Uygun yoğunlukta, Fgf4 ve LİF sinyallemesinin uygun bir bilançosu ESC ayırt olanak sağlayan korunur. Yüksek yoğunluklu, otokrin LIF ve BMP inhibe farklılaşma aşırı miktarda. Buna karşılık, çok düşük yoğunlukta hücrelerin bu oldukça minimal ortamlarda hayatta engelli var. Farklılaşma olmadan hücrelerin çok sayıda görünür olduğunda, çok hücre ölümü görülür, eğer kaplama hücre sayısının artması gerekmektedir, oysa Böylece, kaplama numarası azaltılmalıdır.
Hücre sayısı yanı sıra dolaylı olarak kaplama yoğunluğu etkileyen diğer bazı faktörler de vardır. İlk faktör eşit yüzey üzerinde hücreleri dağıtmak için kullanılan tekniğe bağlıdır yerel hücre konsantrasyonu olduğunualanı. Biz kuyunun merkezine hücreleri konsantre ve periferinde yoğunluğu çok düşük olurken, çok yüksek merkezde yoğunluk yapar bu yana kuyusunu dönen ideal olmadığını gördük. Kaplama, veya plaka yan-yan sallanan önce hücrelerle medya karıştırma, örneğin diğer karıştırma teknikleri, tavsiye edilir. Ayrıca, bir kap inkübatör yerleştirildiği zaman, orta düzensiz ısıtma konsantrik halka şeklinde hücrelerinin dağılımı ile sonuçlanan, iyi merkezine hücreleri çeken bir konveksiyon kuvvetin değişmesine neden olur. Kaplama gününde bir alt medya hacmi bu etkiyi azaltmak için tavsiye edilir. 30 dakika boyunca inkübatör dışında plaka bırakılması hücreler de homojen bir kaplama yoğunluğu elde etmenize yardımcı olabilir karıştırmadan önce orta ısınma yanı sıra eklemek izin.
İkincisi, gemi tipi de açıkça kaplama yoğunluğu. Şekil 1 etkileyen / kuyu hücre sayısı lineer sca olamayacağını gösteriyorFarklı damar yüzey alanına yol (diğer bir deyişle, hücre / yüzey alanı aynı sayıda her kap tipine uygulanabilir değildir). (Daha büyük hacim / alanı oranı ile birlikte) daha küçük bir kap orta denilen menisküsün bir konkav yüzey oluşturur ortam yüzey gerilimi daha etkilenir. yüzey gerilimi oyuk kenarına hücreleri iter ve merkezde yoğunluğunu azaltır. Küçük bir kapta medya hacmi düşük olduğundan ek olarak, medya konveksiyon kuvvetini azaltarak, hızlı ısınma. Bu nedenle, küçük bir kap içinde hücreler menisküs etkisiyle kenarına hareket edecek ve konveksiyon güçleri tarafından merkeze hareket etmeyecektir. Merkezde optimum yoğunluğu elde etmek için gerekli olan kaplama yoğunluğu yüksek, gemi Böylece, küçük.
Üçüncüsü, hücrelerin durumu kaplama öncesinde de dolaylı olarak kaplama yoğunluğu ve farklılaşma verimliliği etkiler. Biz bazı deneylerde optimum yoğunluk bir varyasyon bulundu. deneyleriilk gününde yüksek ölüm oranı verimli farklılaşması için yüksek bir yoğunluğa gerekli. Serum ve LIF ESC kültürleri naif pluripotent hücrelerin heterojen nüfus, astar pluripotent hücreler ve farklılaşmış hücrelerin 16 bile az sayıda oluşmaktadır. Bu tip hücreler hayatta ve farklılaşma koşulları altında ayırt etmek için farklı bir yeteneği vardır. Protokol numarası değil, hücrelerin devlet üzerinde dikte yana, bazı deneyler beklenenden daha düşük bir yoğunluğa yol açan, ilk birkaç gün ölecek daha farklılaşmış hücreler ile başlayabilir. Bu varyasyon önlemek için, ESC tutarlı kültürü her devlet arasında sürekli orantı korunur emin olmak için gereklidir.
Dışında yoğunluktan, zamanlama verimli farklılaşma ulaşmak için başka bir faktördür. Bu yayında, biz 6 gün içinde sinir atalarıdır nesil açıklar. Ancak, zaman durumuna bağlı olarak farklı olabilirBaşlangıç ESC kültürü. Yukarıda tarif edildiği gibi, ESC kültürleri farklılaşma durumu farklı yanıt Karıştırılan popülasyonlarıdır. Hücrelerin hayatta kalma ayrıca farklılaşma zamanlaması sadece kültür kompozisyonu tarafından etkilenecektir. Bu protokol, LİF ve BMP4 veya 2i ve LİF içeren N2B27 ortam içinde en ESC kültür koşulları, örneğin uygulanabilir. Daha naif hücreleri kültürde vardır Ancak, daha uzun bir süre etkili farklılaşması için gerekli olabilir. Naif hücreleri prime duruma geçmek için daha fazla zamana ihtiyacı ve daha sonra sinirsel atalarıdır için ayırt edecek olmasıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-074 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| B-27 Supplement, serum free | Life Technologies | 17504-044 | |
| Insulin | Sigma | I6634 | Reconstitute with sterile 0.01 M HCl |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | Reconstitute with sterile water |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Reconstitute with ethanol |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Reconstitute with sterile water |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | Reconstitute with sterile water |
| Bovine albumin fraction V | Life Technologies | 15260-037 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented |
| Gelatine | Sigma | G1890 | |
| 6-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 140675 | |
| 24-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 142475 | |
| 96-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 167008 | |
| GMEM | Life Technologies | 11710-035 | |
| MEM Non-essential amino acids solution | Life Technologies | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Leukaemia inhibitory factor | prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Protect from light |
| Mouse anti βIII tubulin IgG antibody | Covance | MMS-435P | |
| Fluorescence-labelled anti-mouse IgG antibody | Life Technologies | A31571 | Protect from light |
| 25 cm2 tissue culture flask | Thermo Scientific | 156367 |
References
- Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Fraichard, A., et al. In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).
- Strubing, C., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons. Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).
- Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).
- Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
- Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation. Development. 137, 881-890 (2010).
- Speakman, C. M., et al. Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition. Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).
- Kunath, T., et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development. 134, 2895-2902 (2007).
- Dani, C., et al. Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway. Dev Biol. 203, 149-162 (1998).
- Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).
- Aubert, J., et al. Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, Suppl 1. 11836-11841 (2003).
- Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).
- Silva, J., Smith, A.
