Summary
Lange-termijn gekweekte interferon-γ enzymgebonden immunospot assay wordt gebruikt als maat voor centraal geheugen responsen en correleert met beschermende anti-mycobacteriële vaccinresponsen. Met deze assay worden perifeer bloed mononucléaire cellen gestimuleerd met mycobacteriële antigenen en interleukine-2 voor 14 dagen, waardoor differentiatie en expansie van centrale geheugen T-cellen.
Abstract
Effector en geheugen T-cellen worden gegenereerd door middel van ontwikkeling programmeren van naïeve cellen na antigeenherkenning. Als de infectie onder controle tot 95% van de T-cellen die tijdens de expansiefase geëlimineerd (bijv. Contractie fase) en geheugen-T-cellen blijven soms een mensenleven. Bij de mens zijn twee functioneel verschillende subsets van T-geheugencellen beschreven op basis van de expressie van lymfeknoop homing receptoren. Centrale geheugen T-cellen brengen CC chemokine receptor 7 en CD45RO en zijn voornamelijk gevestigd in de T-cel gebieden van secundaire lymfoïde organen. Effector memory T-cellen brengen CD45RO, gebrek CCR7 en display-receptoren in verband met lymfocyt homing naar perifere of ontstoken weefsels. Effector-T-cellen niet tot expressie ofwel CCR7 of CD45RO maar bij confrontatie met antigen produceren effector cytokinen, zoals interferon-γ. Interferon-γ afgifte assays worden gebruikt voor de diagnose van boviene en humane tuberculose endetecteren voornamelijk effector en effector memory T celresponsen. Centrale geheugen T cellen door CD4 + T-cellen vaccinatie, anderzijds, kunnen worden gebruikt om vaccinwerkzaamheid voorspellen, zoals aangetoond met simian immunodeficiency virus infectie van niet-menselijke primaten, tuberculose in muizen en malaria bij de mens. Verschillende studies met muizen en mensen als ongepubliceerde gegevens over runderen, hebben aangetoond dat interferon-γ ELISPOT assays meten centrale geheugen T cellen. Met dit assay, perifeer bloed mononucleaire cellen gekweekt afnemende concentratie van antigeen voor 10 tot 14 dagen (langetermijnkweek), waardoor effector respons piek en afnemen; vergemakkelijking centrale geheugen T-cellen te differentiëren en uitbreiding in de cultuur.
Introduction
Effector en geheugen T-cellen worden gegenereerd door middel van ontwikkeling programmeren van naïeve CD4 + T-cellen na antigeen- herkenning. Differentiatie van naïeve CD4 + T-cellen in cytokine producerende cellen vereist pathogeen herkenning door aangeboren immuuncellen, antigeenpresentatie aan T-cellen, co-stimulatie en transcriptionele veranderingen resulterend in gepolariseerd cytokineproductie. Bijvoorbeeld: antigeenpresenterende cellen interleukine (IL) -12 in reactie op intracellulaire pathogenen, die samen met antigenherkenning, stimuleert differentiatie van T-cellen tot T helper 1 (Th1) cellen 1,2 door signalering via signaal transducer en activator van transcriptie 4 (STAT4) en T-box tot expressie gebracht in T-cellen (T-bet), leidend tot celactivering IL-2 productie, klonale expansie en interferon (IFN) -γ productie 3,4. Als de infectie wordt gecontroleerd tot 95% van de T-cellen die tijdens de expansiefase geëlimineerd (dwz samentrekkingfase) en het geheugen T-cellen blijven, soms voor een mensenleven 5. Sallusto et al. 6 onthulde twee functioneel verschillende subsets van geheugen-T-cellen bij de mens gebaseerd op de expressie van lymfeknoop homing receptoren. Centrale geheugen T-cellen (TCM) uiten CC chemokine receptor (CCR) -7 en CD45RO en zijn voornamelijk gevestigd in de T-cel gebieden van secundaire lymfoïde organen. Tcm hebben effector functie, een lage activering drempel en behouden hoge IL-2 productie en proliferatieve capaciteit beperkt. Effector memory T-cellen (TEM) te uiten CD45RO, gebrek CCR7 en display-receptoren voor homing naar perifere of ontstoken weefsel. Effector cellen niet tot expressie ofwel CCR7 of CD45RO maar snel produceren effector cytokinen zoals IFN-γ, na antigene herkenning.
IFN-γ afgifte assays (IGRA) worden gebruikt voor de diagnose van boviene en humane tuberculose 7. Mycobacterium bovis de belangrijkste agent van rundertuberculose (BTB), terwijl menselijk cases van tuberculose worden vooral veroorzaakt door Mycobacterium tuberculosis. Bij deze proeven volbloed of perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) worden gestimuleerd met mycobacteriële antigenen gedurende 16 tot 24 uren en IFN-γ productie in het supernatant wordt gemeten door ELISA of door detectie van cellen die IFN-γ behulp ELISPOT techniek. Door de korte stimulatieperiode (bijv., 16 tot 24 uur) en snelle cytokineproductie, ex vivo assays detecteren hoofdzakelijk effector en Tem reacties. Dit is bevestigd door flow cytometrische analyse van celpopulaties in deze kweken 8-10.
Ex vivo IFN-γ reacties zijn gewoonlijk opgenomen in de immuunrespons panel evaluatie van tuberculose vaccins, waaronder die welke worden gebruikt om reacties van vee evalueren. Het meest effectief rundertuberculose vaccins wekken specifiek IFN-γ responsen, maar niet alle vaccins die IFN-γ responsen induceren protective. Ook niveaus van IFN-γ opgewekt door vaccinatie, gemeten voor infectie, niet noodzakelijkerwijs correleren met bescherming. Zo kunnen verschillende BCG stammen verschillende capaciteiten moeten ex vivo IFN-γ induceren, ondanks gelijkaardige beschermingsniveaus 11. Zo, ex vivo IGRAs zijn waardevol voor tuberculose diagnose en voor de toegang tot het vaccin immunogeniciteit; echter, het gebruik als voorspellers van vaccineffectiviteit beperkt. Tcm op de vaccinatie, anderzijds, kunnen worden gebruikt om vaccinwerkzaamheid voorspellen, zoals aangetoond met simian immunodeficiency virus (SIV) -infectie bij niet-humane primaten 12,13, tuberculose in muizen 14 en malaria bij de mens 15,16.
Na een effectieve immuunrespons resulteert in pathogeen klaring worden TCM onderhouden en bescherming bij een eventueel tweede infectie door hetzelfde middel. Een opmerkelijke uitzondering op dit scenario is M. tuberculose Infectie van mensen waarbij patiënten die curatieve anti-mycobacteriële therapie gevoelig voor herinfectie 17,18. Bovendien, gebeurtenissen betreffende immunologisch geheugen tijdens chronische infecties, waarbij het antigene stimulatie aanhoudt, zijn niet goed begrepen 19. Tijdens chronische infecties, zoals bij humaan immunodeficiëntie virus (HIV) en tuberculose, is een aanzienlijke TCM respons geassocieerd met een gunstig resultaat (bijvoorbeeld latentie tuberculose en subklinische ziekte HIV) 20,21. Verschillende studies met muizen en mensen hebben aangetoond dat langdurige gekweekte IFN-γ ELISPOT assays meten TCM reacties 16,20-22. Met dit assay, PBMC gekweekt afnemende concentratie van antigeen voor 10 tot 14 dagen, waardoor effector respons piek en afnemen; vergemakkelijken Tcm te differentiëren en uit te breiden binnen de cultuur.
Lange-termijn gekweekte IFN-γ ELISPOT assays zijn ook gebruikt in de veterinaireonderzoek, maar het fenotype van reagerende cellen is moeilijk te beoordelen als gevolg van een gebrek aan kritische reagentia, in het bijzonder een antilichaam tegen CCR7. Effectieve rundertuberculose vaccins [bv. met een enkele dosis M. bovis Bacille Calmette Guerin (BCG), BCG gevolgd door virale-vectored Antigeen 85A subunit vaccin, of verzwakt M. bovis ΔRD1] uitlokken lange termijn gekweekte-IFN γ ELISPOT reacties na vaccinatie die correleren met bescherming (dwz lagere mycobacteriële lasten en verminderde TB-geassocieerde pathologie) tegen daaropvolgende challenge met virulent M. bovis 23,24. Ook het aantal antigeenspecifieke IFN-γ-uitscheidende cellen in lange-termijn PBMC kweken zijn hoger bij 12 maanden, maar verminderen bij 24 maanden na BCG-vaccinatie van neonatale kalveren, correleert met de mate van bescherming detecteerbaar bericht M. bovis uitdaging 25. In dit scenario, de gekweekte IFN-γ ELISPOT is eenn belangrijk instrument voor het voorspellen van werkzaamheid van het vaccin, een middel om vaccin kandidaten voor hoge kosten-effectiviteit studies prioriteit. Bovendien kunnen gekweekte ELISPOT technieken worden aangepast voor verschillende gastheren, pathogenen en cytokinen door het veranderen antigenen of antilichamen voor verschillende bewerkingen in verschillende onderzoeksgebieden.
Protocol
1. Bereid de volgende oplossingen
- Bereid compleet RPMI (cRMPI) door toevoeging van foetaal runderserum (FBS) tot een concentratie van 10% (volume / volume), glutamine (2 uM), natriumpyruvaat (1 uM), niet-essentiële aminozuren (0,1 uM), penicilline -streptomycin (100 eenheden / ml penicilline en 0,1 mg / ml streptomycine) en 2-mercaptoethanol (50 mM) in RPMI 1640.
- Bereid 2 X acid citrate dextrose, door mengen natriumcitraat (77 uM), citroenzuur (38 uM) en dextrose (122 uM) in gedestilleerd water.
- Bereid Ca2 + Mg2 + vrije fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,2: NaCl (137 mM), KCl (2,7 mM) Na 2 HPO 4 (dibasisch, 10 mM), KH 2PO 4 (monobasisch, 2 mM) in gedestilleerd water; de pH op 7,2.
- Bereid PBS 1% (PBS 1% BSA) door toevoeging van runderserumalbumine in PBS (volume / gewicht, 1 g / 100 ml PBS).
- Bereid PBS + 0,05% Tween 20(PBST) door toevoeging van 0,05% Tween 20 in PBS (volume / volume 500 ui Tween 20/1 l PBS).
- Bereid 100 mM Tris HCl pH 8,2 buffer door het mengen Tris (100 mM), HCl (0,50 mM) in gedestilleerd water.
- Bereid 35% ethanoloplossing door verdunning ethylalcohol (zuiverheid ≥99.5%) in gedestilleerd water (volume / volume, 35 ml ethanol / 100 ml gedestilleerd water).
- Filter steriliseer cRPMI, 2 x acid citrate dextrose, PBS, PBS 1% BSA behulp 0,22 um filters.
2. Lange-termijn gekweekte cellen (14 Dag Protocol)
(Dag een)
- Bereid antigeen oplossingen op tweemaal de uiteindelijke concentratie in cRPMI. Antigeen keuze is kritisch en moet worden afgestemd op het doel van het onderzoek.
- Verdunnen recombinant M. tuberculosis antigenen TB10.4 en antigen Ag85A met 2 ug / ml (van elk antigeen, de uiteindelijke concentratie 1 gg / ml).
- Verdunde M. bovis gezuiverd eiwitderivaat(PPD-B, Prionics Ag) tot 10 ug / ml (de uiteindelijke concentratie 5 ug / ml).
- Verdun de vroege secretoire recombinant antigeen doelwit 6 (ESAT-6) en kweekfiltraat proteïne 10 (CFP-10) fusieproteïne (Reşat-6: CFP10) tot 2 ug / ml (eindconcentratie van 1 ug / ml).
Opmerking: Deze antigenen zijn immunodominante IFN-γ inducerende antigenen van tuberculeuze mycobacteriën en zijn toegevoegd aan PBMC te stimuleren van M. bovis geïnfecteerde dieren. BCG of M. bovis ΔRD1 gevaccineerde dieren niet reageren Reşat-6: CFP10 doordat de regio die coderen voor deze antigenen (bijvoorbeeld, RD1) geschrapt in deze stammen. Reşat-6: CFP10 gebruikt in deze studie was een soort geschenk van Dr. C. Minion, Iowa State University. TB10.4 en antigen Ag85A zijn immunodominante antigenen aanwezig in virulente en vaccin M. bovis stammen 37. PPDB als gezuiverd eiwit derivaat, is een complex met meerdere antigenen, waaronder antigenen gedeeld met niet-tuberculeuze mycobacteriën. Infected dieren zal mogelijk reageren op alle antigenen (namelijk: TB10.4, Ag 85A, Reşat-6: CFP10 en PPDb), terwijl gevaccineerde dieren niet moeten reageren op Reşat-6: CFP10 11. - Plaat 500 ul / putje van antigeenoplossing in viervoud voor elk dier in een 24 wells plaat. Voor dit protocol, gebruiken antigenen als een zwembad; dus van alle putjes bevatten alle antigenen en geen bedieningselementen (zoals null of mitogeen) deze stap. Incubeer plaat bij 39 ° C / 5% CO 2. De normale temperatuur van runderen 39 ° C; dus, sommige onderzoekers maken gebruik van 39 ° C voor de cultuur van runderen cellen. Bovendien kunnen in bepaalde gevallen met menselijke cellen, celkweek bij 39 ° C verschaft bijkomend voordeel 26,30.
- Pre-load spuiten in combinatie met 16 of 18 G injectienaalden met 6 ml 2 X zuur-citraat-dextrose; en het verzamelen van 60 ml van runderen bloed door halsader venapunctie.
- Isoleer PBMC door standaard dichtheidsgradiënt centrifugering van het perifere bloed buffy coat fractieaanpassing celconcentratie tot 4 x 10 6 cellen / ml zoals is beschreven door Maue et al. 27
- Cellen (500 ul / putje) toe te voegen in antigen voorgeladen 24 wells plaat, in viervoud voor elk dier (stap 2.5). Incubeer plaat bij 39 ° C / 5% CO 2.
(Dagen van drie en zeven)
- Met steriele techniek, verwijder voorzichtig 500 ul van de supernatant uit elk putje zonder de cellaag.
- Replenish goed volume door het toevoegen van 500 ul / putje van cRPMI met IL-2 (30 U / ul, dat wil zeggen, 15 U / goed; recombinant humaan IL-2 Sigma I7908). Incubeer plaat bij 39 ° C / 5% CO 2.
(Dagen 10 en 12)
- Met behulp van steriele techniek, verwijdert 750 pi supernatant uit elk putje. Vullen de volume met 750 ul / putje van cRPMI (zonder IL-2). Incubeer plaat bij 39 ° C / 5% CO 2.
(Dag één (12 e dag van de lange termijn cultuur protocol))
- Label de ELISPOT plaat goed voor elke set van monsters, om fouten te voorkomen bij plating cellen: op lange termijn cellen plus antigeen presenterende cellen (APC), langdurige cellen zonder APC's en ex vivo / kortlopende cellen (Figuur 1). Replicaten van elke behandeling (bijv antigene stimulatie) moet ten minste in duplo uitgevoerd.
- Bereid capture-antilichaam oplossing door verdunning van muis anti-rund IFN-γ-antilichaam (MCA2112, kloon CC330) in PBS (8 ug / ml).
- Met behulp van een multichannel pipet pre-nat de putjes van de ELISPOT plaat met 15 ul / putje van 35% ethanol gedurende 1 min. Om membraan schade te voorkomen, mag de bodem van putten met pipetuiteinden niet aanraken op enig moment tijdens de test.
- Was de plaat zes maal met 300 ul / putje van PBS. Wash vloeistof moet door plaat inversie worden weggegooid. Wast moet snel worden gedaan, niet toe te staan putjes drogen.
- Pipetteer 100 ul / putje van capture anti-IFN-γ antilichaam (stap 1 hierboven). Incubeer bij 4 ° CO / N (houd de plaat in een rits opbergtas).
(Dag twee (13 ste dag van de langetermijnkweek protocol))
- Bereid antigeen oplossingen tweemaal de eindconcentratie. Behandelingen zijn: geen stimulatie (cRPMI) PPD-B (20 ug / ml, eindconcentratie 10 ug / ml), eiwit cocktail TB10.4 en Ag85A (2 ug / ml van elke proteïne, eindconcentratie 1 ug / ml van elk eiwit), Reşat-6: CFP10 (M. bovis infectie, 2 ug / ml, eindconcentratie 1 ug / ml), en een positieve controle, zoals pokeweed (20 ug / ml, eindconcentratie: 10 gg / ml). Andere mitogeen worden gebruikt in plaats van PWM (bijvoorbeeld Concanavaline A).
NB: voor deze stap antigenen te componeren vier verschillende behandelingen en zijn not gebruikt als een zwembad (zoals in stap 2.5). De vier behandelingen zijn: NS, PPDb, eiwit cocktail (TB10.4 en Ag85A vormen een behandeling) en PWM.
4. Kortlopende Cell Cultuur en Adherent Cell (APC) Isolatie
- Verzamel 60 ml bloed van dezelfde dieren gebloed op dag 1 (under: langetermijnkweek, 14 daagse protocol) en isoleer PBMC als voorheen.
- Pas celconcentratie tot 2 x 10 6 cellen / ml. Label buizen duidelijk misallocatie wanneer plating cellen voorkomen. Deze cellen zullen worden gebruikt voor isolatie en APC's ook kortetermijnbeurzen celkweek (stap 6.5). Label buizen met zowel het dier aantal en de aard van de cultuur (in dit geval: ex vivo, op korte termijn of verse cellen).
- Verwijder overtollige capture antilichaam uit de ELISPOT door plaat inversie. Was platen 6 maal met 300 pi PBST.
- Verwijder zoveel mogelijk PBST. Pipetteer 50 ul celsuspensie aan de putjes aangeduid als duurzaam cellen plus APCs. Block andere wells met 200 ul / putje van cRPMI. Incubeer 90 min bij 39 ° C of Pre-warm cRPMI of 39 ° C (nodig voor daaropvolgende stappen). Verse PBMCs niet gebruikt voor hechtende cellen (APCs) isolatie nodig zal zijn vervolgstappen en opslaan.
5. Gekweekte Cellen
- Tijdens de 90 minuten incubatie (stap 4.4, op korte termijn cultuur en aanhangend celisolatie stap), oogst lange termijn gekweekte cellen.
- Met 5 of 10 ul pipetten, pipette media met cellen op en neer cellen los, combineren de viervoud replica van elk dier in één 15 ml buis. Centrifugeer de buizen gedurende 5 minuten bij 400 g.
- Na centrifugeren, gooi het supernatant met de metro inversie. Verjagen cel pellet. Voeg 5 ml PBS, zacht resuspendeer pellet, indien nodig. Centrifugeer nogmaals. Herhaal de wasstap twee keer. Gooi supernatant met de metro inversie en voorzichtig opnieuw te schorten cellen in 1 ml cRPMI. Pas celconcentratietot 2 x 10 5 cellen / ml.
6. Plating Verse en Gekweekte PBMCs
- Na 90 min incubatie, schudden platen op plaat shaker voor 30 sec. Verwijder niet-hechtende cellen per plaat inversie. Pipetteer 150 ul / putje van warm cRPMI (uit stap 4, onder: Korte termijn cellen en klevende cel (APC) isolatie stap).
- Schud borden en wasvloeistof weggooien. Herhaal wassen 3 keer. Voeg 100 ul / putje van elk antigeen in geschikte putjes (gelabelde).
- Cellen plaat Pipetteer 100 ul / putje van langdurig gekweekte celsuspensie (2 x 10 5 cellen / ml) in de putjes aangeduid als duurzaam cellen plus APCs. Verzeker dat de lange-termijn-cellen toegevoegd in deze stap zijn van hetzelfde dier als APC al in de put. Heeft gekweekte cellen APC's en de lange termijn niet mengen van verschillende dieren.
- Pipetteer 100 ul / putje van langdurig gekweekte celsuspensie (2 x 10 5 cellen / ml) in putjes zonder APCs voor beoordeling van APC verplichting om de langetermijnkweek respons.
- Voeg 100 ul / putje van kortdurende cellen (vers geïsoleerde en ingesteld op 2 x 10 6 cellen / ml) voor ex vivo responsbepaling. Incubeer de platen O / N bij 39 ° C / 5% CO 2 incubator. Zorg ervoor dat de platen plat liggen en geen platen niet stapelen.
LET OP: Als de analyse van celfenotype gewenst is, flowcytometrie kan worden uitgevoerd als een bijkomende test. Cellen worden uitgeplaat in 96 well U bodemplaten (ipv ELISPOT platen) zoals beschreven voor ELISPOT assay. Vangantilichaam adsorptie (stappen 3,4-3,5) moet worden overgeslagen. De cellen worden vervolgens geïncubeerd O / N bij 39 ° C / 5% CO2 en een standaard cel kleuring protocol uitgevoerd. Cell kleurstoffen zijn opgenomen in de tabel reagentia.
Dag drie (14 e dag van de lange termijn cultuur protocol)
- Verdun detectieantilichaam (muis anti-rund IFN-γ, kloon CC302) tot 5 ug / ml in PBS 1% BSA. Gooi vloeistoffen uit putjes platen en wassen: zes maal met PBST (300 gl / putje), on shaker plaatsen telkens 10 seconden voor en daartussen wassingen, eenmaal met dH 2 O (300 pl / putje), een extra 6 keer met PBST (300 gl / putje) en tweemaal met PBS (300 ul / putje). Na de cellen worden verwijderd uit de platen, en als er geen bioveiligheid betreft toepassing, procedures kunnen worden buiten biologische veiligheid kasten uitgevoerd.
- Gooi wasvloeistof. Verwijder zoveel wasvloeistof mogelijk door te tikken op de plaat op keukenpapier. Voeg detectieantilichaam (100 ul / putje).
- Incubeer de platen gedurende 120 minuten bij 39 ° C of Tijdens deze incubatiestap bereiden alkalische fosfatase-oplossing volgens de instructies van de fabrikant. Dertig minuten vóór gebruik (dat wil zeggen 90 min na toevoeging van detectieantilichaam voor putjes) verdunnen reagens in PBST. Inverteer de buis voorzichtig reagentia te mengen en geïncubeerd bij KT.
- Na de 120 min incubatie, gooi overtollige detectie antilichaam door plaat inversie. Was de plaat 6 keer met PBST (300 ul / putje). Verwijder zoveel wasvloeistof mogelijk door te tikken op de plaat op keukenpapier.
- Voeg 100 ul / putje van alkalische fosfatase-oplossing (van stap 3 hierboven). Incubeer de platen gedurende 45 min bij kamertemperatuur. Gooi vloeistof en was elk bord 6 keer met PBST (300 ul / putje).
- Bereid de substraatoplossing de instructies van de fabrikant (Vector Blue AP substraat III): Verdun reagentia in 100 mM Tris HCl pH 8,2 buffer. Pipetteer 50 ul / putje van substraatoplossing.
- Incubeer bij RT tot blauwe kleur begint te (ongeveer 30 min) te ontwikkelen. Gooi vloeistof en wassen platen met overvloedige hoeveelheden van dH 2 O. Verwijder de bodemplaat aan membraan bloot, wassen achterkant van putten en laat de plaat aan de lucht drogen.
- Lees platen immunospot beeldanalyse of ELISPOT reader (tabel 1), of handmatig met behulp van een stereomicroscoop. Ook houden bordenin het donker bij RT tot lezen. Vanwege de hoge stabiliteit van het reactiesubstraat, de kwaliteit bewaard gedurende meerdere jaren.
OPMERKING: Cellen en antigen concentraties werden geoptimaliseerd om putten met ontelbare plekken 23,24,27,37 voorkomen. Het is mogelijk dat ontelbaar spots vorming voorkomen in verschillende instellingen of door biologische variatie. Als dat het geval is, moet celconcentratie worden geoptimaliseerd, zodat een leesbaar spottelling respons wordt verkregen.
7. Plates Reading en Data-analyse
- Voer analyse volgens de Cellular Technology Limited (CTL) ELISPOT plaatlezer gids (tabel 1). Nadat de spots tellingen worden verkregen voor elk van de putten, bereken het gemiddelde van duplo. De specifieke immunologische reactie op elke antigene stimulus wordt berekend door het gemiddelde aantal vlekken in niet-gestimuleerde putjes van die van antigeen gestimuleerde wells.
Representative Results
Ongeveer een maand na de aerosol infectie met M. bovis (10 4 kolonievormende eenheden), PBMC's van geïnfecteerde (n = 8) en controledieren (n = 8) gekweekt in aanwezigheid van antigenen en IL-2 gedurende 13 dagen waren. Ontwikkeling van TCM responsen na infectie werd bepaald met behulp van IFN-γ ELISPOT assay. Representatieve Tcm (in aanwezigheid of afwezigheid van APC's) en ex vivo IFN-γ ELISPOT reacties van geïnfecteerde dieren (drie dieren) en een niet-geïnfecteerde dieren (één dier) getoond in figuur 1. Een succesvolle langdurige IFN-γ ELISPOT assay resultaten in cellen produceren IFN-γ (Spot-vormende cellen, SFC) onder gestimuleerde omstandigheden en in de buurt van afwezigheid van een reactie van niet-besmette dieren en onder niet-gestimuleerde omstandigheden. Ook moet een sterke T-cel respons optreden als gevolg van PWM. Specifieke reacties op M. bovis werden beoordeeld door PPD-B of Reşat-6: CFP10 antigene stimulatie. Zoals getoond in figuur1, robuust Tcm en ex vivo reacties op PPD-B en Reşat-6: CFP10 werden gedetecteerd uit alle drie M. bovis geïnfecteerde dieren. Minimaal tot geen TCM en ex vivo reacties werden gedetecteerd uit het controledier. Ook de aanwezigheid van APC's vereist was voor optimale TCM reacties van geïnfecteerde dieren, zoals blijkt uit sterk verminderd reacties langdurig cellen gekweekt in afwezigheid van autologe APCs. IFN-γ reactie van PBMC van M. bovis geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde dieren worden weergegeven in figuur 2. Het aantal SFC's van elk dier werd berekend als het gemiddelde aantal SFC's in duplo in reactie op PPD-B minus de respectieve reactie met medium alleen. Reacties werden geschat voor 10 6 cellen. Reacties verschilde (P <0,05) op basis infectiestatus, aan- of afwezigheid van APC en cultuur duur (bijv., Langetermijnkweek versus ex vivo kweken).
| Het verwerven beeld van platen | |
| 1. | Schakel de machine |
| 2. | Open "Immuno Capture" Versie 6.3 software. |
| 3. | Stap 1: selecteer typeplaatje. |
| 4. | Stap 2: load plaat. |
| 5. | Stap 3: selecteer scanopties. |
| 6. | Stap 4: start het scannen. |
| 7. | Verkrijgen overzicht beeld van de plaat. |
| 8. | Eject plaat. |
| 9. | Quit "Immuno Capture" software. |
| Het tellen van de spot eenheden | |
| 1. | Open "Immuno Spot Capture" Versie 5.0 software. |
| 2. | Selecteer objec T-type: normaal. |
| 3. | Kies tellen module: slim telling. |
| 4. | Stap 1: load plaat. |
| 5. | Stap 2: definiëren tellen parameters: test nauwkeurigheid van spot herkenning op putten met verschillende plekken. |
| 6. | Start auto tellen. |
| Kwaliteitscontrole | |
| 1. | Open "immunospot Capture" Versie 5.0 software. |
| 2. | Kies tellen module: kwaliteitscontrole. |
| 3. | Stap 1: load plaat. |
| 4. | Stap 2: Analyseren gemarkeerde putten individueel. |
| 5. | Finish kwaliteitscontrole. |
Tabel 1 - AutoImmun Diagnostika ELISPOT image reader acquisitie en cel tellen procedure.
ove_content "fo: keep-together.within-page =" always ">
Afbeelding 1. Afbeelding putten uit een lange-termijn gekweekte IFN-γ ELISPOT assay. Gekweekte IFN-γ ELISPOT assay werd uitgevoerd approximatelyone maand na provocatie met virulente M. bovis (drie dieren). Niet-geïnfecteerde dieren werden opgenomen als controles (één dier) lange termijn cellijnen werden gegenereerd door het stimuleren van PBMC met een cocktail van recombinant Ag85A (1 ug / ml), TB10.4 (1 ug / ml), hernomen-6.: CFP10 (1 ug / ml) en PPD-B (5 ug / ml) gedurende 13 dagen, gevolgd door overdracht naar ELISPOT platen in de aanwezigheid of afwezigheid van autologe APC. Kortlopende cellen bestond uit PBMC geïsoleerd op dag 13 en direct uitgeplaat in ELISPOT-platen. Lange termijn en korte termijn cellen werden gestimuleerd met PPD-B (10 ug / ml), Reşat-6: CFP10 (1 ug / ml), alleen medium of pokeweed mitogeen (5 &# 956; g / ml) gedurende 24 uur.
Figuur 2. Representatieve resultaten van een lange-termijn gekweekte IFN-γ ELISPOT reactie op M. bovis gezuiverde eiwit afgeleide (PPD-B). Gekweekte IFN-γELISPOT test werd uitgevoerd approximatelyone maand na uitdaging met virulente M. bovis (acht dieren). Niet-geïnfecteerde dieren werden opgenomen als controles (acht dieren Langdurig cellen werden geproduceerd door het stimuleren van PBMC met een cocktail van recombinant Ag85A (1 ug / ml), TB10.4 (1 ug / ml), Reşat-6: CFP10 (1 gg / ml) en PPD-B (5 ug / ml) gedurende 13 dagen, gevolgd door overdracht naar ELISPOT platen in de aanwezigheid of afwezigheid van autologe APCs. Kortdurende cellen bestonden uit PBMC geïsoleerd op dag 13 en direct uitgeplaat in de ELISPOT plaat . Langdurige en short termijn cellen werden gestimuleerd met PPD-B (10 ug / ml) of medium alleen gedurende 24 uur. Specifieke reacties van elk dier (SFC / 10 6 cellen) worden gepresenteerd als reactie op PPD-B (gemiddelde van duplo monsters) minus de respons op alleen media.
Discussion
IFN-γ productie op lange termijn gekweekte ELISPOT assays algemeen door TCM bij de mens, maar hoe deze reactie ontstaat in kweek wordt slecht begrepen. Of TCM aanwezig in circulatie en uitbreiding in vitro, of indien de TCM reacties het gevolg zijn van differentiatie van effectorcellen en Tem cellen in TCM tijdens kweken is onbekend. Studies met monsters van mensen hebben gevonden dat CD4 + T-cellen uit ex vivo lange-termijn gekweekte IFN-γ ELISPOT assays ongerelateerde epitoop specificiteiten, wat impliceert dat TCM responsen niet ontwikkelen van effectorcellen 28. Vanzelfsprekend kan de duur van de reactie varieert, maar als pathogeen speling wordt bereikt, uiteindelijk zowel ex vivo en TCM reacties afnemen. Ook reacties van langdurige kweken vroeg en lang na antigene priming gemeten (wanneer de effector respons lager) blijkt te correleren, wat aangeeft dat circulerende TCM populaties vroeg en lang na antioestrogene priming blijft gerelateerde in vivo. Aan de andere kant, de omvang van de ex vivo reactie niet te zijn gerelateerd aan de grootte van het geheugen 29 respons. Deze resultaten suggereren dat de lange-termijn gekweekte IFN-γ ELISPOT reacties ontstaan door in vitro expansie van TCM en een bijbehorende afnemen van effector reacties in het monster, in plaats van de differentiatie van effectorcellen in TCM fenotype.
Bij vee is de relatieve bijdrage van effector en geheugen subsets responsen gedetecteerd door langdurig IFN-γ ELISPOT assays onbekend. Recente studies tonen een correlatie tussen vaccin wekte langdurig gekweekte IFN-γ ELISPOT reacties en daaropvolgende bescherming tegen experimentele infectie met M. bovis 23-24. Vermeld is dat zwakke langdurige IFN-γ ELISPOT reacties op vaccinatie geassocieerd met het ontbreken van bescherming 30. Beiden wonen en te dodened vaccins induceren vergelijkbare ex vivo IFN-γ ELISPOT reacties, maar de vaccinatie met levende BCG lokt sterker lange termijn gekweekte-IFN γ ELISPOT reacties doen dan gedood vaccin preparaten. Interessant, levende vaccins zijn beschermende terwijl gedood formuleringen niet op bescherming tegen uitdaging te bieden met virulent tuberculeuze mycobacteriën 31-32, 33.
Beoordeling van TCM reacties is ook mogelijk door het sorteren van deze cellen uit PBMC. Direct verrijking van TCM uit PBMC vereist echter dure apparaten, hoog getraind personeel en is moeilijk omdat deze cellen niet talrijk in de bloedstroom. Op lange termijn de cultuur van PBMC biedt verrijking van Tcm dan Tem en effector cellen zonder dure apparaten; Omdat deze T-celpopulaties worden geëxpandeerd in vitro kunnen zij minder representatief in vivo geheugenrespons zijn. Het is mogelijk om IFN-γ geheugen responsen (met de langetermijnkweek of TCM sorting strategieën) anders dan de ELISPOT assays voorzien: cytokine ELISA's 34, cytokine bead arrays (CBA), intracellulaire kleuring (ICS) of cytokine eiwitarrays (CPA). Deze methoden; echter algemeen minder gevoelig dan ELISPOT-assays 35.
Een voordeel van ELISPOT is de mogelijkheid om de onmiddellijke opname van het cytokine detecteren kort na de introductie voorkomen verdunning van de supernatant en afbraak door enzymatische splitsing of cytokine opname door andere cellen. ELISPOT assays detecteren enkele cellen produceren cytokines verstrekken van nauwkeurige resultaten, zelfs in lage signaal-ruis scenario's (dwz lage specifieke antwoorden) 35. Ook met ICS detectie van cytokinen voordat zij kunnen leiden tot valse identificatie van cellen die cytokines (bv. Als gevolg van posttranslationele modulatie vóór of tijdens het uitscheidingsproces) 34. Het transport-remmers gebruikt met ICS assays om cytokine secretie te minimaliserenTijdens antigen stimulatie (zogenaamde Golgi stop eiwitten) in duur te beperken cel stimulatie als gevolg van de celtoxiciteit van deze eiwitten uiteindelijk invloed cytokineproductie 35.
Dat gezegd - CBA, CPA en ICS zijn nuttige technieken voor het meten van meerdere cytokinen gelijktijdig en / of voor het bepalen celoppervlak merkerexpressie (dwz met ICS.). Derhalve kunnen deze werkwijzen worden gebruikt in combinatie met IFN-γ ELISPOT assay 36. Hoewel eerdere runderen TB werkzaamheid van het vaccin studies gemeten Tcm reacties via ELISPOT assay, zal de detectie van Tcm reacties van andere technieken waarschijnlijk opleveren vergelijkbare resultaten. Belangrijk is dat de ELISPOT test is goedkoper en eenvoudiger uit te voeren dan CBA, CPA en ICS analysetechnieken 34. Handmatige telling van de SFC is een alternatief voor geautomatiseerde telling en ELISPOT platen kunnen worden bewaard bij kamertemperatuur gedurende langere tijd met een minimaal kwaliteitsverlies, voor of na spot counting 37.
De lange-termijn gekweekte-IFN γ ELISPOT reactie is toegepast op het geheugen reacties door de mens, en runderen te beoordelen bij de evaluatie van tuberculose-vaccin reacties 14-16,31-32,33. Tcm reacties zijn ook verondersteld een belangrijke rol in gastheerreacties spelen verschillende andere infectieuze agentia runderen, zoals:. Mycoplasma mycoides subsp mycoides 42, Anaplasma marginale 38 en runder respiratoir syncytieel virus 39. Potentieel kan langdurig ELISPOT assay worden aangepast voor andere diersoorten, cytokines en infecties. Deze bredere toepassingen zullen vooral bruikbaar zijn voor veterinaire immunologie toepassingen vanwege huidige beperkte beschikbaarheid van specifieke reagentia.
Tcm reacties zijn van cruciaal belang voor de bescherming tegen verschillende infecties, maar het meten van hen vroeg na infectie / immunisatie (voor de ziekte uitkomst voorspellen of de werkzaamheid van het vaccin) may omslachtig. Analyse van de immuunrespons onder ex vivo en korte antigene stimuleringscondities zullen representeren effector reacties, vanwege de overlap van het geheugen en effector reacties, vooral in het begin van immunologische geheugenvorming. In de context van chronische ziekten waarbij het antigeen belasting continu wordt ex vivo responsen effector cel responsen of een combinatie van geheugen en effector cel responsen te beoordelen. De lange-termijn gekweekte IFN-γ ELISPOT assay, beschreven hier, waarschijnlijk maakt het meten van TCM reacties plaats effector T cel of gecombineerde CD4 + T cel responsen. Samengevat langdurig gekweekte IFN-γ ELISPOT assay een waardevolle benadering voor het schatten van T cel responsen geheugen en is met succes toegepast om geheugenrespons van verscheidene soorten te evalueren van verschillende infecties middelen 12-16, 20-25,29 , 31,33,34,38,39.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Onderzoek werd gesteund door USDA, ARS Cris: 3625-32000-104 en Landbouw en Voeding Research Initiative Competitive Grant niet. 2011-67015-30736 van de USDA Nationaal Instituut voor Voedsel en Landbouw. Wij danken Jessica Pollock, Emma Frimml-Morgan, Shelly Zimmerman, Kristin Bass, Bruce Pesch, Molly Stafne, Allen Jensen, en Tracy Porter voor hun uitstekende technische bijstand en Rebecca Madison, Doug Ewing, Katie Pille, Jay Steffen, David Lubbers , Robin Zeisness en David Panthen voor de uitstekende verzorging en behandeling van dieren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium citrate (dihydrate) | Various | ||
| Citric acid (monohydrate) | Various | ||
| Dextrose | Various | ||
| ELISPOT PVDF plate | Various | ||
| Vectastain ABC – AP KIT Standard | Vector Laboratories | AK-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-5300 | |
| Ag85A | Lionex | LRP-0004.3 | 23, 24, 25, 37 |
| TB 10.4 | Lionex | LRP-0061.6 | 23, 24, 25, 37 |
| PPDb | Prionics AG | 7600055 | |
| rESAT-6:CFP10 | Kind gift Dr. Minion, Iastate | 23, 24, 25, 27, 37 | |
| Mouse anti-bovine IFN-γ Clone CC302 | Serotec | MCA1783B | 23, 24, 25, 27, 37 |
| Mouse anti-bovine IFN-γ Biotinylated Clone CC330 | Serotec | MCA2112 | 23, 24, 25, 27, 37 |
| Mouse anti-bovine CD4 Clone CC8 | Serotec | MCA1653GA | |
| Mouse anti-bovine CD45RO Clone IL116A | Serotec | MCA2434GA | |
| Rat anti-human CCR7 Clone 3D12 | Abcam | ab95665 | |
| Mouse anti-bovine IFN-γ-Pe Clone CC302 | Serotec | MCA1783PE | |
| Goat anti- mouse IgG2a- Alexa Fluor 350 | Invitrogen | A-21130 | |
| Goat anti-mouse IgG3 APC-CY7 | SouthernBiotechnology | 1080-193 | |
| Goat anti-rat IgG-APC | Invitrogen | A10540 | |
| BD Cytofix/Cytoperm™ | BD Biosciences | 554714 | |
| BrefeldinA | Sigma-Aldrich | B7651 | |
| Pokeweed Mitogen | Sigma-Aldrich | L8777 | |
| Recombinat human Interleukin 2 | Sigma-Aldrich | I7908 |
References
- Szabo, S. J., Kim, S. T., Costa, G. L., Zhang, X., Fathman, C. G., et al. Novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell. 100 (6), 655-669 (2000).
- Mullen, A. C., High, F. A., Hutchins, A. S., Lee, H. W., Villarino, A. V., et al. Role of T-bet in commitment of Th1 cells before IL-12-dependent selection. Science Signaling. 292 (5523), 1907 (2001).
- Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. Journal of immunology. 136 (7), 2348-2357 (1986).
- Lighvani, A. A., Frucht, D. M., Jankovic, D., Yamane, H., Aliberti, J., et al. T-bet is rapidly induced by interferon-gamma in lymphoid and myeloid cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 15137-15142 (2001).
- Masopust, D., Picker, L. J. Hidden memories: frontline memory T cells and early pathogen interception. Journal of immunology. 188 (12), 5811-5817 (2012).
- Sallusto, F., Lenig, D., Förster, R., Lipp, M., Lanzavecchia, A. Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector functions. Nature. 401 (6754), 708-712 (1999).
- Waters, W. R., Palmer, M. V., Thacker, T. C., Davis, W. C., Sreevatsan, S., et al. Tuberculosis immunity: Opportunities from studies with Cattle. Clinical and Developmental Immunology. 2011 (1), 1-11 (2011).
- Whelan, A. O., Villarreal-Ramos, B., Vordermeier, H. M., Hogarth, P. J. Development of an antibody to bovine IL-2 reveals multifunctional CD4 T(EM) cells in cattle naturally infected with bovine tuberculosis. PLoS ONE. 6 (12), e29194 (2011).
- Streitz, M., Tesfa, L., Yildirim, V., Yahyazadeh, A., Ulrichs, T., et al. Loss of receptor on tuberculin-reactive T-cells marks active pulmonary tuberculosis. PLoS ONE. 2 (8), e735 (2007).
- Soares, A. P., Scriba, T. J., Joseph, S., Harbacheuski, R., Murray, R. A., et al. Bacillus Calmette-Guérin vaccination of human newborns induces T cells with complex cytokine and phenotypic profiles. Journal of immunology. 180, 3569-3577 (2008).
- Waters, W. R., Palmer, M. V., Buddle, B. M., Vordermeier, H. M. Bovine tuberculosis vaccine research: historical perspectives and recent advances. Vaccine. 30 (16), 2611-2622 (2012).
- Letvin, N. L., Mascola, J. R., Sun, Y., Gorgone, D. A., Buzby, A. P., et al. Preserved CD4+ central memory T cells and survival in vaccinated SIV-challenged monkeys. Science. 312 (5779), 1530-1533 (2006).
- Mattapallil, J. J., Douek, D. C., Buckler-White, A., Montefiori, D., Letvin, N. L., et al. Vaccination preserves CD4 memory T cells during acute simian immunodeficiency virus challenge. The Journal of experimental medicine. 203 (6), 1533-1541 (2006).
- Lindenstrom, T., Knudsen, N. P. H., Agger, E. M., Andersen, P. Control of Chronic Mycobacterium tuberculosis .infection by CD4 KLRG1- IL-2-secreting central memory cells. The Journal of Immunology. 190 (12), 6311-6319 (2013).
- Todryk, S. M., Bejon, P., Mwangi, T., Plebanski, M., Urban, B., et al. Correlation of memory T cell responses against TRAP with protection from clinical malaria, and CD4 CD25 high T cells with susceptibility in Kenyans. PLoS ONE. 3 (4), e2027 (2008).
- Webster, D. P., Dunachie, S., Vuola, J. M., Berthoud, T., Keating, S., et al. Enhanced T cell-mediated protection against malaria in human challenges by using the recombinant poxviruses FP9 and modified vaccinia virus Ankara. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (13), 4836-4841 (2005).
- Rie, A., Warren, R., Richardson, M., Victor, T. C., Gie, R. P., et al. Exogenous reinfection as a cause of recurrent tuberculosis after curative treatment. New England Journal of Medicine. 341 (16), 1174-1179 (1999).
- Caminero, J. A., Pena, M. J., Campos-Herrero, M. I., Rodríguez, J. C., Afonso, O., et al. Exogenous reinfection with tuberculosis on a European Island with a moderate incidence of disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163 (3), 717-720 (2001).
- Sallusto, F., Lanzavecchia, A., Araki, K., Ahmed, R. From vaccines to memory and back. Immunity. 33 (4), 451-463 (2010).
- Millington, K. A., Gooding, S., Hinks, T. S. C., Reynolds, D. J. M., Lalvani, A. Mycobacterium tuberculosis.-specific cellular immune profiles suggest bacillary persistence decades after spontaneous cure in untreated tuberculosis. The Journal of infectious diseases. 202 (11), 1685-1689 (2010).
- Su, L. F., Kidd, B. A., Han, A., Kotzin, J. J., Davis, M. M. Virus-specific CD4(+) memory-phenotype T cells are abundant in unexposed adults. Immunity. 38 (2), 373-383 (2013).
- Goletti, D., Butera, O., Bizzoni, F., Casetti, R., Girardi, E., Poccia, F. Region of difference 1 antigen-specific CD4+ memory T cells correlate with a favorable outcome of tuberculosis. The Journal of infectious diseases. 194 (7), 984-992 (2006).
- Waters, W. R., et al. Efficacy and immunogenicity of Mycobacterium bovis. DeltaRD1 against aerosol M. bovis. infection in neonatal calves. Vaccine. 27 (8), 1201-1209 (2009).
- Hope, J. C., et al. Identification of surrogates and correlates of protection in protective immunity against Mycobacterium bovis. infection induced in neonatal calves by vaccination with M. bovis. BCG Pasteur and M. bovis. BCG Danish. Clinical and Vaccine Immunology. 18 (3), 373-379 (2011).
- Thom, M. L., et al. Duration of immunity against Mycobacterium bovis. following neonatal vaccination with bacillus Calmette-Guérin Danish: significant protection against infection at 12, but not 24, months. Clinical and Vaccine Immunology. 19 (8), 1254-1260 (2012).
- Aabye, M. G., Ravn, P., Johansen, I. S., Eugen-Olsen, J., Ruhwald, M. Incubation of whole blood at 39°C augments gamma interferon (IFN-γ)-induced protein 10 and IFN-γ responses to Mycobacterium tuberculosis .antigens. Clinical and vaccine immunology : CVI. 18 (7), 1150-1156 (2011).
- Maue, A. C., Waters, W. R., Davis, W. C., Palmer, M. V., Minion, F. C., Estes, D. M. Analysis of immune responses directed toward a recombinant early secretory antigenic target six-kilodalton protein-culture filtrate protein 10 fusion protein in Mycobacterium bovis.-infected cattle. Infection and Immunity. 73 (10), 6659-6667 (2005).
- Godkin, A. J., Thomas, H. C., Openshaw, P. J. Evolution of epitope-specific memory CD4(+) T cells after clearance of hepatitis C virus. Journal of immunology. 169 (4), 2210-2214 (2002).
- Todryk, S. M., et al. The relationship between human effector and memory T cells measured by ex vivo and cultured ELISPOT following recent and distal priming. Immunology. 128 (1), 83-91 (2009).
- Vordermeier, H. M., et al. Viral booster vaccines improve Mycobacterium bovis. BCG-induced protection against bovine tuberculosis. Infection and Immunity. 77 (8), 3364-3373 (2009).
- Orme, I. M. Induction of nonspecific acquired resistance and delayed-type hypersensitivity, but not specific acquired resistance in mice inoculated with killed mycobacterial vaccines. Infect. Immun. 56 (12), 3310-3312 (1988).
- Griffin, J. F., Mackintosh, C. G., Slobbe, L., Thomson, A. J., Buchan, G. S. Vaccine protocols to optimise the protective efficacy of BCG. Tubercle and lung disease : the official journal of the International Union against Tuberculosis and Lung Disease. 79 (3), 135-143 (1999).
- Buddle, B. M., et al. Protection of cattle from bovine tuberculosis by vaccination with BCG by the respiratory or subcutaneous route, but not by vaccination with killed Mycobacterium vaccae. Research in veterinary science. 59 (1), 10-16 (1995).
- Lehmann, P. V., Zhang, W. Unique strengths of ELISPOT for T cell diagnostics. Methods in Molecular Biology. 792 (Chapter 1), 3-23 (2011).
- Tincati, C., Iii, A. J. C., Snyder-Cappione, J. E. Distinguishing latent from active Mycobacterium tuberculosis. infection using Elispot assays: looking beyond interferon-gamma). Cells. 1 (2), 99-99 (2012).
- Lash, G. E., Pinto, L. A. Multiplex cytokine analysis technologies. Expert review of vaccines. 9 (10), 1231-1237 (2010).
- Vordermeier, M., Whelan, A. O. ELISPOT assays to enumerate bovine IFN-γ-secreting cells for the development of novel vaccines against bovine tuberculosis. Methods in molecular biology. 792, 219-227 (2012).
- Han, S., Norimine, J., Palmer, G. H., Mwangi, W., Lahmers, K. K., Brown, W. C. Rapid deletion of antigen-specific CD4+ T cells following infection represents a strategy of immune evasion and persistence for Anaplasma marginale. Journal of immunology. 181 (11), 7759a-7769a (2008).
- Helden, M. J. G., et al. Pre-existing virus-specific CD8(+) T-cells provide protection against pneumovirus-induced disease in mice. Vaccine. 30 (45), 6382-6388 (2012).
