Protocol
1. Voorbereiding Materials
- Bereid 10 mM HEPES buffer. Stel de pH tot 7,0 bij RT en voeg NaCl tot 0,9%.
- Bereid 5% alginaatoplossing en 10 mM EDTA-oplossing door het mengen van HEPES-gebufferde zoutoplossing bereid in 1,1. Stel de pH op 7,0 bij kamertemperatuur.
- Autoclaaf reagentia (1.1, 1.2) gedurende 20 minuten bij 121 ° C.
- Bereid gelatine beklede 60 mm schalen gelaagd met 1,2-2,0 x 10 6 muis embryonale fibroblasten (MEF) cellen, die als feeder-cellen worden behandeld door incubatie in DMEM dat 10% FBS ES-gekwalificeerd en 10 ug / ml mitomycine C gedurende 90 - 120 min.
- Handhaaf muis geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen op de schaal met de voedingscellen in de aanwezigheid van 5 ml DMEM hoog glucose met 20% van de ES-gekwalificeerde FBS, 50 uM 2-mercaptoethanol, niet-essentiële aminozuren en antibiotica ( 100 eenheden / ml penicilline G natrium, 100 ug / ml streptomycine sulfaat, en 250 ng / ml amphotericin B).
- Seed 4 x 10 5 iPS cellen op een met gelatine beklede 60 mm schaal en incubeer ze op 37 ° C en 5% CO 2. Verander het kweekmedium dagelijks tijdens incubatie. Na 3-4 dagen kweken trypsinize cellen gedurende 1 min aan 500 ui 0,05% Trypsine bevattende 0,02% EDTA bij 37 ° C en 5% CO 2. Na dat, los cellen door de cultuur schotel tien keer te tikken.
- Voeg 2,5 ml DMEM met 10% van de ES-gekwalificeerde FBS en antibiotica (na dissociatie muis iPS cellen in enkele cellen door pipetteren met 1000 pi micropipet drie keer) centrifuge celsuspensie bij 160 x g gedurende 3 minuten en verwijder supernatant en tel de cellen . Na celtelling, reseed de verzamelde cellen op een met gelatine beklede schaal en incubeer gedurende 30 minuten op de iPS cellen te isoleren van de MEF cellen. Na het tellen van de cellen (gewoonlijk 1-3 x 10 6 cellen / schaal kunnen worden verzameld), reseed 4 × 10 5 iPS cellen opde schotel.
2. Cell Encapsulation in Alginate Hydrogel Capsules
- Verzamel de cellen door hetzelfde in 1.5 en 1.6 beschreven werkwijze. Na centrifugeren bij 160 x g gedurende 3 minuten, was de iPS cel pellet met HEPES-gebufferde zoutoplossing driemaal. Na het opnieuw suspenderen van de cellen in HEPES-gebufferde zoutoplossing, filter de celsuspensie door een 40 um cel zeef om grote aggregaten, die anders het mondstuk zouden kunnen verstoppen.
- Meng 2 ml celsuspensie in HEPES-gebufferde zoutoplossing en 3 ml van 5% Alg-Na oplossing. Tenslotte 5 ml celsuspensie binnen 3% Alg-Na oplossing wordt verkregen. Celdichtheid voorkeur meer dan 10 6 cellen / ml.
- Na het verzamelen van de celsuspensie in een spuit 5 ml, installeert een coaxiale spuitmond (Figuur 1A, B) op de spuit en zet deze op injectiepomp. Zend N 2 gasstroom (minder dan 1 liter / min) door de buitenste naald van de coaxiale spuitmond enverdrijven de celsuspensie door het binnenste mondstuk.
- Verzamel druppels in 250 ml 0,5% CaCl2-oplossing en wacht 10-20 minuten voor geleren onder roeren bij 60-90 rpm.
3. Behandeling van Alginate capsules (optioneel)
- Incubeer Alg-Ca capsules in 0,05% (w / v) poly-l-lysine (PLL) oplossing gedurende 5 minuten bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Na wassen van de capsules met HEPES-gebufferde zoutoplossing, incubeer ze in DMEM met 10% FBS om neutraliseren de elektrische lading op het oppervlak. Ze gebruiken als gecoate capsules (figuur 1C).
- Incubeer de capsules in HEPES-gebufferde zoutoplossing bevattende 10 mM EDTA gedurende 5 min. De met EDTA behandelde capsules worden gebruikt als holle capsules (figuur 1C).
4. Cultuur en Verzamel cellen in Alginate Capsules
- Incubeer de ingekapselde cellen bij 75 rpm met schudden bij 37 ° C en 5% CO 2gedurende 10 dagen.
- Verzamelen en incubeer de capsules in 10 mM EDTA bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 10 minuten. Verzamel cellen van het alginaat capsules zonder PLL behandeling door centrifugatie bij 1000 x g gedurende 3 min.
- Wanneer alginaat capsules worden behandeld met PLL, breken de Alg-PLL membraan door en neer te pipetteren ongeveer tienmaal met een naald bevestigd aan een injectiespuit en Centrifugeer bij 1.000 - 5.000 x g gedurende 5 min. Naalddiameter moet lager zijn dan capsulegrootte en 25 G (260 um) naalden worden gebruikt in dit experiment (600 urn)
- Na centrifugeren, verzamel celpellet strikt uit gebroken Alg-PLL membranen als u wilt mRNA monsters te verzamelen van cellen. Resterende Alg-PLL membranen mogelijk te voorkomen mRNA zuivering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bij protocol 2.5, de verdreven alginaatoplossing vormt een bolvorm onmiddellijk na uitzetting (Figuur 2A - H). Wanneer de suspensie wordt uitgestoten met een N2-stroom lager is dan 1 l / min, de grootte van de druppeltjes gelijkmatig (figuur 2i). Indien de stroom N2 groter is dan 1L / min, de druppel breekt (figuur 2G, witte arrowed) en de grootte van de druppeltjes heterogeen (Figuur 2J). Op grond hiervan is het moeilijk om druppeltjes kleiner dan 500 urn met deze werkwijze te bereiden.
In geleringsproces (protocol 2,4), Alg-Na druppeltjes gevormd bolvorm Alg-Ca capsules in CaCl 2-oplossing als concentratie Alg-Na (meer dan 3%) voldoende (figuur 3E-H, K, I). Echter lage concentratie van Alg-Na (minder dan 3%) leidt niet bolvormig en niet-gladde vorm van capsules (Figuur 3A-D, I), waarineen probleem bekledingsproces. Hoewel Alg-Na concentratie niet genoeg is, kan sferische capsules worden gevormd door het verhogen CaCl2-concentratie (Figuur 3J). Echter, ongeveer 50 mM CaCl 2 is geschikt voor inkapseling omdat te hoge concentratie van CaCl 2 vermindert celgroei en levensvatbaarheid (data niet getoond). Na het vallen in CaCl2 oplossing, optioneel kan je wachten op een paar minuten voor het geleren maar we raden het oppakken van capsules van CaCl2 oplossing, omdat te lang incubatie in CaCl2 soms beïnvloedt cellulaire groei. Soms heb je niet-bolvormige capsules te verkrijgen, zelfs als de concentraties genoeg. Mogelijk zijn wassen cellulaire pellet onvoldoende voor hersuspenderen cellen Alg-Na oplossing. Residual reagentia zoals serum mogelijk gelering te voorkomen.
Ingekapselde cellen kunnen groeien in de capsules, maar cellulaire lekkage (pijl in figuur4A) kan in capsules zonder Alg PLL-coating (figuur 4A). Bij muizen iPS cellen, de cellen vormen schijfvormige aggregaten in elk Alg-Ca capsule (figuur 4B), terwijl de cellen samenklonteren en vormen één bolvormige aggregaten in elke holle capsule (figuur 4C). Begindichtheid cel geen invloed op de grootte van aggregaten in capsules maar lage celdichtheid (10 5 cellen / ml gel) zorgt het niet groeien (gegevens niet getoond). Aldus 10 6 cellen / ml-gel is gewenst te integreren.
Bij het verzamelen van cellen uit capsules, kunnen Alg-Ca hydrogel worden opgelost alginaat lyase of chelerende reagentia, hoewel Alg PLL-bekleding moeilijk oplosbaar met enzymen of chemicaliën. Alg-PLL derhalve fysiek gebroken met pipetteren, bijvoorbeeld. Gebroken membranen kunnen worden gezien van de cellen door centrifugeren.
Figuur 1. Beelden van inkapseling System en capsules. (A) Een beeld van de inkapseling voor Alg-Ca inkapseling op een schone bank. (B) Schematische afbeelding van een co-axiale mondstuk voor inkapseling. (C) De drie verschillende types van capsules verkregen in dit rapport. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Effect van N 2 Flow op de morfologie van de Capsules Continuous beelden (A - H). En uiterlijk (I, J) van druppelvorming van 3% Alg-Na oplossing van een coaxiaal mondstuk N 2stromen met 1 l / min (A - D, I) en 2 l / min (E - H, J). Continuous beelden werden gevangen genomen door hi-speed camera. Hydrogel capsules worden gevormd in 0,5% CaCl2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Effect van Alg-Na en CaCl2 concentratie op de morfologie van de Capsules Continuous beelden (A - H). En uitstraling (I - L) van Alg-Na druppeltjes gelerende in CaCl 2-oplossing. In opeenvolgende beelden, druppeltjes met verschillende concentraties van Alg-Na, 2% (A - D) en 3% (E - H), geleermiddelen worden in 50 mM CaCl 2-oplossing. Continuous beelden worden vastgelegd door hi-flitspaal. Uiterlijk beelden tonen de morfologische verschil Alg-Ca capsules gevormd door verschillende concentraties van Alg-Na, 2% (l, J) en 3% (K, L), en CaCl 2, 50 mM (L, K) en 500 mM (J, L). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
. Figuur 4. Morfologie Encapsulated muis iPS celaggregaten in de capsules Microfoto afbeeldingen iPS cel-aggregaten gekweekt gedurende 4, 6, 8 en 10 dagen (1 - respectievelijk 4) in drie verschillende soorten capsules: (A) naakt ( B) gecoat, en (C) holle capsules. Klikhier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inkapseling cultuur kan worden vergeleken met directe suspensiecultures. Suspensiekweek is een eenvoudiger manier om grote hoeveelheden pluripotente stamcellen dan inkapseling methoden te verkrijgen. Echter, het regelen van de aggregatie van cellen in suspensiekweek blijft een uitdaging. In inkapselingsmethode wordt cellulaire aggregatie beperkt capsules en kan daarom goed worden gecontroleerd. Een eerdere publicatie bleek dat ingekapselde cellen gevormd aggregaten van uniforme grootte, terwijl grote cel klonten verscheen in een free-suspensiekweek 7. Bovendien, een eerder rapport aangetoond dat sterke onrust veroorzaakt cellulaire dood in directe opschorting culturen van PS cellen; dus noodzakelijk een beperkt roersnelheid. Daarentegen inkapseling kan cellen tegen afschuifspanning te beschermen, zelfs onder suspensie omstandigheden. De inkapseling methode maakt dus een mate van flexibiliteit in de bedrijfsomstandigheden als groeiende cellen in suspensie.
ove_content "> Encapsulation is een nuttig hulpmiddel voor zowel stamcel onderzoek en modificatie van de massa productieproces. Het inkapselen van stamcellen is nuttig bij het onderzoeken van de stamcelniche, zoals de extracellulaire matrix en groeifactoren. Sommige onderzoekers hebben aangetoond dat het inkapselen van muizen ES cellen in VEGF-geconjugeerde agarose hydrogels bevorderen de differentiatie van cellen in bloed stamcellen 8.Dit artikel laat zien hoe u de muis iPS cellen in-size gecontroleerde Alg-Ca capsules kapselen eenvoudig door het gebruik van co-axiale nozzle en N2-stroom. Hoewel er enkele inkapselingswerkwijze met verscheidene hulpmiddelen zoals peristaltische pomp 9 en 10 elektrische spanning, het inkapselen door N2-stroom is een eenvoudiger en veiliger manier dan andere methoden. Bovendien is deze methode kan kleiner (ongeveer groter dan 600 pm) capsules dan de methode peristaltische pomp onder vorming(Ongeveer groter dan 3 mm). Grote capsules langer duren tijd voor volledig geleren en lange tijd incubatie in CaCl2 mogelijk beïnvloedt cellulaire kenmerken. Bovendien, grote capsules mogelijk ook een probleem van de massa-overdracht van nutriënt of afval, zoals glucose en zuurstof. De omvang van capsules gevormd door N2-stroom (600 -1000 urn) ideale grootte celkweek binnen.
Deze methode is niet geschikt om kleine capsules te bereiden en de controle van de grootte precies. Door de verdeling van de druppels, is deze methode niet geschikt om capsules kleiner dan 500 pm te bereiden. Bovendien kunnen alleen visuele waarneming kan de grootte van capsules te bepalen, waardoor het moeilijk is om de omvang van capsules regelen volgens deze methode. In dit geval, gebruik van microfluïdische inrichtingen mogelijk deze problemen 11 opgelost. Echter, soms verstopping optreedt in microdevice omdat Alg-Na gels onmiddellijk na een ontmoeting met CaCl2 solution.
Hoewel alginaat is niet geschikt voor chemische modificatie vanwege de hoge viscositeit, het in staat is om hybride capsules met hydrogel, die, zoals PEG, is moeilijk te gebruiken voor inkapseling te vormen. Een eerdere publicatie blijkt dat de inkapseling van de muis iPS cellen in een RGD peptide geconjugeerd PEG-Alg hybride hydrogelcapsule verbeterde celgroei 12. Zonder chemische modificatie, zouden het inkapselen van cellen in slechts hydrogel capsules worden verwacht dat de stamcelniche wijzigt behouden uitgescheiden factoren. Inderdaad, eerder onderzoek aangetoond dat de afgescheiden groeifactoren, vastgehouden in een microbioreactor, effectief in het beheersen stamcellen lot 13,14 waren.
De verzameling cellen van capsules nog een onopgelost probleem met betrekking tot de toepassing van de inkapseling methode om de massaproductie van pluripotente stamcellen. Een vorige verslag bleek dat dat PLL coating nodig is om keep muis iPS cellen in 7. Als Alg-Ca hydrogel capsules goed bekleed met een polykation zoals PLL (protocol 3,1-3,2), wordt het moeilijk te breken de capsules door een enzym of chelerende reagentia. In dit geval is een mechanische werkwijze zoals pipetteren de naald vereist (4.3). De verzamelde cellen kunnen worden geïsoleerd uit gebroken vliezen centrifugeren van meer dan 5.000 x g, alhoewel centrifugatie kan mogelijk invloed op de levensvatbaarheid van de cel door de hoge G-kracht. Aldus is een techniek van zacht verwijderen van puin uit cellen en het breken van de capsules is belangrijk voor de ontwikkeling inkapselingstechnologie. Hoewel enige verdere ontwikkeling is vereist om deze methode toe te passen op de massaproductie van cellen, inkapseling is een veelbelovende techniek voor zowel massaproductie en stamcelonderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse embryo fibroblast | Cell Biolabs | SNL 76/7 | |
| Mouse induced pluripotent stem cell | RIKEN Bio resorce centre | iPS-MEF-Ng-20D-17 | |
| DMEM high-glucose | GIBCO | 11995 | |
| ES qualified FBS | GIBCO | 16141079 | |
| Antibacterial Antibiotics | GIBCO | 15240 | |
| Nonessential Amino Acid | GIBCO | 11140 | |
| 2-mercaptoethanol | GIBCO | 21985-023 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor | Merck Millipore | ESG1107 | |
| Trypsin/EDTA | GIBCO | 25300 | |
| 26 G/16 G needle | Hoshiseido | ||
| 10 ml Syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | |
| HEPES | SIGMA | H4034 | |
| Sodium Alginate | Wako | 194-09955 | |
| Calcium Chloride | Wako | 039-00475 | |
| Poly-L-lysine (MW = 15,000 - 30,000) | SIGMA | P7890 | |
| EDTA | DOJINDO | 345-01865 | |
| Sylinge pump | AS ONE | ||
| Microscope | Olympus | IX71 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| Hispeed camera | nac image technology | Memrecam HX-3 |
References
- Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 114, 201-235 (2009).
- Chen, A., Chen, X., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Critical microcarrier properties affecting the expansion of undifferentiated human embryonic stem cells. Stem cell Res. 7 (2), 97-111 (2011).
- Schroeder, M., et al. Differentiation and lineage selection of mouse embryonic stem cells in a stirred bench scale bioreactor with automated process control. Biotechnol. Bioeng. 92 (7), 920-933 (2005).
- Leung, H. W., Chen, A., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Agitation can induce differentiation of human pluripotent stem cells in microcarrier cultures. Tissue Eng. Part C. 17 (2), 165-172 (2011).
- Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22 (3), 275-282 (2004).
- Weber, L. M., He, J., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled for testing controlled ß-cell microenvironments. Acta Biomater. 2 (1), 1-8 (2006).
- Horiguchi, I., Chowdhury, M. M., Sakai, Y., Tabata, Y. Proliferation, morphology, and pluripotency of mouse induced pluripotent stem cells in three different types of alginate beads for mass production. Biotechnol. Prog. 30 (4), 896-904 (2014).
- Rahman, N., Purpura, K. A., Wylie, R. G., Zandstra, P. W., Shoichet, M. S. The use of vascular endothelial growth factor functionalized agarose to guide pluripotent stem cell aggregates toward blood progenitor cells. Biomaterials. 31 (32), 8262-8270 (2010).
- Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
- Magyer, J. P., Nemir, M., Ehler, E., Suter, N., Perriard, J., Eppenberger, H. M. Mass Production of Embryoid Bodies in Microbeads. Ann. N. Y. Acad. Sci. 944, 135-143 (2001).
- Xu, J., Li, S., Tan, J., Luo, G. Controllable Preparation of Monodispersed Calcium Alginate Microbeads in a Novel Microfluidic System. Chem. Eng. Technol. 31 (8), 1223-1226 (2008).
- Sakai, M. P., Y, Development of Bioactive Hydrogel Capsules for The 3D Expansion of Pluripotent Stem Cells in Bioreactors. Biomater. Sci. 2 (176), 176-183 (2014).
- Chowdhury, M. M., Katsuda, T., Montagne, K., Kimura, H., Kojima, N., Akutsu, H., Ochiya, T., Fujii, T., Sakai, Y. Enhanced effects of secreted soluble factor preserve better pluripotent state of embry- onic stem cell culture in a membrane-based compartmentalized micro-bioreactor. Biomed. Microdevices. 12 (6), 1097-1105 (2010).
- Chowdhury, M. M., Kimura, H., Fujii, T., Sakai, Y. Induction of alternative fate other than default neuronal fate of embryonic stem cells in a membrane-based two-chambered micro- bioreactor by cell-secreted BMP4. Biomicrofluidics. 6 (1), 14117-14117-13 (2012).
