Protocol
1. Hazırlanması Malzemeler
- 10 mM HEPES tamponu hazırlayın. RT'de 7.0 pH ayarlayın ve% 0,9 ile NaCl ekleyin.
- 1,1 hazırlanan HEPES-tamponlu tuzlu su karıştırılarak% 5 aljinat çözeltisi ve 10 mM EDTA solüsyonu hazırlayın. Oda sıcaklığında 7.0 pH ayarlayın.
- 121 ° C'de 20 dakika için reaktifler (1.1, 1.2) Otoklav.
- DMEM,% 10 ES nitelikli FBS ve 90, mitomisin C, 10 ug / ml ihtiva eden içinde kuluçkalama ile besleyici hücreler olarak kabul edilir 2.0 x 10 6 fare embriyonik akciğer fibroblast (MEF) hücreleri, - 1.2 katmanlı jelatin kaplı 60 mm'lik yemekler hazırlamak - 120 dk.
- (ES nitelikli FBS% 20, 2-merkaptoetanol, temel olmayan amino asit ve antibiyotik 50 uM içeren 5 ml DMEM yüksek glikoz mevcudiyetinde besleyici hücreler ile tabağına hücreleri (IPS) fare uyarılmış pluripotent kök bakımı Penisilin G Sodyum, streptomisin sülfat, 100 ug / ml, 100 birim / ml ve amphoteri 250 ng / mlcin B).
- Tohum 4 × 10 5 iPS bir jelatin kaplı 60 mm çanak hücreleri ve CO 2 37 ° C'de inkübe ve% 5. Inkübasyon sırasında kültür ortamı her gün değiştirin. 3 sonra, - kültür 4 gün, 37 ° C'de% 0.05 tripsin,% 0.02 EDTA ihtiva eden 500 ul 1 dakika% 5 CO2 hücreleri trypsinize. Bundan sonra, kültür çanak on kere dokunarak hücreleri ayırmak.
- 3 dakika boyunca 160 x g'de santrifüj hücre süspansiyonu (üç kez 1.000 ul mikropipet ile pipetleme tek hücre içine ayrışma fare iPS hücrelerinin takiben) FBS ve antibiyotik ES-nitelikli% 10 ile DMEM 2.5 ml ekleyin ve süpernatant kaldırmak ve hücre sayımı . Hücre sayımı sonrasında, bir jelatin-kaplı tabak üzerinde toplanan hücreler kalkarlar ve MEF hücrelerinden iPS hücrelerini izole etmek için 30 dakika boyunca inkübe edin. Hücrelerin sayılmasından sonra (genellikle 1-3 x 10 6 hücre / çanak toplanabilir), 4 x 10 5 iPS hücrelerini reseedçanak.
Aljinat Hidrojel Kapsüller içine 2. Hücre Encapsulation
- 1.5 ve 1.6 de tarif edilen ayni yöntem vasıtasıyla hücreleri toplamak. 3 dakika boyunca 160 x g'de santrifüj sonra, üç kez HEPES tamponlu salin ile iPS hücresi pelet yıkayın. HEPES-tamponlu tuzlu su içinde hücrelerin yeniden süspansiyona sonra, başka şekilde memeyi tıkayabilecek büyük topaklar ortadan kaldırmak üzere bir 40 um'lik bir hücre süzgecinden hücre süspansiyonu filtre edin.
- HEPES-tamponlu tuzlu su içinde hücre süspansiyonu 2 ml ve% 5 Alg-Na çözeltisi 3 ml karıştırın. Son olarak% 3 Alg-Na çözeltisi içinde hücre 5 ml süspansiyon elde edilir. Hücre yoğunluğu tercihen en fazla 10 6 hücre / ml 'dir.
- 5 ml enjektöre hücre süspansiyonu topladıktan sonra, şırınga üzerindeki bir eş eksenli meme (Şekil 1A, B) yüklemek ve şırınga pompası bunları ayarlayın. Emit N2 gazı akışı (düşük 1L / dakika daha) eş-eksenli, memenin dış iğne yoluyla veİç memeden hücre süspansiyonu sınırdışı.
- % 0.5 CaCI2 çözeltisi 250 ml damlacıklar toplamak ve 10 bekle - 60-90 rpm'de karıştırılırken katılaşma işlemi için 20 dakika.
Aljinat Capsule'lerden 3. Tedavi (isteğe bağlı)
- % 0.05 Alg-Ca-kapsüller inkübe poli-L-lisin (PLL), 37 ° C'de, 5 dakika için çözelti ve% 5 (w / v) CO2.
- HEPES-tamponlu tuzlu su ile yıkama işleminden sonra kapsül, DMEM yüzeyleri üzerindeki elektrik yükü nötralize etmek için% 10 FBS ihtiva eden inkübe. Kaplanmış kapsüller (Şekil 1C) olarak kullanmaktadır.
- 5 dakika boyunca 10 mM EDTA ihtiva eden HEPES-tamponlu tuzlu su içinde kapsül inkübe edin. EDTA ile muamele edilmiş kapsüller boş kapsüller (Şekil 1C) olarak kullanılır.
Aljinat Kapsüllerinde 4. Kültür ve toplayın Hücreler
- 37 ° C ve% 5 CO2 ile çalkalanarak 75 rpm'de kapsüllenmiş hücreleri inkübe10 gün boyunca uygulanır.
- Toplamak ve 10 dakika boyunca CO2, 37 ° C'de, 10 mM EDTA içinde kapsül inkübe ve% 5. 3 dakika boyunca 1000 x g'da santrifüjleme ile PLL muamelesi olmadan aljinat kapsüllerinden hücreleri toplamak.
- 5 dakika boyunca 5,000 × g - aljinat kapsüller PLL ile tedavi ise, yukarı ve aşağı pipetleme on kat yaklaşık 1.000 bir şırınga ve santrifüj bunu bağlı bir iğne ile tarafından Alg-PLL membran bölünürler. İğne çapı kapsül boyutu ve 25 g (260 um) iğnelerin, bu deneyde kullanılan daha düşük olmalıdır (600 um)
- Eğer hücrelerden mRNA örnekleri toplamak istiyorsanız santrifüj sonra, kırık Alg-PLL zarlardan kesinlikle hücre pelet toplamak. Kalan Alg-PLL membranlar muhtemelen mRNA Saflaştırma önler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokole 2.5 anda, sınırdışı aljinat çözüm sınırdışı hemen sonra küresel bir şekil (- H Şekil 2A) oluşturur. Süspansiyon 1 L / dak daha düşük bir N2 akış oranı ile dışarı atılır ise, damlacıkların boyutunun düzgün (Şekil 2I) 'dir. N2 akışı 1 L / dak daha yüksek olan, ancak, damlacık (Şekil 2G, beyaz ok) ayırır ve damlacıkların boyutu, heterojen (Şekil 2J) olur. Bu göz önüne alındığında, bu yöntem kullanılarak, 500 um'den daha küçük damlacıklar hazırlamak güçtür.
Alg-Na (% 3'ten fazla) konsantrasyonu yeterince (Şekil 3E-H, K, I) 'in ise, jelleştirme işlemi (protokol 2.4)' de, Alg-Na CaCI2 çözeltisi içinde küresel şekli Alg-Ca-kapsüller oluşan damlacıklar. Alg-Na (daha düşük% 3) ancak düşük bir konsantrasyonu, küresel olmayan ve kapsüller olmayan düzgün şekli (Şekil 3A-D, I) 'in neden olduğuKaplama işleminde bir sorun var. Alg-Na konsantrasyonu, yeterli değil ise bile, küresel kapsüller CaCl2 konsantrasyonunu (Şekil 3J) arttırarak oluşturulabilir. CaCI2 çok yüksek konsantrasyonu, hücre büyümesini ve canlılığını (veri gösterilmemiştir) azalır Ancak, yaklaşık 50 CaCI2 mM kapsüllenmesi için uygundur. CaCl2 çözeltisi içine bıraktıktan sonra, isteğe bağlı olarak jelleşme için birkaç dakika bekleyin ama CaCl2 çok uzun kuluçka bazen hücresel büyüme etkiler çünkü biz CaCl2 çözeltisinden kapsül alarak öneririz. Bazen konsantrasyonları yeterli olsa bile olmayan küresel şekilli kapsüller edinin. Bu hücresel pelet yıkama Alg-Na çözeltisi içinde hücrelerin resuspending önce yeterli değildir muhtemelen çünkü. Böyle serum gibi kalıntı reaktifler muhtemelen jelleşmenin engeller.
Kapsüllü hücreler kapsüller ancak hücresel kaçak büyüyebilir (Şekil oklu4A) Alg-PLL kaplama (Şekil 4A) olmayan kapsül meydana gelebilir. Hücreler bir araya gelme ve her bir içi boş bir kapsül (Şekil 4C) tek küresel agregatları oluşturmaz ise, fare iPS hücrelerinin durumunda, hücreler, her bir Alg-Ca-kapsül (Şekil 4B) disk şekilli bir araya toplanırlar. Başlangıçta hücre yoğunluğu, kapsüller ama düşük hücre yoğunluğunda (10 5 hücre / ml jel) agregaların boyutunu etkileyen (veriler gösterilmemiştir) kadar büyümeye yetmezliği neden olur. Bu durumda, 10 6 hücre / ml jel kapsüllemek için arzu edilen bir durumdur.
Kapsüllerden hücrelerin toplanması olarak, Alg-Ca-hidrojel Alg-PLL kaplama enzimleri veya kimyasal maddeler ile çözünmesi zor olsa da, alginat liyaz veya kenetleme reaktifleri ile eritilebilir. Alg-PLL, bu nedenle, fiziksel olarak, örneğin bir pipetleme ile kesilmesi gerekmektedir. Kırık zarlar santrifüj ile hücrelerden ayrışmış edilebilir.
Encapsulation Sistemi ve Kapsüller Şekil 1. Görüntüler. (A) temiz bir bankta Alg-Ca kapsülleme kapsülleme sisteminin bir görüntü. (B), kapsülleme için bir ko-aksiyel memenin şematik görüntüsü. (C) bu raporda elde edilen kapsüllerin üç farklı türde. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
N2 bir eş eksenli, memeden% 3 Alg-Na çözeltisi damla oluşumunun ortaya çıkması (I, J) - Şekil 2. Kapsüller Morfolojisine N2 akımı etkisi sürekli görüntüleri (HA).1 L / dak akış (A - D, I) ve 2 L / dk (E - H, J). Sürekli görüntüleri yüksek hızlı kamera tarafından ele geçirildi. Hidrojel kapsüller CaCl2% 0.5 oluşturulur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Alg-Na Şekil 3. Etkisi ve CaCl2 Konsantrasyon Capsule'lerden Morfoloji Sürekli görüntüleri (A - H). Ve görünüm - Alg-Na (I L) CaCl2 çözeltisi içinde jelleşme damlacıkları. , - (H E), 50 mM CaCI2 çözeltisi içinde jelleştirme - (D A) ve% 3, sürekli görüntülerde, Alg-Na,% 2 farklı konsantrasyonuna sahip olan damlacıklar. Sürekli görüntüleri merhaba tarafından yakalanır-hız kamerası. Görünüm ve görüntüler Alg-Na,% 2 (L, J) ve% 3 (K, L) ve CaCI2, 50 mM (L, K) ve 500 mM farklı konsantrasyonları ile oluşturulan Alg-Ca-kapsüller morfolojik fark (J, L). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
(A), çıplak. (: Kapsüller, üç farklı tipte - (sırası ile 1: 4), 4, 6, 8 ve 10 gün süre ile kültüre iPS hücresi-agrega Şekil 4. Capsules Morfoloji Encapsulated, fare iPS hücresi agregalar Mikrografi'dır ve görüntüler B) kaplanmış, ve (C) boş kapsüller. tıklayınızBurada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kapsülleme kültürü doğrudan süspansiyon kültürleri ile karşılaştırılabilir. Süspansiyon kültürü kapsülleme yöntemleri daha pluripotent kök hücrelerin büyük miktarlarda elde etmek için basit bir yöntemdir. Bununla birlikte, süspansiyon kültüründe hücrelerin toplanmasını kontrol etmek de zordur. Kapsülleme yönteminde, hücre-çekiş kapsüller sınırlıdır ve bu nedenle de iyi bir şekilde kontrol edilebilir. Önceki bir yayın büyük hücre kümeleri serbest süspansiyon kültüründe 7'de ortaya ise kapsüllenmiş hücrelerin muntazam boyutlu agregatlar oluşturan gösterdi. Ayrıca, daha önceki bir raporu güçlü ajitasyon PS hücrelerinin doğrudan süspansiyon kültürlerinde hücre ölümüne neden olduğunu gösterdi; Bu şekilde sınırlı bir ajitasyon hızı gerektiren. Bunun aksine, kapsülleme da süspansiyon koşulları altındaki kesme stresinden hücreleri korumak edebilmektedir. Süspansiyon içinde bulunan hücrelerin büyürken kapsülleme yöntemi, bu nedenle çalışma koşullarında bir esneklik seviyesi sağlar.
"ove_content> kapsülleme seri üretim işleminin değiştirilmesi gibi kök hücre araştırmaları her ikisi için de yararlı bir araçtır. kök hücrelerin kapsüllenmesi hücre dışı matris ve büyüme faktörleri de dahil olmak üzere, kök hücre niş araştırma yararlıdır. Bazı araştırmacılar olduğunu göstermiştir VEGF-konjuge agaroz hidrojel içine fare ES hücreleri kapsülleme kan progenitör hücreleri 8 içerisine hücrelerin farklılaşmasını teşvik.Bu makale kolayca koaksiyel nozul ve N 2 akışı kullanılarak boyut kontrollü Alg-Ca kapsüller içine fare iPS hücrelerini saklanması nasıl gösterir. Örneğin peristaltik pompa 9 ve elektrik gerilimi 10 gibi çeşitli araçlarla bir kapsülleme işlemi olsa da, bir N2 akımı kullanarak kapsülleme için diğer yöntemlere göre daha basit ve daha güvenli bir yöntem. Bundan başka, bu yöntem, (yaklaşık büyük um, 600 den) peristaltik pompa ile yöntemine göre kapsüller küçük oluşturabilen(Yaklaşık 3 mm'den daha büyük). Büyük kapsüller tamamen jelleşme için uzun zaman alabilir ve CaCl2 uzun süre inkübasyon muhtemelen hücresel özelliklerini etkiler. Ayrıca, büyük kapsüller de muhtemelen böyle glikoz ve oksijen gibi besin veya atık kütle transferi bir sorun var. Bu nedenle, N2 akışı (600 -1000 mikron) oluşturduğu kapsüllerin büyüklüğü içindeki hücre kültürüne ideal boyuttadır.
Bu yöntem, küçük kapsüller hazırlamak ve hassas boyutunu kontrol etmek için uygun değildir. Çünkü damlacıkların parçalanması nedeniyle, bu yöntem, 500 um'den daha küçük kapsül hazırlamak için uygun değildir. Bundan başka, kapsüller boyutunu belirlemek sadece görsel bir müşahede ile, bu şekilde, bu yöntemle kapsüllerin boyutunu kontrol etmek zordur. Bu durumda, mikro-akışkan cihazların kullanımı, muhtemelen bu sorunları 11 çözebilir. Alg-Na jeller CaCl2 solut toplantı hemen sonra, çünkü Ancak, bazen tıkanma microdevice oluşuriyonu.
Alginat, çünkü, yüksek viskozite kimyasal modifikasyonu için uygun değildir, ancak, bu PEG gibi, kapsülleme için kullanmak da zor, hidrojel karma kapsüller, meydana edebilmektedir. Önceki bir yayın RGD peptide konjuge edilmiş PEG-Alg hibrid hidrojel kapsülü fare iPS hücrelerinin kapsülleme, hücresel büyüme 12 iyileştirdiğini gösterdi. Kimyasal modifikasyon olmadan, sadece hidrojel kapsüllere hücrelerin kapsüllenmesi salgılanan faktörler tutarak kök hücre niş ve değişiklikler beklenebilir. Nitekim, önceki araştırma microbioreactor tutulan salgılanan büyüme faktörleri, kök hücre kaderi 13,14 kontrolünde etkili olduğunu göstermiştir.
kapsül hücrelerinin toplanması hala pluripotent kök hücrelerin seri üretime kapsülleme yönteminin uygulanmasına ilişkin çözülmemiş bir sorundur. Bir önceki raporda o PLL kaplama k için gerekli olduğunu göstermiştir7 içinde eep fare iPS hücreleri. Alg-Ca hidrojel kapsüller de böyle PLL (protokolü 3,1-3,2) gibi bir polikatyon ile kaplanır varsa, ya enzim veya kenetleme reaktifleri ile kapsülleri yıkmak için zor olacak. Bu durumda, iğne ile pipetleme gibi mekanik bir yöntemi (protokol 4.3) gereklidir. santrifüjleme, muhtemelen hücre canlılığı etkileyebilir, ancak toplanan hücreler, yüksek G-kuvvetine, 5000 x g veya daha büyük santrifüj kırık zarlarından izole edilebilir. Böylece, yavaşça hücrelerden enkaz kaldırma yanı sıra kapsül kırma bir teknik kapsülleme teknoloji geliştirme önemlidir. Bazı daha da geliştirilmesi hücrelerinin seri üretim için bu yöntemi uygulamak için gerekli olmasına rağmen, kapsülleme hem seri üretim için umut verici bir tekniktir ve kök hücre araştırmaları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse embryo fibroblast | Cell Biolabs | SNL 76/7 | |
| Mouse induced pluripotent stem cell | RIKEN Bio resorce centre | iPS-MEF-Ng-20D-17 | |
| DMEM high-glucose | GIBCO | 11995 | |
| ES qualified FBS | GIBCO | 16141079 | |
| Antibacterial Antibiotics | GIBCO | 15240 | |
| Nonessential Amino Acid | GIBCO | 11140 | |
| 2-mercaptoethanol | GIBCO | 21985-023 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor | Merck Millipore | ESG1107 | |
| Trypsin/EDTA | GIBCO | 25300 | |
| 26 G/16 G needle | Hoshiseido | ||
| 10 ml Syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | |
| HEPES | SIGMA | H4034 | |
| Sodium Alginate | Wako | 194-09955 | |
| Calcium Chloride | Wako | 039-00475 | |
| Poly-L-lysine (MW = 15,000 - 30,000) | SIGMA | P7890 | |
| EDTA | DOJINDO | 345-01865 | |
| Sylinge pump | AS ONE | ||
| Microscope | Olympus | IX71 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| Hispeed camera | nac image technology | Memrecam HX-3 |
References
- Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 114, 201-235 (2009).
- Chen, A., Chen, X., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Critical microcarrier properties affecting the expansion of undifferentiated human embryonic stem cells. Stem cell Res. 7 (2), 97-111 (2011).
- Schroeder, M., et al. Differentiation and lineage selection of mouse embryonic stem cells in a stirred bench scale bioreactor with automated process control. Biotechnol. Bioeng. 92 (7), 920-933 (2005).
- Leung, H. W., Chen, A., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Agitation can induce differentiation of human pluripotent stem cells in microcarrier cultures. Tissue Eng. Part C. 17 (2), 165-172 (2011).
- Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22 (3), 275-282 (2004).
- Weber, L. M., He, J., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled for testing controlled ß-cell microenvironments. Acta Biomater. 2 (1), 1-8 (2006).
- Horiguchi, I., Chowdhury, M. M., Sakai, Y., Tabata, Y. Proliferation, morphology, and pluripotency of mouse induced pluripotent stem cells in three different types of alginate beads for mass production. Biotechnol. Prog. 30 (4), 896-904 (2014).
- Rahman, N., Purpura, K. A., Wylie, R. G., Zandstra, P. W., Shoichet, M. S. The use of vascular endothelial growth factor functionalized agarose to guide pluripotent stem cell aggregates toward blood progenitor cells. Biomaterials. 31 (32), 8262-8270 (2010).
- Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
- Magyer, J. P., Nemir, M., Ehler, E., Suter, N., Perriard, J., Eppenberger, H. M. Mass Production of Embryoid Bodies in Microbeads. Ann. N. Y. Acad. Sci. 944, 135-143 (2001).
- Xu, J., Li, S., Tan, J., Luo, G. Controllable Preparation of Monodispersed Calcium Alginate Microbeads in a Novel Microfluidic System. Chem. Eng. Technol. 31 (8), 1223-1226 (2008).
- Sakai, M. P., Y, Development of Bioactive Hydrogel Capsules for The 3D Expansion of Pluripotent Stem Cells in Bioreactors. Biomater. Sci. 2 (176), 176-183 (2014).
- Chowdhury, M. M., Katsuda, T., Montagne, K., Kimura, H., Kojima, N., Akutsu, H., Ochiya, T., Fujii, T., Sakai, Y. Enhanced effects of secreted soluble factor preserve better pluripotent state of embry- onic stem cell culture in a membrane-based compartmentalized micro-bioreactor. Biomed. Microdevices. 12 (6), 1097-1105 (2010).
- Chowdhury, M. M., Kimura, H., Fujii, T., Sakai, Y. Induction of alternative fate other than default neuronal fate of embryonic stem cells in a membrane-based two-chambered micro- bioreactor by cell-secreted BMP4. Biomicrofluidics. 6 (1), 14117-14117-13 (2012).
