Protocol
1. 준비 재료
- 10 mM의 HEPES 버퍼를 준비합니다. 실온에서 7.0으로 pH를 조정하고 0.9 %의 염화나트륨을 추가합니다.
- 1.1 준비 HEPES 완충 식염수를 혼합하여 5 % 알긴산 용액 10 mM의 EDTA 솔루션을 준비합니다. 실온에서 7.0으로 pH를 조절합니다.
- 121 ℃에서 20 분 동안 시약 (1.1, 1.2)를 압력솥.
- DMEM 10 % ES-자격 FBS와 90 마이 토마 이신 C의 10 ㎍ / ㎖의를 포함하는 내 배양 피더 세포로 처리됩니다 2.0 × 10 6 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF) 세포, - 1.2 계층화 젤라틴 코팅 60mm 요리를 준비합니다 - 120 분.
- (ES-정규화 FBS 20 % 2- 머 캅토 에탄올, 비 필수 아미노산 및 항생제 50 μM을 함유하는 5 ㎖의 DMEM 고 글루코오스의 존재 하에서 피더 세포와 접시에 세포 (IPS) 마우스 유도 된 다 능성 줄기 유지 페니실린 G 나트륨, 황산 스트렙토 마이신 100 μg의 / ㎖의 100 단위 / ㎖ 및 250 ng를 amphoteri / ㎖CIN의 B).
- 시드 4 × 10 5 만능 줄기 젤라틴 코팅 60mm 접시에 세포 및 CO 2를 37 ° C에서 그들을 품어 5 %. 배양시 배양 배지 매일을 변경합니다. 3 후 - 문화의 4 일, 37 ° C에서 0.05 % 트립신은 0.02 %의 EDTA를 포함하는 500 μL와 1 분 5 % CO 2 세포를 Trypsinize. 그 후, 배양 접시에 10 번을 두드려서 세포를 분리.
- 3 분 동안 160 × g에서 원심 분리기 세포 현탁액 (세 번 1,000 μL 마이크로 피펫과 피펫 팅하여 단일 세포로 분리 마우스 IPS 세포 다음) FBS와 항생제 ES-자격의 10 % DMEM의 2.5 ML을 추가하고 상층 액을 제거하고 세포를 계산 . 셀 카운팅 후, 젤라틴 코팅 접시에 세포를 수집하고 시드 MEF 세포로부터 만능 줄기 세포를 분리하기 위해 30 분 동안 배양한다. 세포를 카운팅 한 후 (일반적으로 1 - × 106 세포 / 접시가 수집 될 수 있음), 4 × 105 IPS 세포를 시드요리.
알긴산 하이드로 겔 캡슐에 2 셀 캡슐화
- 1.5 및 1.6에 기재된 방법과 동일한 방법에 의해 세포를 수집. 3 분 동안 160 × g에서 원심 분리 후, 세 번 HEPES 완충 식염수와 유도 만능 줄기 세포 펠렛을 씻는다. HEPES 완충 식염수에 세포를 다시 현탁 한 후, 별도로 노즐을 막히게 할 수있는 큰 응집체를 제거하기 위해 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 필터.
- HEPES 완충 식염수 내에서 세포 현탁액 2 ㎖ 및 5 % Δ1g의-나트륨 용액 3 mL를 섞는다. 마지막으로 3 % Δ1g의-나트륨 용액 내 세포 현탁액 5 ml를 얻을 수있다. 셀 밀도는 바람직하게 10 개 이상 6 세포 / ml이다.
- 5 ML의 주사기로 세포 현탁액을 수집 한 후, 주사기에 동축 노즐 (그림 1A, B)를 설치하고 주사기 펌프를 설정합니다. 발광 N 2 가스 유동 (저급 1L / 분 이하) 동축 노즐의 외 바늘 통해내부 노즐을 통해 세포 현탁액을 추방.
- 0.5 % CaCl2를 250 ml의 용액에 방울을 모아서 10 기다려 - 60-90 rpm에서 교반하면서 겔을 20 분.
알긴산 캡슐 3. 치료 (선택 사항)
- 0.05 %에서 Δ1g의 - 칼슘 캡슐 부화 폴리 -L- 라이신 (PLL) 37 ° C에서 5 분 동안 5 % 용액 (/ V w) CO 2.
- HEPES 완충 식염수와 캡슐을 세척 한 후, DMEM는 그 표면에 전하를 중화하기 위해 10 % FBS를 함유하는 배양에서 그들을. 코팅 캡슐 (그림 1C)로 활용.
- 5 분 동안 10 mM의 EDTA를 함유하는 HEPES 완충 식염수에서 캡슐 부화. EDTA 처리 된 캡슐 빈 캡슐 (그림 1C)로 사용된다.
알긴산 캡슐 4. 문화 및 수집 세포
- 37 ℃ 및 5 % CO 2에서 진탕 75 rpm에서 캡슐화 된 세포를 부화십일합니다.
- 수집하고 10 분 동안 CO 2, 37 ℃에서 10 mM의 EDTA에 캡슐을 배양하고, 5 %. 3 분 1,000 × g에서 원심 분리하여 PLL을 처리하지 않고 알긴산 캡슐에서 세포를 수집합니다.
- 5 분 동안 5,000 ×의 G - 알지네이트 캡슐이 PLL로 처리하는 경우, 최대 피펫 아래로 열 배 1,000에서 주사기와 원심 분리기를에 부착 된 바늘에 의해 ALG 파일-PLL 막을 휴식. 니들 직경은 캡슐의 크기 및 25 G (260 μm의) 바늘이 실험에서 사용되는보다 낮아야한다 (600 μm의)
- 당신이 세포에서 mRNA의 샘플을 수집 할 경우 원심 분리 후, 깨진 Δ1g의-PLL 막으로부터 엄격하게 세포 펠렛을 수집합니다. 남은 Δ1g의-PLL 막은 가능한 mRNA의 정제를 방지한다.
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Representative Results
프로토콜 2.5에서 추방 알지네이트 솔루션은 추방 후 즉시 구형 (- H 그림 2A)를 형성한다. 현탁액을 1L / 분 이하 N 2 유량으로 배출되는 경우, 액 적의 크기가 균일 한 (도 2I)이다. N 2 흐름은 1L / 분보다 큰 경우, 액체 방울 (도 2G, 흰색 화살표로)을 분해 및 액 적의 크기가 불균일 (도 2J)를하게된다. 이 주어지면,이 방법을 사용하여 500 ㎛의보다 작은 액 적을 제조하는 것은 곤란하다.
Δ1g의-나트륨 (3 % 이하)의 농도가 충분 (도 3E-H, K, I) 인 경우, 겔화 과정 (프로토콜 2.4)에서, Δ1g의 - 나이 CaCl2를 용액에 구형 Δ1g의 - 칼슘 캡슐을 형성 방울입니다. Δ1g의-나트륨 (3 % 이하)의 농도는 낮은 그러나, 비 구형 및 비 캡슐의 매끄러운 형상 (도 3A-D, I) 일으키는코팅 공정에서 문제가있다. -Δ1g의 나트륨 농도가 충분하지 않다하더라도, 구형 캡슐 염화칼슘 2 농도 (도 3J)를 증가시킴으로써 형성 될 수있다. CaCl2를 너무 높은 농도는 세포 성장과 생존 (데이터는 도시되지 않음)이 감소하기 때문에, 50 mM의 CaCl2를 캡슐화에 적합하다. 염화칼슘이 솔루션으로 떨어지는 후, 선택적으로는 겔에 대한 몇 분 동안 기다릴 수 있지만, CaCl2를 너무 오래 배양 때로는 세포 성장에 영향을주기 때문에 우리는 염화칼슘이 솔루션에서 캡슐을 따기 좋습니다. 때때로 당신은 농도가 충분한 경우에도 비 구형 모양의 캡슐을 구하십시오. 이 세포 펠렛을 세척하는 Δ1g의 - 나 용액에 세포를 재현 탁 전에 충분하지 아마 때문이다. 혈청 등의 잔류 시약 가능성 겔화 방지한다.
캡슐화 된 세포가 캡슐하지만 휴대 누출 성장할 수있다 (그림에서 화살표가 붙은도 4a) Δ1g의-PLL 코팅 (그림 4A)없이 캡슐에 발생할 수 있습니다. 세포 덩어리를 함께 각 중공 캡슐 (도 4c)의 하나의 구형 응집체를 형성하는 반면, 마우스 IPS 세포의 경우, 세포는, 각 Δ1g의 - 칼슘 캡슐 (도 4b)에서 디스크 형 응집체를 형성한다. 초기 세포 밀도는 캡슐하지만 낮은 세포 밀도 (105 세포 / ㎖ 겔)에서 응집체의 크기에 영향을 (데이터는 미도시)까지 확장 할 수있는 오류가 발생하지 않는다. 따라서, 106 개 세포 / ml 겔 캡슐화하는 것이 바람직하다.
캡슐로부터 세포를 수집하는, Δ1g의 - 칼슘 하이드로 겔은 ALG 파일-PLL 코팅은 효소 또는 화학 물질을 용해하는 것은 곤란하지만, 알긴산 리아제 또는 킬레이트 시약에 용해 될 수있다. ALG-PLL 따라서 물리적으로 예를 들면, 피펫으로 나눌 수 있어야합니다. 깨진 막은 원심 분리에 의해 세포로부터 해리 될 수있다.
캡슐화 시스템 및 캡슐도 1의 이미지. (A)에 Δ1g의 클린 벤치 - 칼슘 밀봉 용 밀봉 시스템의 이미지. (B) 밀봉 용 동축 노즐의 개략도 이미지. (C)이 보고서에서 얻은 캡슐의 세 가지 유형. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
N 2 동축 노즐로부터 3 % Δ1g의-나트륨 용액의 액적 형성의 모양 (I, J) -도 2 캡슐의 형태에 N 2 흐름의 효과 연속 이미지 (H).1 L / min으로 흐름 (- D, I), 2 L / 분 (E - H, J). 연속 이미지를 고속 카메라로 촬영했다. 히드로 겔 캡슐 CaCl2를 0.5 %에서 형성된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Δ1g의 - 나 그림 3. 효과와 CaCl2를 집중 캡슐의 형태에 연속 이미지 (- H). 외관 - Δ1g의 - 나의 (I L)을 CaCl2를 용액에 겔 방울입니다. - (E H)의 50 mM CaCl2를 용액에서 겔화되어 - (D)와 3 %의 연속 이미지에서, Δ1g의 - 나, 2 %의 농도를 갖는 상이한 방울. 연속 이미지는 안녕에 의해 캡처- 속도 카메라. 외관 이미지 Δ1g의 - 나, 2 % (L, J) 3 % (K, L), 및 CaCl2를, 50 mM의 (L, K) 및 500 mM의 상이한 농도로 형성 Δ1g의 - 칼슘 캡슐의 형태 학적 변화를 보여 (J, L). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
() 벌거 벗은, (:. 캡슐의 세 가지 유형의 - (각각 4 1) 4, 6, 8, 10 일간 배양 만능 줄기 세포 집계 그림 4. 캡슐에 형태론 캡슐화의 마우스 만능 줄기 세포 집합체 현미경 사진 이미지 B) 코팅, 및 (c) 빈 캡슐. 를 클릭하십시오여기에이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
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Discussion
캡슐화 배양 직접 현탁 배양 물과 비교 될 수있다. 현탁 배양은 캡슐화 방법보다 다 능성 줄기 세포를 대량으로 얻을 수있는 간단한 방법이다. 그러나, 현탁 배양 세포의 집계를 제어하는 것은 여전히 어렵습니다. 밀봉 방법에서, 세포 응집은 캡슐에 제한되며, 따라서 잘 제어 할 수있다. 이전 간행물은 큰 세포 덩어리가 자유 현탁 배양 7에 등장하는 반면 캡슐화 된 세포, 균일 한 크기의 집계를 형성 것으로 나타났다. 또한, 이전 보고서는 강한 교반 PS 세포의 직접 서스펜션 문화에 세포 죽음을 일으키는 것을 증명; 따라서 제한된 교반 속도를 필요로. 반대로, 심지어 캡슐화 서스펜션 전단 응력 조건에서 세포를 보호 할 수있다. 부유 세포를 성장하는 경우에 밀봉 방법 따라서 운전 조건에 유연성의 수준을 허용한다.
"ove_content는> 캡슐화는 양산 공정의 변형뿐만 아니라 줄기 세포 연구 모두에 유용한 도구이다. 줄기 세포의 캡슐화가 세포 외 기질 및 성장 인자를 포함하는 줄기 세포의 틈새를 연구에 유용하다. 일부 연구자는 것을 증명 VEGF 공역 하이드로 겔, 아가 로스로 마우스 ES 세포의 캡슐화는 혈액 선조 세포로 8 세포의 분화를 촉진.이 문서에서는 쉽게 동축 노즐 및 N 2 흐름을 사용하여 크기 조절 Δ1g의 - 칼슘 캡슐에 마우스 IPS 세포를 캡슐화하는 방법을 보여줍니다. 이러한 연동 펌프 (9) 및 전기 전압 (10)과 같은 다양한 도구와 일부 봉지 공정이 있지만, 유동 N 2를 사용하여 캡슐화는 다른 방법보다 더 간단하고 안전한 방법이다. 또한,이 방법은 (약 600 ㎛의보다 큰) 연동 펌프와 방법보다 더 작은 캡슐을 형성 할 수있다(약보다 큰 3mm). 대형 캡슐은 완전히 겔화 시간이 더 걸릴 CaCl2를 긴 시간 배양 가능성이 세포의 특성에 영향을 미친다. 또한, 큰 캡슐은 또한 아마도 글루코스 및 산소와 같은 영양소 폐기물이나 물질 전달의 문제가있다. 따라서, N 2 흐름 (600 -1,000 μm의)에 의해 형성된 캡슐의 크기는 내부에 세포 배양에 적합한 크기이다.
이 방법은 작은 캡슐을 제조하고 정확하게 크기를 제어하는데 적합하지 않다. 왜냐하면 물방울의 파괴,이 방법은 500 ㎛의보다 작은 캡슐을 제조하기에 적합하지 않다. 또한, 캡슐의 크기를 결정할 수있는 유일한 시각적 관찰은, 따라서이 방법에 의해 캡슐의 크기를 제어하는 것이 곤란하다. 이 경우, 마이크로 유체 소자의 사용은 아마도 이러한 문제를 해결할 수있다 (11). Δ1g의 - 나 겔은 CaCl2를 오디오 솔루션 회의 직후 때문에, 때때로 막힘 마이크로 디바이스에서 발생이온.
알긴산이 때문에 고점도의 화학적 개질에 적합하지 않지만, 이는 PEG처럼 밀봉에 사용하는 것도 곤란하고, 겔 캡슐과 하이브리드를 형성 할 수있다. 이전 공보는 RGD 펩티드 공역 PEG-Δ1g의 하이브리드 겔 캡슐 마우스 IPS 세포의 세포 성장 캡슐화 (12)를 향상하는 것이 나타났다. 화학적 수정하지 않고, 단지 겔 캡슐에 캡슐화 세포는 분비 된 요소를 유지하여 줄기 세포 틈새를 수정하는 것으로 예상된다. 실제로, 이전의 연구에서 유지 microbioreactor 분비 된 성장 인자, 줄기 세포의 운명을 조절 13,14 효과적이라고 증명.
캡슐에서 세포의 수집은 여전히 다 능성 줄기 세포의 대량 생산에 밀봉 방법의 응용에 대한 미해결 문제이다. 이전 보고서는 PLL 코팅 k로 필요한 것으로 나타났다7 내부 EEP 마우스 유도 만능 줄기 세포. Δ1g의 - 칼슘 겔 캡슐은 물론 이러한 PLL (프로토콜 3.1-3.2)로서 폴리 양이온으로 코팅하는 경우, 그 중 효소 또는 킬레이트 시약으로 캡슐을 분해하기 어렵다. 이 경우, 바늘 피펫 같은 기계적 방법 (프로토콜 4.3) 요구된다. 원심 아마도 세포 생존에 영향을 미칠 수 있지만, 모은 세포 인해 높은 G 하중으로, 5,000 × g에서 원심 분리에보다 더 세분화 막으로부터 분리 될 수있다. 따라서, 부드럽게 세포 파편을 제거뿐만 아니라 캡슐 파괴의 기술은 캡슐화 기술을 개발하는 것이 중요하다. 좀 더 발달이 세포의 대량 생산이 방법을 적용 할 필요가 있지만, 양쪽 밀봉 양산 유망한 기술이다 줄기 세포 연구.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse embryo fibroblast | Cell Biolabs | SNL 76/7 | |
| Mouse induced pluripotent stem cell | RIKEN Bio resorce centre | iPS-MEF-Ng-20D-17 | |
| DMEM high-glucose | GIBCO | 11995 | |
| ES qualified FBS | GIBCO | 16141079 | |
| Antibacterial Antibiotics | GIBCO | 15240 | |
| Nonessential Amino Acid | GIBCO | 11140 | |
| 2-mercaptoethanol | GIBCO | 21985-023 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor | Merck Millipore | ESG1107 | |
| Trypsin/EDTA | GIBCO | 25300 | |
| 26 G/16 G needle | Hoshiseido | ||
| 10 ml Syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | |
| HEPES | SIGMA | H4034 | |
| Sodium Alginate | Wako | 194-09955 | |
| Calcium Chloride | Wako | 039-00475 | |
| Poly-L-lysine (MW = 15,000 - 30,000) | SIGMA | P7890 | |
| EDTA | DOJINDO | 345-01865 | |
| Sylinge pump | AS ONE | ||
| Microscope | Olympus | IX71 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| Hispeed camera | nac image technology | Memrecam HX-3 |
References
- Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 114, 201-235 (2009).
- Chen, A., Chen, X., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Critical microcarrier properties affecting the expansion of undifferentiated human embryonic stem cells. Stem cell Res. 7 (2), 97-111 (2011).
- Schroeder, M., et al. Differentiation and lineage selection of mouse embryonic stem cells in a stirred bench scale bioreactor with automated process control. Biotechnol. Bioeng. 92 (7), 920-933 (2005).
- Leung, H. W., Chen, A., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Agitation can induce differentiation of human pluripotent stem cells in microcarrier cultures. Tissue Eng. Part C. 17 (2), 165-172 (2011).
- Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22 (3), 275-282 (2004).
- Weber, L. M., He, J., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled for testing controlled ß-cell microenvironments. Acta Biomater. 2 (1), 1-8 (2006).
- Horiguchi, I., Chowdhury, M. M., Sakai, Y., Tabata, Y. Proliferation, morphology, and pluripotency of mouse induced pluripotent stem cells in three different types of alginate beads for mass production. Biotechnol. Prog. 30 (4), 896-904 (2014).
- Rahman, N., Purpura, K. A., Wylie, R. G., Zandstra, P. W., Shoichet, M. S. The use of vascular endothelial growth factor functionalized agarose to guide pluripotent stem cell aggregates toward blood progenitor cells. Biomaterials. 31 (32), 8262-8270 (2010).
- Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
- Magyer, J. P., Nemir, M., Ehler, E., Suter, N., Perriard, J., Eppenberger, H. M. Mass Production of Embryoid Bodies in Microbeads. Ann. N. Y. Acad. Sci. 944, 135-143 (2001).
- Xu, J., Li, S., Tan, J., Luo, G. Controllable Preparation of Monodispersed Calcium Alginate Microbeads in a Novel Microfluidic System. Chem. Eng. Technol. 31 (8), 1223-1226 (2008).
- Sakai, M. P., Y, Development of Bioactive Hydrogel Capsules for The 3D Expansion of Pluripotent Stem Cells in Bioreactors. Biomater. Sci. 2 (176), 176-183 (2014).
- Chowdhury, M. M., Katsuda, T., Montagne, K., Kimura, H., Kojima, N., Akutsu, H., Ochiya, T., Fujii, T., Sakai, Y. Enhanced effects of secreted soluble factor preserve better pluripotent state of embry- onic stem cell culture in a membrane-based compartmentalized micro-bioreactor. Biomed. Microdevices. 12 (6), 1097-1105 (2010).
- Chowdhury, M. M., Kimura, H., Fujii, T., Sakai, Y. Induction of alternative fate other than default neuronal fate of embryonic stem cells in a membrane-based two-chambered micro- bioreactor by cell-secreted BMP4. Biomicrofluidics. 6 (1), 14117-14117-13 (2012).
