Protocol
1. חומרי הכנה
- הכן 10 חיץ HEPES מ"מ. התאם את ה- pH 7.0 ב RT ולהוסיף NaCl 0.9%.
- הכן 5% פתרון אלגינט ופתרון 10 מ"מ EDTA על ידי ערבוב מלח HEPES שנאגר ערוכים 1.1. התאם את ה- pH 7.0 ב RT.
- החיטוי חומרים כימיים (1.1, 1.2) במשך 20 דקות ב 121 מעלות צלזיוס.
- להכין מאכלי 60 מ"מ מצופה ג'לטין שכבתי עם 1.2-2.0 פיברובלסטים עכבר עובריים × 10 6 (MEF) תאים, אשר נחשבים כתאים מזינים על ידי דגירה בתוך DMEM המכיל 10% FBS ES-מוסמך ו -10 מיקרוגרם / מיליליטר של C mitomycin 90 - 120 דקות.
- לשמור על גזע pluripotent עכבר מושרה (iPS) תאים בצלחת עם התאים מזינים בנוכחות 5 מיליליטר הגבוה של גלוקוז DMEM המכיל 20% של ES-המוסמך FBS, 50 מיקרומטר של 2-mercaptoethanol, חומצת אמינו לא חיונית, ואנטיביוטיקה ( 100 / מיליליטר יחידות של פניצילין G נתרן, 100 מיקרוגרם / מיליליטר של סולפט סטרפטומיצין, ו -250 / מיליליטר ng של amphoteriCIN B).
- זרע 4 × 5 תאי iPS 10 על צלחת 60 מ"מ מצופה ג'לטין ודגירתם על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לשנות את מדיום התרבות בכל יום במהלך דגירה. לאחר 3-4 ימים של תרבות, trypsinize תאי דקות 1 עם 500 μl של 0.05% טריפסין המכיל EDTA 0.02% על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. אחרי זה, לנתק את התאים על ידי הקשה על צלחת התרבות עשר פעמים.
- להוסיף 2.5 מיליליטר של DMEM עם 10% מהשעית תא צנטריפוגות ES-מוסמכת FBS ואנטיביוטיקה (להלן תאי iPS עכבר ניתוק לתוך תאים בודדים ידי pipetting עם micropipette 1000 μl שלוש פעמים) בשעה 160 × גרם במשך 3 דקות ולהסיר supernatant ולספור את התאים . בעקבות ספירת תאים, לזרוע תאים שנאספו על צלחת ג'לטין מצופה ו דגירה למשך 30 דקות לבודד את תאי iPS מתאי MEF. לאחר הספירה של התאים (בדרך כלל 1-3 × 10 6 תאים / מנה יכולה להיות שנאספו), reseed 4 × 10 5 תאים iPS עלהצלחת.
2. תא Encapsulation לאלגינט Hydrogel קפסולות
- לאסוף את התאים על ידי אותו ההליך מתואר ב1.5 ו -1.6. בעקבות צנטריפוגה 160 × גרם במשך 3 דקות, לשטוף את התא גלולה iPS עם מי מלח HEPES שנאגר שלוש פעמים. לאחר מחדש השעיית התאים בתמיסת מלח HEPES שנאגר, לסנן את ההשעיה התא דרך מסננת 40 מיקרומטר תא כדי להסיר אגרגטים גדולים, שעלולים לסתום את החרירים.
- מערבבים 2 מיליליטר של השעיה תא בתוך תמיסת מלח HEPES שנאגר ו 3 מיליליטר של 5% פתרון ALG-Na. לבסוף 5 מיליליטר של השעיה תא בתוך 3% פתרון ALG-Na מתקבל. צפיפות תאים היא desirably יותר מ 10 6 תאים / מיליליטר.
- לאחר איסוף ההשעיה התא לתוך מזרק 5 מיליליטר, להתקין זרבובית שיתוף צירי (איור 1 א ', ב') על המזרק ולהגדיר אותם על משאבת מזרק. זרימת גז 2 לפלוט N (נמוך מ1 ליטר / דקה) באמצעות המחט החיצונית של נחיר קואקס ולגרש את ההשעיה התא דרך הנחיר הפנימי.
- לאסוף טיפות לתוך 250 מיליליטר של 0.5% פתרון CaCl 2 ולהמתין 10 - 20 דקות לgelation תוך ערבוב ב60-90 סל"ד.
3. טיפול באלגינט קפסולות (אופציונאלי)
- דגירה כמוסות ALG-Ca ב0.05% (w / v) פתרון פולי-L ליזין (PLL) במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- לאחר שטיפת הכמוסות עם מי מלח HEPES שנאגר, דגירתם בDMEM המכיל 10% FBS כדי לנטרל את המטען החשמלי על פני השטח שלהם. לנצל אותם ככמוסות מצופים (איור 1 ג).
- דגירה הכמוסות במלח HEPES שנאגר המכיל 10 mM EDTA במשך 5 דקות. הכמוסות טופל EDTA מנוצלות ככמוסות חלולות (איור 1 ג).
4. תאי תרבות ואיסוף בקפסולות אלגינט
- דגירה התאים במארז ב 75 סל"ד עם רעד על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2במשך 10 ימים.
- לאסוף דגירה הכמוסות ב 10 מ"מ EDTA על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 10 דקות. איסוף תאים מכמוסות אלגינט ללא טיפול PLL על ידי צנטריפוגה בז × 1,000 3 דקות.
- אם מטופלים כמוסות אלגינט עם PLL, לשבור את קרום ALG-PLL ידי pipetting למעלה ולמטה כעשר פעמים עם מחט מחוברת למזרק ו צנטריפוגות זה ב 1000 - 5000 × גרם במשך 5 דקות. קוטר מחט צריך להיות נמוך יותר מגודל כמוסה ו -25 G מחטים (260 מיקרומטר) משמשות בניסוי זה (600 מיקרומטר)
- לאחר צנטריפוגה, לאסוף תא גלולה לחלוטין מקרומי ALG-PLL שבור אם אתה רוצה לאסוף דגימות ה- mRNA מהתאים. קרומי ALG-PLL נותרו אולי למנוע טיהור mRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בפרוטוקול 2.5, פתרון אלגינט גורש יוצר צורה כדורית מייד לאחר הגירוש (איור 2 א - ח). אם ההשעיה הוא גורש עם קצב זרימה N 2 נמוך יותר מאשר 1 ליטר / דקה, גודל הטיפות הוא אחיד (איור ט 2). עם זאת, אם את זרימת N 2 היא גבוהה יותר מאשר 1 ליטר / דקה, הטיפה מתפרקת (איור 2G, החציים לבן) ואת גודל הטיפות הופך הטרוגנית (איור י 2). לאור זאת, קשה להכין טיפות קטנות מ -500 מיקרומטר שימוש בשיטה זו.
בתהליך gelling (פרוטוקול 2.4), ALG-Na טיפות יצר כמוסות ALG-Ca צורה כדורית בCaCl פתרון 2 אם ריכוז של ALG-Na (יותר מ -3%) הוא מספיק (איור 3E-H, K, I). עם זאת ריכוז נמוך של ALG-Na (נמוך מ -3%) גורם אי-כדורי וצורה שאינה חלקה של כמוסות (איור 3 א-D, I), שיש לי בעיה בתהליך ציפוי. גם אם ריכוז ALG-Na זה לא מספיק, יכולים להיווצר קפסולות כדוריות על ידי הגדלת CaCl 2 ריכוז (איור 3J). עם זאת, כ -50 מ"מ של CaCl 2 מתאים לאנקפסולציה בגלל ריכוז גבוה מדי של CaCl 2 מקטין צמיחה סלולרית וכדאיות (נתונים לא מוצגים). אחרי שהורדתי לCaCl 2 פתרון, לחלופין אתה יכול לחכות כמה דקות לgelling אבל אנחנו ממליצים להרים כמוסות מCaCl 2 פתרון בגלל דגירה ארוכה מדי בCaCl 2 לפעמים משפיעה צמיחה סלולרית. לפעמים אתה להשיג קפסולות בצורה שאינן כדוריות גם אם הריכוזים מספיק. זה כנראה בגלל שטיפת גלולה סלולרית היא לא מספיק לפני resuspending תאים בפתרון ALG-Na. ריאגנטים שיורי כגון סרום אולי למנוע gelling.
תאים במארז יכולים לגדול בכמוסות אבל דליפה סלולרית (החציים באיור 4A) יכול להתרחש בכמוסות ללא ציפוי ALG-PLL (איור 4 א). במקרה של תאי iPS עכבר, התאים ליצור אגרגטים בצורת דיסק בכל כמוסת ALG-Ca (איור 4), ואילו תאי גוש ביחד וליצור אגרגטים כדוריים בודדים בכל כמוסה חלולה (איור 4C). צפיפות תאים ראשונית אינה משפיעה על הגודל של אגרגטים בכמוסות אבל צפיפות תאים נמוכה (10 5 תאים / מ"ל ג'ל) גורמת לכישלון לגדול (מידע לא מוצג). כך, 10 6 תאים / מ"ל ג'ל רצוי לתמצת.
באיסוף תאים מכמוסות, הידרוג'ל ALG-Ca יכול להיות מומס עם ריאגנטים אנזים או chelating אלגינט, למרות ציפוי ALG-PLL קשה להמס עם אנזימים או כימיקלים. ALG-PLL ולכן צריך להיות שבור פיזי עם pipetting, למשל. יכולים להיות מנותקים קרומים השבורים מהתאים על ידי צנטריפוגה.
> 
1. תמונות איור של מערכת Encapsulation וקפסולות. (א) תמונה של מערכת אנקפסולציה לאנקפסולציה ALG-Ca על ספסל נקי. תמונה סכמטי של זרבובית שיתוף צירי לאנקפסולציה (B). (ג) שלושה סוגים שונים של כמוסות המתקבלות בדוח זה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. אפקט של N 2 זרימה במורפולוגיה של קפסולות תמונות רציפות (- H). ומראה (אני, J) של היווצרות טיפה של 3% פתרון ALG-Na מנחיר שיתוף צירי בN 2לזרום בL 1 / דקה (- D, I) ו- 2 ליטר / דקה (E - H, J). תמונות רציפות נתפסו על ידי מצלמה במהירות גבוהה. כמוסות הידרוג'ל נוצרות ב 0.5% CaCl 2. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
אפקט איור 3. של ALG-Na וCaCl ריכוז 2 על המורפולוגיה של קפסולות תמונות רציפות (- H). ומראה (אני - L) של ALG-Na טיפות gelling בCaCl 2 פתרון. בתמונות רציפות, טיפות שיש ריכוז של ALG-Na, 2% שונים (- D) ו- 3% (E - H), הם gelling בפתרון 50 מ"מ CaCl 2. תמונות רציפות הם נתפסו על ידי הייהמצלמה -Speed. תמונות מראה להראות את ההבדל המורפולוגי של כמוסות ALG-Ca נוצרו על ידי ריכוזים שונים של ALG-Na, 2% (L, J) ו- 3% (K, L), וCaCl 2, 50 מ"מ (L, K) ו- 500 מ"מ (J, L). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תמונות איור 4. אגרגטים תא המורפולוגיה של Encapsulated העכבר iPS בקפסולות מיקרוסקופ של תאי iPS אגרגטים תרבותיים עבור 4, 6, 8 ו -10 ימים (1 - 4 בהתאמה) בשלושה סוגים שונים של כמוסות:. () עירום, ( B) מצופה, ו- (ג) כמוסות חלולות. אנא לחץ עלכאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תרבות Encapsulation ניתן להשוות עם תרבויות השעיה ישירות. תרבות השעיה היא שיטה פשוטה כדי להשיג כמויות גדולות של תאי גזע pluripotent מאשר שיטות אנקפסולציה. עם זאת, השליטה הצבירה של תאים בתרבית השעיה היא עדיין מאתגרת. בשיטת אנקפסולציה, צבירה סלולרית מוגבלת בכמוסות וניתן לשלוט ולכן גם. פרסום קודם הראה כי תאי Encapsulated יצרו אגרגטים בגודל אחיד, ואילו גושי תאים גדולים הופיעו בתרבות חופשית השעיה 7. יתר על כן, דו"ח קודם הוכיח כי תסיסה חזקה גורמת למוות תאי בתרבויות השעיה ישירות של תאי PS; לפיכך מחייב שיעור תסיסה מוגבל. לעומת זאת, אנקפסולציה היא מסוגלת להגן על תאים מלחץ גזירה גם בתנאי השעיה. שיטת אנקפסולציה לכן מאפשרת רמת הגמישות בתנאי ההפעלה כאשר גדלו תאים בתרחיף.
ove_content "> Encapsulation הוא כלי שימושי עבור מחקר תאי גזע, כמו גם שינוי של תהליך הייצור ההמוני. אנקפסולציה של תאי גזע היא שימושית במחקר הנישה תאי גזע, כוללים גורמי מטריצה וצמיחה תאיים. חלק מהחוקרים הראו ש אנקפסולציה של תאי הגזע העובריים של עכבר לתוך הידרוג agarose VEGF-מצומדות קידמה את ההתמיינות של תאים לתאי דם 8.מאמר זה מראה כיצד לתמצת תאי iPS עכבר לכמוסות ALG-Ca-מבוקר גודל בקלות באמצעות זרבובית קואקס וN זרימה 2. אמנם יש כמה תהליך אנקפסולציה עם כלים שונים כגון משאבת peristaltic 9 ומתח חשמלי 10, אנקפסולציה באמצעות N 2 זרימה היא שיטה פשוטה ובטוחה יותר מאשר שיטות אחרות. יתר על כן, בשיטה זו היא מסוגלת ליצור קטנה יותר (כ גדול יותר מ -600 מיקרומטר) כמוסות מאשר השיטה עם משאבת peristaltic(גדול יותר מ 3 מ"מ בערך). כמוסות גדולות לקחת זמן רב יותר לgelling לחלוטין ודגירת זמן רב בCaCl 2 אולי משפיעה מאפיינים סלולריים. יתר על כן, גם ואולי יש לי כמוסות גדולות בעיה של העברה המונית של חומרים מזינים או פסולת כגון גלוקוז וחמצן. לכן הגודל של כמוסות שהוקמו על ידי N 2 זרימה (600 -1000 מיקרומטר) הוא גודל אידיאלי לתרבית תאים בפנים.
שיטה זו אינה מתאימה להכנת כמוסות קטנות ולשלוט על הגודל בדיוק. בגלל ההתמוטטות של הטיפות, שיטה זו אינה מתאימה להכנת כמוסות קטנות יותר מ -500 מיקרומטר. יתר על כן, רק תצפית חזותית יכול לקבוע את הגודל של כמוסות, לכן קשה לשלוט על הגודל של כמוסות בשיטה זו. במקרה זה, שימוש בהתקני מייקרו-נוזליים אולי יכולים לפתור בעיות אלה 11. עם זאת, לפעמים סתימה מתרחשת בmicrodevice כי ג'לי ALG-Na מייד לאחר פגישת CaCl 2 solutיון.
למרות אלגינט אינו מתאים לשינוי כימי בגלל הצמיגות הגבוהה שלו, הוא מסוגל ליצור כמוסות היברידיות עם הידרוג'ל, אשר, כמו PEG, גם קשה להשתמש אנקפסולציה. פרסום קודם הראה כי אנקפסולציה של תאי iPS העכבר בכמוסת פפטיד מצומדות- RGD PEG-ALG הידרוג'ל ההיברידי שיפור צמיחה סלולרית 12. ללא שינוי כימי, אנקפסולציה של תאים לתוך קפסולות רק הידרוג'ל תהיה צפויה לשנות את הנישה תאי גזע על ידי שמירה על גורמים מופרשים. ואכן, מחקרים קודמים הראו כי גורמי הגדילה המופרשים, נשמרו בmicrobioreactor, היו יעילים בשליטה בתאי גזע גורל 13,14.
האוסף של תאים מכמוסות הוא עדיין בעיה לא פתורה בנוגע ליישום שיטת אנקפסולציה לייצור ההמוני של תאי גזע pluripotent. דו"ח קודם הראה כי ציפוי PLL יש צורך kתאי iPS יפ העכבר בתוך 7. אם כמוסות הידרוג'ל ALG-Ca הם מצופים היטב עם polycation כגון PLL (פרוטוקול 3.1-3.2), זה יהיה קשה לשבור את הכמוסות או על ידי חומרים כימיים אנזים או chelating. במקרה זה, נדרשת שיטה מכאנית כגון pipetting על ידי המחט (פרוטוקול 4.3). יכולים להיות מבודדים תאים שנאספו מקרומים שבורים בצנטריפוגה יותר מ -5,000 × גרם, למרות שצנטריפוגה עשויה אולי להשפיע על כדאיות התא בשל G-הכוח הגבוה. כך, טכניקה של עדינות הסרת פסולת מהתאים, כמו גם לשבור את הכמוסות חשובה בפיתוח טכנולוגית אנקפסולציה. למרות שנדרשה כמה התפתחות נוספת ליישם את השיטה לייצור ההמוני של תאים, אנקפסולציה היא טכניקה מבטיחה לשני ייצור ההמוני ומחקר תאי הגזע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse embryo fibroblast | Cell Biolabs | SNL 76/7 | |
| Mouse induced pluripotent stem cell | RIKEN Bio resorce centre | iPS-MEF-Ng-20D-17 | |
| DMEM high-glucose | GIBCO | 11995 | |
| ES qualified FBS | GIBCO | 16141079 | |
| Antibacterial Antibiotics | GIBCO | 15240 | |
| Nonessential Amino Acid | GIBCO | 11140 | |
| 2-mercaptoethanol | GIBCO | 21985-023 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor | Merck Millipore | ESG1107 | |
| Trypsin/EDTA | GIBCO | 25300 | |
| 26 G/16 G needle | Hoshiseido | ||
| 10 ml Syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | |
| HEPES | SIGMA | H4034 | |
| Sodium Alginate | Wako | 194-09955 | |
| Calcium Chloride | Wako | 039-00475 | |
| Poly-L-lysine (MW = 15,000 - 30,000) | SIGMA | P7890 | |
| EDTA | DOJINDO | 345-01865 | |
| Sylinge pump | AS ONE | ||
| Microscope | Olympus | IX71 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| Hispeed camera | nac image technology | Memrecam HX-3 |
References
- Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 114, 201-235 (2009).
- Chen, A., Chen, X., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Critical microcarrier properties affecting the expansion of undifferentiated human embryonic stem cells. Stem cell Res. 7 (2), 97-111 (2011).
- Schroeder, M., et al. Differentiation and lineage selection of mouse embryonic stem cells in a stirred bench scale bioreactor with automated process control. Biotechnol. Bioeng. 92 (7), 920-933 (2005).
- Leung, H. W., Chen, A., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Agitation can induce differentiation of human pluripotent stem cells in microcarrier cultures. Tissue Eng. Part C. 17 (2), 165-172 (2011).
- Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22 (3), 275-282 (2004).
- Weber, L. M., He, J., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled for testing controlled ß-cell microenvironments. Acta Biomater. 2 (1), 1-8 (2006).
- Horiguchi, I., Chowdhury, M. M., Sakai, Y., Tabata, Y. Proliferation, morphology, and pluripotency of mouse induced pluripotent stem cells in three different types of alginate beads for mass production. Biotechnol. Prog. 30 (4), 896-904 (2014).
- Rahman, N., Purpura, K. A., Wylie, R. G., Zandstra, P. W., Shoichet, M. S. The use of vascular endothelial growth factor functionalized agarose to guide pluripotent stem cell aggregates toward blood progenitor cells. Biomaterials. 31 (32), 8262-8270 (2010).
- Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
- Magyer, J. P., Nemir, M., Ehler, E., Suter, N., Perriard, J., Eppenberger, H. M. Mass Production of Embryoid Bodies in Microbeads. Ann. N. Y. Acad. Sci. 944, 135-143 (2001).
- Xu, J., Li, S., Tan, J., Luo, G. Controllable Preparation of Monodispersed Calcium Alginate Microbeads in a Novel Microfluidic System. Chem. Eng. Technol. 31 (8), 1223-1226 (2008).
- Sakai, M. P., Y, Development of Bioactive Hydrogel Capsules for The 3D Expansion of Pluripotent Stem Cells in Bioreactors. Biomater. Sci. 2 (176), 176-183 (2014).
- Chowdhury, M. M., Katsuda, T., Montagne, K., Kimura, H., Kojima, N., Akutsu, H., Ochiya, T., Fujii, T., Sakai, Y. Enhanced effects of secreted soluble factor preserve better pluripotent state of embry- onic stem cell culture in a membrane-based compartmentalized micro-bioreactor. Biomed. Microdevices. 12 (6), 1097-1105 (2010).
- Chowdhury, M. M., Kimura, H., Fujii, T., Sakai, Y. Induction of alternative fate other than default neuronal fate of embryonic stem cells in a membrane-based two-chambered micro- bioreactor by cell-secreted BMP4. Biomicrofluidics. 6 (1), 14117-14117-13 (2012).
