Protocol
1. Materiales Preparación
- Preparar 10 mM de tampón HEPES. Ajustar el pH a 7,0 a temperatura ambiente y añadir NaCl al 0,9%.
- Preparar la solución de alginato de 5% y solución de EDTA 10 mM mediante la mezcla de solución salina tamponada con HEPES preparado en 1.1. Ajustar el pH a 7,0 a temperatura ambiente.
- Autoclave los reactivos (1.1, 1.2) durante 20 min a 121 ° C.
- Preparar platos 60 mm recubiertos de gelatina en capas con 1,2 a 2,0 × 10 6 de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) las células, que se tratan como células alimentadoras por incubación en DMEM que contiene 10% de SFB ES-calificados y 10 g / ml de mitomicina C para 90 - 120 min.
- Mantener inducida ratón madre pluripotentes (iPS) células en el plato con las células alimentadoras en presencia de 5 ml de DMEM de alta glucosa que contiene 20% de ES-calificado FBS, 50 mM de 2-mercaptoetanol, aminoácido no esencial, y antibióticos ( 100 unidades / ml de penicilina G sódica, 100 g / ml de sulfato de estreptomicina y 250 ng / ml de amphotericin B).
- Semilla de 4 × 10 5 células iPS en un 60 mm plato de gelatina recubiertos y incubarlos a 37 ° C y 5% de CO 2. Cambie el medio de cultivo cada día durante la incubación. Después de 3 - 4 días de cultivo, trypsinize células durante 1 min con 500 l de tripsina al 0,05% que contenía 0,02% de EDTA a 37 ° C y 5% de CO 2. Después de eso, separar las células tocando la placa de cultivo diez veces.
- Añadir 2,5 ml de DMEM con 10% de (tres veces siguientes iPS disociación de ratón células en células individuales por pipeteo con 1000 l micropipeta) FBS y antibióticos ES-calificado suspensión de células se centrifuga a 160 × g durante 3 min y retirar el sobrenadante y contar las células . Tras el recuento de células, resembrar las células recogidas en un plato de gelatina con recubrimiento y se incuba durante 30 min para aislar las células iPS a partir de células MEF. Después de contar de las células (generalmente 1-3 × 10 6 células / placa puede ser recogida), reseed 4 × 10 5 células iPS enel plato.
2. encapsulación de células en alginato de hidrogel Cápsulas
- Recoger las células por el mismo procedimiento descrito en 1.5 y 1.6. Después de centrifugación a 160 xg durante 3 min, lavar el sedimento de células iPS con solución salina tamponada con HEPES tres veces. Después de volver a suspender las células en solución salina tamponada con HEPES, filtrar la suspensión celular a través de un filtro de 40 micras de células con el fin de eliminar grandes agregados, que de otro modo podrían obstruir la boquilla.
- Mezclar 2 ml de suspensión de células dentro de solución salina tamponada con HEPES y 3 ml de solución de Na Alg-5%. Finalmente se obtuvieron 5 ml de suspensión de células dentro de solución Alg-Na 3%. La densidad celular es deseablemente más de 10 6 células / ml.
- Después de recoger la suspensión de células en una jeringuilla de 5 ml, instalar una boquilla co-axial (Figura 1A, B) en la jeringa y los puso en la bomba de jeringa. Emit N 2 de flujo de gas (inferior a 1 litro / min) a través de la aguja exterior de la boquilla co-axial yexpulsar la suspensión celular a través de la boquilla interior.
- Recoger gotitas en 250 ml de solución de 0,5% CaCl 2 y esperar 10-20 min para la gelificación mientras se agita a 60-90 rpm.
3. Tratamiento de alginato Cápsulas (opcional)
- Incubar cápsulas Alg-Ca en 0,05% (w / v) de poli-L-lisina (PLL) solución durante 5 min a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Después de lavar las cápsulas con solución salina tamponada con HEPES, incubar en DMEM que contenía FBS al 10% para neutralizar la carga eléctrica en su superficie. Utilizarlos como cápsulas recubiertas (Figura 1C).
- Incubar las cápsulas en solución salina tamponada con HEPES que contiene EDTA 10 mM durante 5 min. Las cápsulas tratados con EDTA se utilizan como cápsulas huecas (Figura 1C).
4. Cultura y recoger las células en cápsulas de alginato
- Se incuban las células encapsuladas en 75 rpm con agitación a 37 ° C y 5% de CO 2durante 10 días.
- Recoger e incubar las cápsulas en EDTA 10 mM a 37 ° C y CO 2 al 5% durante 10 min. Recoger las células de las cápsulas de alginato sin tratamiento PLL por centrifugación a 1000 × g durante 3 min.
- Si cápsulas de alginato son tratados con PLL, romper la membrana Alg-PLL pipeteando arriba y hacia abajo alrededor de diez veces con una aguja unida a una jeringa y se centrífuga a 1.000 - 5.000 × g durante 5 min. Diámetro de la aguja debe ser menor que el tamaño de cápsula y 25 G (260 m) se utilizan agujas en este experimento (600 micras)
- Después de la centrifugación, recoger sedimento celular estrictamente de membranas Alg-PLL rotos si quieres recoger muestras de ARNm a partir de células. El resto de las membranas Alg-PLL posiblemente prevenir purificación de ARNm.
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Representative Results
En protocolo 2.5, la solución de alginato expulsado forma una forma esférica inmediatamente después de la expulsión (Figura 2A - H). Si la suspensión se expulsa con una velocidad de flujo de N 2 inferior a 1L / min, el tamaño de las gotas es uniforme (Figura 2I). Sin embargo, si el flujo de N 2 es superior a 1L / min, la gotita se rompe (Figura 2G, de flecha blanca) y el tamaño de las gotitas se vuelve heterogénea (Figura 2J). Teniendo en cuenta esto, es difícil de preparar gotitas más pequeñas de 500 micras utilizando este método.
En proceso de gelificación (protocolo 2.4), Alg-Na gotitas formadas forma esférica cápsulas Alg-Ca en solución de CaCl2 si la concentración de Alg-Na (más de 3%) es suficiente (Figura 3E-H, K, I). Sin embargo baja concentración de Alg-Na (menor que 3%) hace que no esférica y no lisa forma de cápsulas (Figura 3A-D, I), el cualtener un problema en el proceso de recubrimiento. Incluso si la concentración de Alg-Na no es suficiente, cápsulas esféricas se pueden formar mediante el aumento de la concentración de CaCl 2 (Figura 3J). Sin embargo, alrededor de 50 mM de CaCl 2 es apropiado para la encapsulación porque demasiado alta concentración de CaCl 2 disminuye el crecimiento celular y la viabilidad (datos no mostrados). Después de caer en la solución de CaCl2, opcionalmente se puede esperar unos minutos para gelificante pero recomendamos recoger cápsulas de CaCl2 solución porque demasiado tiempo de incubación en CaCl 2 veces afecta el crecimiento celular. A veces se obtiene en forma de cápsulas no esféricas, incluso si las concentraciones son suficientes. Esto es probablemente porque el lavado de pellet celular no es suficiente antes de resuspender las células en solución Alg-Na. Reactivos residuales tales como suero, posiblemente, evitar la gelificación.
Células encapsuladas pueden crecer en las cápsulas, pero fugas celular (flecha en la figura4A) puede ocurrir en cápsulas sin recubrimiento Alg-PLL (Figura 4A). En el caso de las células iPS de ratón, las células forman agregados en forma de disco en cada cápsula Alg-Ca (Figura 4B), mientras que las células se agrupan y forman agregados esféricos individuales en cada cápsula hueca (Figura 4C). Densidad celular inicial no afecta el tamaño de los agregados en cápsulas, pero la densidad celular baja (10 5 células / ml de gel) provoca el fracaso de crecer (datos no mostrados). Por lo tanto, 10 6 células / ml-gel es deseable encapsular.
En la recolección de células a partir de cápsulas, Alg-Ca hidrogel se puede disolver con liasa o quelantes reactivos de alginato, aunque el recubrimiento Alg-PLL es difícil de disolver con enzimas o productos químicos. Por lo tanto, Alg-PLL debe romperse físicamente con pipeteado, por ejemplo. Membranas rotas pueden disociarse de las células por centrifugación.
Figura 1. Imágenes del Sistema de encapsulación y cápsulas. (A) Una imagen del sistema de encapsulación para la encapsulación Alg-Ca en un banco limpio. (B) Imagen esquemática de una boquilla de co-axial para la encapsulación. (C) Los tres tipos diferentes de cápsulas obtenidas en este informe. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Efecto de N 2 Flujo en la morfología de las cápsulas de imágenes Continuo (A - H). Y la apariencia (I, J) de la formación de gotas de solución Alg-Na 3% a partir de una boquilla co-axial en N 2fluir a 1 L / min (A - D, I) y 2 L / min (E - H, J). Imágenes continuas fueron capturados por la cámara de alta velocidad. Cápsulas de hidrogel se forman en el 0,5% de CaCl2. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Efecto de Alg-Na y CaCl 2 Concentración en la morfología de las cápsulas imágenes continuas (A - H). Y la apariencia (I - L) de Alg-Na gotitas gelificante en solución de CaCl2. En imágenes continuas, gotitas que tienen diferentes concentraciones de Alg-Na, 2% (A - D) y 3% (E - H), se gelificante en 50 mM solución de CaCl2. Imágenes continuas son capturados por hi-Camara rápida. Apariencia imágenes muestran la diferencia morfológica de cápsulas Alg-Ca formados por diferentes concentraciones de Alg-Na, 2% (L, j) y 3% (K, L), y CaCl 2, 50 mM (L, K) y 500 mM (J, L). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
. Figura 4. Morfología de encapsulado ratón iPS agregados de células en las cápsulas imágenes Micrografía de iPS celulares agregados cultivadas durante 4, 6, 8 y 10 días (1-4), respectivamente, en tres diferentes tipos de cápsulas: (A) desnudos, ( B) recubiertos, y (C) cápsulas huecas. Por favor, haga clicaquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Cultura encapsulación puede ser comparado con cultivos en suspensión directos. Cultivo en suspensión es un método más simple para obtener grandes cantidades de células madre pluripotentes que los métodos de encapsulación. Sin embargo, el control de la agregación de células en cultivo en suspensión es todavía difícil. En el método de encapsulación, la agregación celular está limitado en cápsulas y puede por lo tanto ser bien controlada. Una publicación anterior mostró que las células encapsuladas forman agregados de tamaño uniforme, mientras que grandes grupos de células aparecieron en una cultura de libre suspensión 7. Por otra parte, un informe anterior demostró que la fuerte agitación provoca la muerte celular en cultivos de suspensión directa de células PS; necesitando por lo tanto una velocidad de agitación limitada. En contraste, la encapsulación es capaz de proteger las células de la tensión de cizallamiento, incluso bajo condiciones de suspensión. Por consiguiente, el método de encapsulación permite un nivel de flexibilidad en las condiciones de funcionamiento cuando el cultivo de células en suspensión.
ove_content "> encapsulación es una herramienta útil tanto para la investigación de células madre así como la modificación del proceso de producción en masa. La encapsulación de células madre es útil en la investigación de la nicho de células madre, incluyendo los factores de crecimiento y de la matriz extracelular. Algunos investigadores han demostrado que la encapsulación de células ES de ratón en hidrogeles de agarosa-VEGF conjugado promovió la diferenciación de las células en células progenitoras de sangre 8.Este artículo muestra cómo encapsular iPS de ratones células en cápsulas Alg-Ca tamaño controlado fácilmente mediante el uso de co-axial de la boquilla y flujo de N2. Aunque hay algún proceso de encapsulación con varias herramientas tales como la bomba peristáltica 9 y el voltaje eléctrico 10, la encapsulación mediante el uso de N 2 de flujo es un método más simple y más seguro que otros métodos. Además, este método es capaz de formar más pequeño (aproximadamente mayor que 600 micras) cápsulas de que el método con bomba peristáltica(Aproximadamente mayor que 3 mm). Grandes cápsulas toman más tiempo para gelificar por completo y de incubación largo tiempo en CaCl2 posiblemente afecta características celulares. Además, grandes cápsulas también, posiblemente, tienen un problema de transferencia de masa de nutrientes o de residuos tales como glucosa y oxígeno. Por lo tanto el tamaño de las cápsulas formadas por N 2 de flujo (600 -1,000 micras) es el tamaño ideal para el cultivo de células dentro.
Este método no es adecuado para preparar pequeñas cápsulas y controlar el tamaño precisión. A causa de la ruptura de las gotas, este método no es adecuado para preparar cápsulas más pequeñas de 500 micras. Además, sólo la observación visual puede determinar el tamaño de las cápsulas, por lo que es difícil de controlar el tamaño de las cápsulas por este método. En este caso, el uso de dispositivos de microfluidos posiblemente puede resolver estos problemas 11. Sin embargo, a veces la obstrucción se produce en microdispositivo porque geles Alg-Na inmediatamente después de reunirse con CaCl2 solution.
Aunque alginato no es adecuado para la modificación química debido a su alta viscosidad, que es capaz de formar cápsulas de híbridos con hidrogel, que, como PEG, es también difícil de utilizar para la encapsulación. Una publicación anterior mostró que la encapsulación de células iPS de ratón en un PEG-Alg cápsula de hidrogel híbrido-péptido conjugado RGD mejoró el crecimiento celular 12. Sin modificación química, se esperaría que la encapsulación de células en cápsulas de hidrogel simplemente para modificar el nicho de células madre mediante la retención de factores secretados. De hecho, la investigación anterior demostró que los factores de crecimiento secretados, retenidas en un microbioreactor, fueron eficaces para controlar el destino de células madre 13,14.
La colección de las células a partir de cápsulas sigue siendo un problema sin resolver con respecto a la aplicación del método de encapsulación para la producción en masa de células madre pluripotentes. Un informe anterior mostró que ese recubrimiento de PLL es necesario keep células iPS de ratón dentro de 7. Si las cápsulas de hidrogel Alg-Ca están bien recubiertas con un policatión como PLL (protocolo de 03.01 a 03.02), que será difícil de romper las cápsulas ya sea por enzimas o reactivos quelantes. En este caso, se requiere un método mecánico tal como por la aguja de pipeteado (protocolo 4.3). Las células recogidas se pueden aislar a partir de membranas rotas en la centrifugación mayor que 5.000 × g, aunque la centrifugación, posiblemente, podría afectar a la viabilidad de la célula debido a la alta fuerza G. Por lo tanto, una técnica de eliminar suavemente los restos de células, así como romper las cápsulas es importante en el desarrollo de tecnología de encapsulación. Aunque se requiere cierto desarrollo adicional de aplicar este método para la producción en masa de células, la encapsulación es una técnica prometedora para la producción en masa y investigación de células madre.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse embryo fibroblast | Cell Biolabs | SNL 76/7 | |
| Mouse induced pluripotent stem cell | RIKEN Bio resorce centre | iPS-MEF-Ng-20D-17 | |
| DMEM high-glucose | GIBCO | 11995 | |
| ES qualified FBS | GIBCO | 16141079 | |
| Antibacterial Antibiotics | GIBCO | 15240 | |
| Nonessential Amino Acid | GIBCO | 11140 | |
| 2-mercaptoethanol | GIBCO | 21985-023 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor | Merck Millipore | ESG1107 | |
| Trypsin/EDTA | GIBCO | 25300 | |
| 26 G/16 G needle | Hoshiseido | ||
| 10 ml Syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | |
| HEPES | SIGMA | H4034 | |
| Sodium Alginate | Wako | 194-09955 | |
| Calcium Chloride | Wako | 039-00475 | |
| Poly-L-lysine (MW = 15,000 - 30,000) | SIGMA | P7890 | |
| EDTA | DOJINDO | 345-01865 | |
| Sylinge pump | AS ONE | ||
| Microscope | Olympus | IX71 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| Hispeed camera | nac image technology | Memrecam HX-3 |
References
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