Summary
उच्च संकल्प पिघलने विश्लेषण एक विषम जनसंख्या में एकल nucleotide बहुरूपताओं के बीच अंतर करने की क्षमता प्रदान करता है, उत्परिवर्ती एलील प्रवर्धन पूर्वाग्रह एक नमूना भीतर अपेक्षाकृत कम प्रतिशत में उपस्थित एलिलों पता लगाने की क्षमता बढ़ा सकते हैं। इस प्रोटोकॉल उच्च संकल्प पिघलने विश्लेषण की संवेदनशीलता में सुधार है कि सुधार का वर्णन है।
Abstract
उन्मूलन के प्रयासों के दशकों के बावजूद, मलेरिया एक वैश्विक बोझ बनी हुई है। क्षेत्रीय उन्मूलन और वैश्विक उन्मूलन में हाल ही नए सिरे से रुचि मलेरिया रोधी दवाओं के लिए कम संवेदनशीलता के साथ जुड़े भौगोलिक आबादी की विशेषताओं के साथ ही रूपों सहित मलेरिया के लिए जिम्मेदार प्लाज्मोडियम परजीवी प्रजाति है, के बारे में वृद्धि जीनोमिक जानकारी के साथ किया गया।
एक आम आनुवंशिक परिवर्तन, एकल nucleotide बहुरूपताओं (SNPs), परजीवी जीनोटाइपिंग के लिए आकर्षक लक्ष्य प्रदान करता है। इन मार्कर दवा प्रतिरोध मार्कर पर नज़र रखने के लिए, लेकिन यह भी नहीं दवा या अन्य चयनात्मक दबाव के तहत मार्कर का उपयोग परजीवी आबादी को ट्रैक करने के लिए न केवल उपयोगी होते हैं।
एसएनपी जीनोटाइपिंग तरीकों दवा प्रतिरोध को ट्रैक करने के साथ ही विशेष रूप से eliminat में होने जा रही क्षेत्रों में मलेरिया नियंत्रण के प्रयासों के जवाब में, जनसंख्या निगरानी के लिए अलग-अलग परजीवी फिंगरप्रिंट के लिए क्षमता प्रदान करते हैंआयन स्थिति।
सूचनात्मक SNPs विशिष्ट जीनोटाइपिंग प्रौद्योगिकियों के लिए नास्तिक हैं कि पहचान की गई है, वहीं उच्च संकल्प पिघलने (मानव संसाधन विकास मंत्री) के विश्लेषण के लिए क्षेत्र आधारित अध्ययन विशेष रूप से अनुकूल है। एक एकल लेबल जांच में अलग-अलग SNPs की आवश्यकता होती है और कई जीनोम (polygenomic) होते हैं कि नमूने में SNPs पता लगाने के लिए सबसे अच्छा है पर 10% संवेदनशीलता का प्रस्ताव है कि मानक फ्लोरोसेंट जांच आधारित विधियों की तुलना में, मानव संसाधन विकास मंत्री 2-5% संवेदनशीलता प्रदान करता है। इस तरह अवरुद्ध जांच और असममित प्राइमर सांद्रता के साथ ही मामूली एलील के प्रवर्धन की ओर पूर्वाग्रह पीसीआर प्रवर्धन annealing तापमान के अनुकूलन के रूप में मानव संसाधन विकास मंत्री के लिए संशोधन, आगे मानव संसाधन विकास मंत्री की संवेदनशीलता को बढ़ा सकते हैं। संवेदनशीलता सुधार विशिष्ट परख पर निर्भर करते हैं, हम मामूली एलील की 1% से कम करने के लिए पता लगाने की संवेदनशीलता बढ़ गई हैं।
मलेरिया उन्मूलन के करीब पहुंच क्षेत्रों में, उभरते या आयातित दवा प्रतिरोध का जल्दी पता लगाने के लिए जनसंपर्क के लिए आवश्यक हैompt प्रतिक्रिया। इसी तरह, polygenomic संक्रमण का पता लगाने और गुप्त स्थानीय जलाशयों से आयातित परजीवी प्रकार के अंतर करने की क्षमता नियंत्रण कार्यक्रमों को सूचित कर सकते हैं।
यह पांडुलिपि आगे रोगी के नमूने में polygenomic संक्रमण की पहचान करने के लिए अपनी संवेदनशीलता को बढ़ाने कि उच्च संकल्प पिघलने प्रौद्योगिकी के लिए संशोधन का वर्णन है।
Introduction
मलेरिया नियंत्रण और उन्मूलन में नए सिरे से रुचि होने के बावजूद, मलेरिया लगभग संक्रमण के जोखिम में दुनिया की आबादी का आधा और सालाना 550,000 से अधिक लोगों की मृत्यु, उप-सहारा अफ्रीका 1 में विशेष रूप से बच्चों के साथ दुनिया भर में एक बोझ बनी हुई है।
इन नए नियंत्रण और उन्मूलन कार्यक्रमों कम दवा संवेदनशीलता के साथ जुड़े म्यूटेशन के लिए अनुक्रम और विश्लेषण मलेरिया परजीवी के लिए बड़ी संख्या में वृद्धि हुई, डाह के साथ जीनोमिक पुनर्जागरण के द्वारा समर्थित है, और जनसंख्या विशेषताओं 2,3 के लिए कर दिया गया है। एकल nucleotide बहुरूपताओं (SNPs) सबसे अधिक पहचान आनुवंशिक वेरिएंट 4-7 के बीच में हैं।
पोर्टेबल एसएनपी जीनोटाइपिंग तरीकों पर साइट और वास्तविक समय आबादी निगरानी और 8 पर नज़र रखने की पेशकश करते हैं। व्यक्तिगत परजीवी फिंगरप्रिंटिंग के अलावा, 'आणविक बारकोड' भी एलील आवृत्ति में नाटकीय अस्थायी बदलाव का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता हैके रूप में अच्छी तरह से विचरण प्रभावी जनसंख्या के आकार और संक्रमण 9 की जटिलता के रूप में।
सूचनात्मक SNPs के इस सेट को आसानी से कई जीनोटाइपिंग प्लेटफार्मों के लिए अनुकूल है, वहीं उच्च संकल्प (मानव संसाधन विकास मंत्री) के विश्लेषण के विशेष रूप से संवेदनशील और सरल ऑपरेशन और कम लागत पर उपन्यास म्यूटेशन का पता लगाने के अनुक्रमण और अन्य की तुलना में जहां अध्ययन,-आधारित क्षेत्र के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है पिघलने दृष्टिकोण संसाधन गरीब सेटिंग्स में आकर्षक हैं।
मानव संसाधन विकास मंत्री एक फ्लोरोसेंट रंजक को शामिल किया गया है कि मानक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के साथ शुरू होता है। बाद पीसीआर पिघलने विश्लेषण शिखर amplicon के पिघलने के तापमान को निर्धारित करता है; एक छोटी amplicon में एक भी एसएनपी अंतर पर्याप्त शिखर पिघलने के तापमान (टीएम) मतभेद हो सकता है।
इस विधि के लिए कई शोधन (वर्तमान कई alleles के साथ नमूनों में polyg नाबालिग उत्परिवर्ती alleles चतुर्थ श्रेणी (एटी) SNPs सहित SNPs अंतर है, और पता लगाने के लिए बेहतर जीनोटाइपिंग संकल्प प्रस्तावEnomic संक्रमण)। सबसे पहले, assays के आगे और अलग सांद्रता में मौजूद हैं कि प्राइमरों रिवर्स करने के अलावा एसएनपी क्षेत्र पर केंद्रित लघु जांच को शामिल। ये अवरुद्ध जांच की वजह से जांच-टेम्पलेट उत्पाद का उत्पादन बढ़ाने कि असममित प्राइमर सांद्रता के लिए पीसीआर के दौरान परिलक्षित है, लेकिन अधिक में उत्पादित किनारा करने के लिए बाध्य नहीं कर रहे हैं। अतिरिक्त टेम्पलेट किनारा करने के लिए बाध्य जांच से मिलकर ये अलग डबल असहाय amplicons ~ 20-30 बीपी कर रहे हैं; उनकी काफी 10 बेमेल एक या कई आधार जांच-टेम्पलेट के साथ जुड़े बहुत बड़ा टीएम मतभेद के पूरे amplicon (80-150 बीपी) की बढ़त की तुलना में लंबाई में कमी आई है।
दूसरा, उत्परिवर्ती एलील प्रवर्धन पूर्वाग्रह (Maab) बायस के लिए polygenomic संक्रमणों में कम अनुपात में उपस्थित उत्परिवर्ती alleles के प्रति प्रतिक्रिया प्रतिक्रिया annealing तापमान को कम करती है। annealing तापमान पूरी तरह से मिलान (जंगली प्रकार) की टीएमएस और बेमेल (उत्परिवर्ती) जांच के बीच निर्धारित हैएस। इस तापमान पर, जंगली प्रकार एलील के बंधन कि प्रवर्धन इस प्रकार दोनों एक भी नमूना 10 में मौजूद हैं जब उत्परिवर्ती एलील की ओर प्रवर्धन biasing, इसकी बेमेल बराबर की तुलना में रुकावट है काफी स्थिर है।
इन मानव संसाधन विकास मंत्री शोधन के साथ, इस तकनीक मौजूद कम से कम 1 में महामारी दक्षिण अमेरिका के 11 में संक्रमण और नए परिवर्तन का पता लगाने के अनुक्रम में एक दूसरे के लिए तुरंत बगल में स्थित कई SNPs के भेदभाव, और परिवर्तन के साथ जुड़े परजीवी के मूल की ट्रैकिंग और पहचान की अनुमति दी गई है polygenomic नमूने 10 में alleles के%।
वृद्धि की संवेदनशीलता पूर्व उन्मूलन की स्थिति और दवा प्रतिरोध उभर के लिए खतरा उन लोगों के करीब पहुंच क्षेत्रों में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। जल्दी और आसानी से साइट पर कम संवेदनशीलता के साथ जुड़े आयातित परजीवी और SNPs पहचान करने की क्षमता निगरानी प्रयासों और नियंत्रण कार्यक्रमों के बारे में बताते हैंउनके कार्यान्वयन और बढ़ा मलेरिया उन्मूलन और उन्मूलन के प्रयासों के लिए पहचानती आकर्षण के केंद्र की प्रभावशीलता। इस प्रोटोकॉल के लिए विधियों का वर्णन अवरुद्ध जांच पर आधारित है और Maab के लिए वृद्धि की मानव संसाधन विकास मंत्री जीनोटाइपिंग संवेदनशीलता।
Protocol
नोट: इस प्रोटोकॉल 96 अच्छी तरह से थाली, 8-ट्यूब स्ट्रिप्स, और केशिका आधारित प्रणाली (10 μl प्रतिक्रिया मात्रा) के लिए मात्रा और सांद्रता शामिल हैं; हालांकि, मानव संसाधन विकास मंत्री भी तदनुसार सभी संस्करणों स्केलिंग द्वारा एक 5 μl प्रतिक्रिया मात्रा के साथ 384 अच्छी तरह से थाली-आधारित सिस्टम में किया जा सकता है। सबसे प्रणालियों के लिए पता लगाने की सीमा 10 एनजी टेम्पलेट डीएनए के लिए 10 पीजी है।
1. टेम्पलेट्स तैयार
- रक्त क्षेत्र साइट अध्ययन में भाग लेने वाले रोगियों से प्राप्त की और पूरे रक्त के रूप में जमा, pelleted लाल रक्त कोशिकाओं, या फिल्टर पेपर पर से सीधे प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम के नमूने प्राप्त करते हैं।
नोट: नमूने भी संस्कृति-अनुकूलित इन विट्रो में विकसित करने के लिए हो सकता है; विश्लेषण के लिए कुछ मानक प्रयोगशाला उपभेदों मलेरिया अनुसंधान और संदर्भ अभिकर्मक संसाधन केंद्र (MR4 से आदेश दिया जा सकता है, नमूने pelleted लाल रक्त कोशिकाओं या संस्कृति से सीधे इस्तेमाल किया है या पूरे रक्त, लाल रक्त कोशिकाओं, या फिल्टर पेपर से निकाला जा सकता है। - डीएनए से निकालाफिल्टर पेपर या संस्कृति से अनुकूलित उपभेदों
नोट: मानव संसाधन विकास मंत्री नमक एकाग्रता के प्रति संवेदनशील है; कारण चर निकासी तरीकों के लिए एकाग्रता मतभेद काफी पिघलने के तापमान को प्रभावित कर सकते हैं। विशिष्ट अंतिम बफ़र्स सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण कारक नहीं हैं, एक मानक आम क्षालन या मेजबान बफर (यानी, पानी, 1x ते ['कम ते' या 'डीएनए निलंबन बफर': 10 मिमी Tris सीएल, 0.10 मिमी EDTA] का उपयोग करें या 1x ते [10 मिमी Tris सीएल, 1 मिमी EDTA]) सभी नमूनों विषम या असंगत पिघल घटता से बचने के लिए।- के टेम्पलेट dilutions तैयार 10 पीजी -10 एनजी प्रति μl मानक ते, ते, में या पानी के प्रत्येक 10 μl प्रतिक्रिया के लिए।
- Pelleted लाल रक्त कोशिकाओं से प्रत्यक्ष प्रवर्धन
- पतली-धब्बा माइक्रोस्कोपी का उपयोग लाल रक्त कोशिकाओं के पेरासाइटिमिया का निर्धारण करें
नोट: संक्रमित लाल रक्त कोशिकाओं के पेरासाइटिमिया का निर्धारण करने के लिए तरीके रोग नियंत्रण और रोकथाम (सीडीसी) के लिए केंद्र से उपलब्ध हैं: http: //www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html - 0.5% 1 से ऊपर parasitemias पतला: 400 पीसीआर ग्रेड पानी, ते, या ते में। प्रत्येक 5 10 μl प्रतिक्रिया के लिए 3 μl का प्रयोग करें।
- पतली-धब्बा माइक्रोस्कोपी का उपयोग लाल रक्त कोशिकाओं के पेरासाइटिमिया का निर्धारण करें
- नियंत्रण
नोट: मानव संसाधन विकास मंत्री अनुक्रम आबादी 12 में वेरिएंट पता लगाने के लिए जीन स्कैनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, सटीक जीनोटाइपिंग मानकों अनुक्रम-सत्यापित एसएनपी को रोकने के लिए पूछताछ की जा रही की आवश्यकता है। ज्ञात जीनोटाइप इस्तेमाल किया जा सकता के साथ प्लाज्मिड निर्माणों या मलेरिया आइसोलेट्स। सबसे अनुप्रयोगों के लिए, 3D7 (MR4 एमआरए-151) एक जंगली प्रकार नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है। कारण के बीच रन की परिवर्तनशीलता के लिए, हमेशा सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण शामिल हैं।- सकारात्मक नियंत्रण: - अनुक्रम-सत्यापित एसएनपी जीनोटाइप के साथ 1 μl प्लाज्मिड के dilutions या मानकों के अनुसार 10 एनजी 10 पीजी तैयार करें।
- प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं के लिए एक नहीं, टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी) के रूप में उपयोग पीसीआर ग्रेड पानी: नकारात्मक नियंत्रण।
- प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें
- (वैकल्पिक) खनिज तेल ओवरले। नोट: कुछ मानव संसाधन विकास मंत्री सिस्टम स्टैंडअलोन पिघलने प्लेटफार्मों रहे हैं और प्रवर्धन के दौरान संक्षेपण और उत्पाद वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक गर्म ढक्कन नहीं है।
- प्रतिक्रिया मिश्रण लोड करने से पहले अच्छी तरह से प्रत्येक थाली करने के लिए 20 μl प्रकाश खनिज तेल जोड़ें।
- सभी assays के 10x काम कर कंपनियों के शेयरों को तैयार
- सिफारिश 10x काम कर शेयर सांद्रता के साथ ही अवरुद्ध जांच के आधार पर मानव संसाधन विकास मंत्री जीनोटाइपिंग के लिए अंतिम सांद्रता के लिए 1 टेबल को देखें।
- प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें
- अच्छी तरह से थाली या ट्यूब में प्रत्येक के लिए, आगे शेयर काम कर 1 μl 10x जोड़ने और प्राइमरों और जांच, 4.0 रिवर्स - 10 μl की कुल प्रतिक्रिया मात्रा 5.0 μl 2.5x या 2.0x मानव संसाधन विकास मंत्री मास्टर मिश्रण, 1 μl टेम्पलेट, और पीसीआर ग्रेड पानी ।
- कवर प्लेट या ट्यूबों
- ऑप्टिकल प्लेट रों का प्रयोग करेंकेशिका आधारित प्रणाली के लिए थाली आधारित प्रवर्धन के लिए eals, पट्टी-ट्यूब आधारित प्रणाली के लिए ऑप्टिकल टोपियां, और प्लास्टिक की टोपियां। निश्चित करें कि कवरेज पूरा हो गया है और प्लेट और टोपी पूरी तरह से सील और प्रवर्धन के दौरान वाष्पीकरण को रोकने के लिए सुरक्षित हैं।
- स्पिन के नमूने
- स्पिन प्लेटों 1,800 XG पर 3 मिनट के हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए और खनिज तेल का इस्तेमाल किया जाता है, तो तेल और जलीय चरणों अलग करने के लिए।
- (वैकल्पिक) खनिज तेल ओवरले। नोट: कुछ मानव संसाधन विकास मंत्री सिस्टम स्टैंडअलोन पिघलने प्लेटफार्मों रहे हैं और प्रवर्धन के दौरान संक्षेपण और उत्पाद वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक गर्म ढक्कन नहीं है।
- प्रवर्धन प्रोटोकॉल
- थर्मल cycler में प्रतिक्रिया प्लेटों या ट्यूबों रखें। भागो मानक अवरुद्ध-जांच या Maab प्रवर्धन प्रोटोकॉल (टेबल्स क्रमशः 2 और 3,)। इन तरीकों के बीच annealing तापमान में अंतर पर ध्यान दें।
3. मानव संसाधन विकास मंत्री विश्लेषण
- पिघल
- पीसीआर प्रवर्धन के बाद, विश्लेषण पिघलने के लिए आगे बढ़ें। में निर्मित नहीं है कि प्रवर्धन स्टैंडअलोन पिघलने सिस्टम (जैसे।, BioFire रक्षा LightScanner सिस्टम) के लिए, फिर सेमानव संसाधन विकास मंत्री साधन में थर्मल cycler और जगह से परिलक्षित प्लेट ले जाते हैं। दोनों जांच और amplicon के पिघलने चोटियों का उत्पादन करने के लिए 80 डिग्री सेल्सियस - सिस्टम सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस से, 40 से प्लेट पिघला।
नोट: पिघलने और विश्लेषण समय बचाने के लिए, पिघलने खिड़की सिर्फ जांच या amplicon के पिघलने क्षेत्रों के लिए तापमान पर्वतमाला कवर करने के लिए छोटा किया जा सकता है। आवश्यक और -20 डिग्री सेल्सियस या 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत यदि पिघलने के बाद, प्लेटें और ट्यूबों फिर से पिघल जा सकता है। केवल 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ग्लास ट्यूब खुर से ट्यूबों को रोकने के लिए।
- पीसीआर प्रवर्धन के बाद, विश्लेषण पिघलने के लिए आगे बढ़ें। में निर्मित नहीं है कि प्रवर्धन स्टैंडअलोन पिघलने सिस्टम (जैसे।, BioFire रक्षा LightScanner सिस्टम) के लिए, फिर सेमानव संसाधन विकास मंत्री साधन में थर्मल cycler और जगह से परिलक्षित प्लेट ले जाते हैं। दोनों जांच और amplicon के पिघलने चोटियों का उत्पादन करने के लिए 80 डिग्री सेल्सियस - सिस्टम सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस से, 40 से प्लेट पिघला।
- पिघल विश्लेषण
- नकारात्मक नमूने निकालें
- विश्लेषण सॉफ्टवेयर के भीतर, बढ़ाना या कि दांतेदार पिघलने चोटियों नहीं था कि आगे के विश्लेषण के नमूनों से हटा दें। नोट: एक व्यक्ति रन फ़ाइल के लिए विश्लेषण के मोड चुनने के बाद, साधन स्वतः समूहों सकारात्मक और नकारात्मक नमूने हैं। प्रत्येक सबसेट जीनोटाइपिंग से पहले, उपयोगकर्ता मैन्युअल कॉल बदल सकते हैं।
- या तो पिघलने सेवक्र या पिघलने शिखर देखें, घटता पर राइट क्लिक करें उन्हें चुनने के लिए हटाया जा सके। Misclassified नमूने चयन करने के बाद, "नई कॉल," उचित समूह का चयन करें, और क्लिक करने के लिए जाना "परिवर्तन लागू करें।"
- विश्लेषण सॉफ्टवेयर के भीतर, बढ़ाना या कि दांतेदार पिघलने चोटियों नहीं था कि आगे के विश्लेषण के नमूनों से हटा दें। नोट: एक व्यक्ति रन फ़ाइल के लिए विश्लेषण के मोड चुनने के बाद, साधन स्वतः समूहों सकारात्मक और नकारात्मक नमूने हैं। प्रत्येक सबसेट जीनोटाइपिंग से पहले, उपयोगकर्ता मैन्युअल कॉल बदल सकते हैं।
- मानक के अनुसार
- तापमान (-dF / डीटी) ('अंतर घटता') को देखने के लिए सम्मान के साथ सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति के नकारात्मक व्युत्पन्न, इस क्षेत्र से पिघल जांच के चारों ओर सामान्य बनाने सलाखों के चलते हैं।
नोट: जांच क्षेत्र दो पिघलने क्षेत्रों में से कम तापमान है पिघला। सामान्य बनाने सलाखों पिघल चोटियों के आधार पर होना चाहिए।
- तापमान (-dF / डीटी) ('अंतर घटता') को देखने के लिए सम्मान के साथ सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति के नकारात्मक व्युत्पन्न, इस क्षेत्र से पिघल जांच के चारों ओर सामान्य बनाने सलाखों के चलते हैं।
- समूहों की गणना
- सामान्य बनाने के बाद, चुनें 'की गणना समूहों' स्वचालित रूप से समूहों के लिए नमूने आवंटित करने के लिए।
यदि आवश्यक हो, मैन्युअल विशिष्ट समूहों के लिए नमूने आवंटित कर रहे हैं।
नोट: कुछ विश्लेषण सॉफ्टवेयर बदला नहीं जा सकता है कि उच्च संवेदनशीलता थ्रेसहोल्ड है; इन मामलों में, एसoftware नेत्रहीन दूसरे के हैं कि अलग-अलग समूहों के लिए नमूने आवंटित हो सकता है।
- सामान्य बनाने के बाद, चुनें 'की गणना समूहों' स्वचालित रूप से समूहों के लिए नमूने आवंटित करने के लिए।
- जीनोटाइप निरुपित
- मानकों (सकारात्मक नियंत्रण) के आधार पर प्रत्येक समूह के लिए जीनोटाइप निरुपित।
- (, यह सही परिवर्तन misclassified नमूने का चयन और "नया कॉल" के बगल में ड्रॉप-बॉक्स के अधिकार समूह का चयन करके समूहन टैब के तहत किया गया है नहीं तो) उपयोगकर्ता गणना समूहों सही हैं कि इस बात की पुष्टि करने के बाद, "संपादन समूह नामों का चयन समूह "टैब" के तहत "।
- इसी रंग बॉक्स में मानकों की जीनोटाइप दर्ज (मानक 3d7 एक ज्ञात एक जीनोटाइप है और लाल समूह में है, उदाहरण के लिए, लाल समूह जीनोटाइप एक है)। प्रेस "ठीक है" और परिणामों को बचाने के।
- मानकों (सकारात्मक नियंत्रण) के आधार पर प्रत्येक समूह के लिए जीनोटाइप निरुपित।
- निर्यात परिणाम
- निर्यात जीनोटाइप आगे नमूना आबादी के विश्लेषण के लिए एक स्प्रेडशीट के रूप में बताते हैं।
- नकारात्मक नमूने निकालें
Representative Results
डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर और साधन के आधार पर कई अलग अलग तरीकों से देखे जा सकते हैं। आमतौर पर, तापमान परिणामों के खिलाफ तापमान (-dF / डीटी) के संबंध में सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति के नकारात्मक व्युत्पन्न के एक भूखंड पिघलने चोटियों visualizing और जीनोटाइप का निर्धारण करने के लिए सबसे सरल है।
एक पूर्ण पिघलने खिड़की (40 डिग्री सेल्सियस से 80 डिग्री सेल्सियस)। दोनों amplicon और जांच पिघलने क्षेत्रों में परिणाम 1 दोनों क्षेत्रों के लिए सामान्यीकृत पिघलने चोटियों का एक उदाहरण दिखाता लगाना होगा। विशिष्ट SNPs के लिए इसी चोटियों के स्पष्ट भेदभाव में सिर्फ जांच क्षेत्र के परिणामों के विश्लेषण विंडो सेटिंग (चित्रा 2)।
जांच के आधार पर विश्लेषण स्पष्ट रूप से समयुग्मक एसएनपी चोटियों (चित्रा 3) है कि मैच के पिघलने तापमान के साथ अलग-अलग चोटियों के रूप में दोनों alleles की मौजूदगी से पता चलता है।
चित्रा 4 कि progressi से पता चलता हैvely मिश्रित एलिलों (चित्रा 4 बी) की आबादी में उत्परिवर्ती एलील के लिए वृद्धि की संवेदनशीलता, जिसके परिणामस्वरूप उत्परिवर्ती एलील (बाएं साइड चोटी) (चित्रा 4 ए) की दिशा में एक पूर्वाग्रह में प्रवर्धन (Maab) के परिणाम के दौरान annealing तापमान को कम करने।
विश्लेषण किया जा सकता है कि दोनों जांच (कम तापमान) में एक विस्तृत पिघलने खिड़की परिणामों पर तापमान के संबंध में सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति के नकारात्मक व्युत्पन्न साजिश रचने चित्रा 1. जांच और amplicon के पिघलने क्षेत्रों के। और amplicon के पिघलने चोटियों। (। डेनियल एट अल डीओआई से अनुकूलित: 10.1128 / AAC.05737-11) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
एसएनपी बेमेल (ग्रे) कम पिघलने तापमान है, जबकि चित्रा 2. जांच पिघलने चोटियों। परफेक्ट मैच (आम तौर पर जंगली प्रकार एलिलों), उच्च पिघल चोटियों (लाल) में परिणाम है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
दोनों alleles एक नमूने में मौजूद हैं चोटियों पिघलने चित्रा 3. Polygenomic।, जांच के आधार पर मानव संसाधन विकास मंत्री विश्लेषण एकल एलील के नमूने (लाल और भूरे रंग) है कि मैच चोटियों के साथ दो-चोटी घटता (नारंगी) के रूप में दोनों alleles का प्रतिनिधित्व करता है। (। डेनियल एट अल डीओआई से अनुकूलित: 10.1128 / AAC.05737-11) एक बड़ा वी देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा की ersion।
चित्रा 4. उत्परिवर्ती एलील प्रवर्धन पूर्वाग्रह (Maab)। ए उत्तरोत्तर चोटी एक polygenomic या polyallelic नमूने में उत्परिवर्ती (कम तापमान) एलील के लिए इसी की ओर पिघलने शिखर प्रतिक्रिया प्रवर्धन annealing तापमान पूर्वाग्रहों को कम। बी Maab polygenomic या polyallelic नमूनों में 1% से कम में उपस्थित नाबालिग एलिलों पता लगाने के लिए मानव संसाधन विकास मंत्री संवेदनशीलता में यह परिणाम है। (। पार्ट बी डेनियल एट अल डीओआई से अनुकूलित: 10.1128 / AAC.05737-11) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
जांच के आधार पर उच्च संकल्प पिघलने प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं की तालिका 1. सेट अप।
| अवयव | पुन प्रति मात्राकार्रवाई (96 अच्छी तरह से थाली और केशिका ट्यूब) | प्रतिक्रिया प्रति मात्रा (384 अच्छी तरह से थाली) | अंतिम एकाग्रता |
| मानव संसाधन विकास मंत्री मास्टर मिक्स | 4-5 μl | 2-2.5 μl | 1 एक्स |
| 10 एक्स अतिरिक्त प्राइमर | 1 μl | 0.5 μl | 0.50 सुक्ष्ममापी |
| 10 एक्स अन्य प्राइमर | 1 μl | 0.5μl | 0.1 माइक्रोन |
| 10x जांच | 1 μl | 0.5 μl | 0.40 सुक्ष्ममापी |
| पीसीआर ग्रेड पानी | 1-2 μl | 0.5-1 μl | |
| टेम्पलेट डीएनए | 1 μl | 0.5 μl | 0.01-10 एनजी / μl |
| 10 μl | 5 μl |
तालिका 2 Standarघ उच्च संकल्प पिघलने प्रवर्धन की स्थिति।
| तापमान | समय | |
| पकड़ | 95 डिग्री सेल्सियस | 120 सेकंड |
| 45 चक्र | 95 डिग्री सेल्सियस | 30 सेकंड |
| 68 डिग्री सेल्सियस * | 30 सेकंड | |
| एक चक्र | 95 डिग्री सेल्सियस | 30 सेकंड |
| 28 डिग्री सेल्सियस | 30 सेकंड |
* इस तापमान amplicon पर निर्भर है
टेबल उत्परिवर्ती एलील प्रवर्धन पूर्वाग्रह के लिए 3. प्रवर्धन की स्थिति।
| तापमान | समय | साइकिल | रैंप दर | अधिग्रहण मोड | विश्लेषण मोड | |
| Denature | 95 डिग्री सेल्सियस | 30 सेकंड | 1 | 20 | कोई नहीं कोई नहीं | |
| चक्र | 95 डिग्री सेल्सियस | 2 सेकेंड्स | 55 | 20 | कोई नहीं | मात्रा का ठहराव |
| 56 डिग्री सेल्सियस * | 15 सेकंड | 20 | एक | |||
| पिघल | 40 डिग्री सेल्सियस | 0 सेकंड | 0.3 | कोई नहीं | कोई नहीं | |
| 45 डिग्री सेल्सियस * | 0 सेकंड | सतत | पिघल | |||
| 90 डिग्री सेल्सियस * | 0 सेकंड |
* इस तापमान amplicon पर निर्भर है और Maab जब प्रदर्शन कम हो जाएगा
Discussion
सतत मानव संसाधन विकास मंत्री एक के बाद पीसीआर विश्लेषण कदम है; इसलिए, नमूना और परख सेटअप से संक्रमण को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल एक फ्लोरोसेंट intercalating डाई की अतिरिक्त समावेश के साथ, मानक पीसीआर प्रोटोकॉल के समान है डबल असहाय उच्च संकल्प पिघलने चरण के दौरान एकल असहाय डीएनए के लिए। सफल मानव संसाधन विकास मंत्री के विश्लेषण के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारक एक मजबूत पीसीआर उत्पाद है। परख डिजाइन महत्वपूर्ण है, और मानव संसाधन विकास मंत्री परख डिजाइन के लिए अनुकूलित कई उपकरण वाणिज्यिक और ऑनलाइन 13 उपलब्ध हैं। ~ 20 आधार जोड़ी के साथ साथ 80-150 आधार जोड़े की Amplicon लंबाई जांच क्षेत्र के भीतर SNPs के साथ ही कई SNPs के हैप्लोवर्गों अंतर करने के लिए एसएनपी या ब्याज काम सबसे अच्छा के SNPs पर केन्द्रित जांच जाम कर दिया। जांच एक 3 'सी 3 स्पेसर या 3 पर एक 2 आधार जोड़ी बेमेल' प्रवर्धन के दौरान विस्तार रोकने के लिए जो अंत, या तो उपयोग अवरुद्ध किया जा सकता है। जांच वाटसन या क्रिक टेम्पलेट कतरा मैच के लिए तैयार किया जा सकता है; विकल्पस्वीकार्य पिघलने चोटियों पैदा करता है जो जांच के डिजाइन निर्धारित करने के लिए अनुभवजन्य परीक्षण पर निर्भर करता है। आगे अतिरिक्त या रिवर्स प्राइमरों अवरुद्ध जांच करने के लिए anneals कि एकल असहाय प्रवर्धन उत्पाद का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। जांच आगे कतरा अनुक्रम होता है, तो फिर, प्राइमर अधिक में प्रयोग किया जाता है रिवर्स आम तौर पर एक 1: 5 के अनुपात, और रिवर्स कतरा है कि मैच के जांच के लिए उपाध्यक्ष प्रतिकूल।
इसी प्रकार, मानव संसाधन विकास मंत्री पर्याप्त और मजबूत पीसीआर उत्पाद के साथ सबसे अच्छा काम करता है। पीसीआर प्रतिक्रिया अनुकूलन इष्टतम annealing तापमान निर्धारित करने के लिए ढाल पीसीआर और agarose जैल या Bioanalyzer विश्लेषण की आवश्यकता है। खाका एकाग्रता ऐसे पूर्व प्रवर्धन, टेम्पलेट एकाग्रता 13 बढ़ाने के लिए कम प्राइमर एकाग्रता और चक्र नंबर का उपयोग कर सभी लक्ष्यों की पक्षपातपूर्ण मल्टिप्लेक्स प्रवर्धन जैसे तरीकों का उपयोग बढ़ाया जा सकता है।
साधनों के केवल एक मुट्ठी Maab के साथ संगत कर रहे हैं। कांच केशिकाओं ट्यूबों के तापीय गुणों मैं इस्तेमाल कियाn इन प्रणालियों इस विधि की सुविधा। केशिकाओं के छोटे आंतरिक व्यास के साथ ही कांच के माध्यम से तेजी से गर्मी हस्तांतरण प्लास्टिक के थर्मल इन्सुलेट गुणों के कारण annealing और विकृतीकरण चक्र के बीच में धीमी संक्रमण दर है, जो मानक पीसीआर plasticware, की तुलना में अधिक कठोर तापमान नियंत्रण प्रदान करते हैं। इस विधि के साथ, पता लगाने संवेदनशीलता जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती alleles 10 का एक मिश्रण में एक उत्परिवर्ती एलील की 1% से कम करने के लिए 2-5% से कम किया जा सकता है।
मानव संसाधन विकास मंत्री कैंसर जीन वेरिएंट के लिए स्कैनिंग के लिए संक्रामक रोग निगरानी से सेटिंग और कई आवेदनों की एक किस्म में एसएनपी जीनोटाइपिंग के लिए एक, सुगम, कुशल और किफायती उपकरण है। ऐसे रॉश नैनो और LightCycler प्रणालियों (480 और 96) के रूप में अच्छी तरह से मानक प्रवर्धन, वास्तविक समय, और कॉपी संख्या कार्यक्षमता के अलावा पारिस्थितिकी वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली की पेशकश मानव संसाधन विकास मंत्री के रूप में कई अन्य उपकरणों। उच्च throughput मशीनों का उपयोग करना, मानव संसाधन विकास मंत्री बारकोडिंग की लागत लेससभी अभिकर्मकों और उपभोग्य सहित हमारे हाथ में परख प्रति $ 0.50 की तुलना में एस।
यहाँ वर्णित संदर्भ में, क्षेत्र-आधारित अनुप्रयोगों के लिए कम आबादी विविधता, आयातित परजीवी प्रकार का पता लगाने, और कम दवा संवेदनशीलता के साथ जुड़े SNPs की उपस्थिति और प्रसार सहित मलेरिया नियंत्रण के प्रयासों के साथ जुड़े परिवर्तन के लिए वास्तविक समय आबादी निगरानी की अनुमति देते हैं। विधि शोधन मलेरिया उन्मूलन और उन्मूलन की दिशा में प्रगति सूचित करने के लिए उपयोगी अतिरिक्त संवेदनशीलता प्रदान करते हैं।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
लेखकों प्रौद्योगिकी विकास और प्रशिक्षण के अपने समर्थन के लिए बिल एंड मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन धन्यवाद।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LightScanner Master Mix | BioFire Defense | HRLS-ASY-0003 | |
| Light mineral oil | Sigma | M5904 | for BioFire Defense plate-based HRM systems |
| TE | Teknova | T0226 | |
| Te | Teknova | T0221 | TE buffer with reduced EDTA |
| PCR grade water | Teknova | W3330 | |
| Plasmodium falciparum standards | MR4 | MRA-151, 156, 205, 330 | MR4.org offers free genomic DNA |
| Light Scanner Primer Design Software | BioFire Defense | commercial sofware for HRM assay design | |
| LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix | Roche | 4909631001 | For use in LightCycler-480, -96, and nano. 2x concentration |
| Bioanalyzer | Agilent | G2938A | Agilent 2100 bioanalyzer |
| LightCycler 2.0 | Roche | 3531414001 | Capillary-based system for MAAB |
| LightCycler Nano | Roche | 6407773001 | Strip tube-based HRM and amplification |
| LightCycler 96 | Roche | 5815916001 | Strip-tube and plate-based HRM and amplification |
| LightCycler 480 | Roche | 5015278001 | plate-based HRM (96 and 384-well plates) and amplification |
| LightScanner-96 | BioFire Defense | LSCN-ASY-0011 | plate-based HRM (96-well) |
| LightScanner-384 | BioFire Defense | LSCN-ASY-0001 | plate-based HRM (96-well) |
| 96-well plates | Roche | 4729692001 | 96-well plates for HRM (LightCycler |
| 384-well plates | Roche | 4729749001 | 384-well plates for HRM (LightCycler) |
| 96-well plates | Bio-Rad | HSP-9665 | 96-well plates for HRM (LightScanner) |
| 384-well plates | Bio-Rad | HSP-3865 | 384-well plates for HRM (LightScanner) |
| LightCycler 8-Tube Strips (clear) | Roche | 6327672001 | strip tubes for HRM (Light Cycler 96 and Light Cycler Nano) |
| LightCycler Capillaries (20 μl) | Roche | 4929292001 | capillaries for HRM |
| Optical plate seals | Roche | 4729757001 | other brands also work |
References
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