Summary
Yüksek çözünürlüklü erime analizi heterojen nüfus içinde tek nükleotid polimorfizmlerinin ayırt yeteneği sunarken, mutant alel amplifikasyon önyargı, bir numune içinde nispeten düşük oranlarda bulunan allel tespit kabiliyetini artırabilir. Bu protokol, yüksek çözünürlüklü erime analizinin duyarlılığını artırmak geliştirmeleri açıklanır.
Abstract
Eradikasyon çabaları yıllardır rağmen, sıtma küresel bir yük olmaya devam etmektedir. Bölgesel eleme ve küresel eradikasyon son yenilenen ilgi sıtma ilaçlara duyarlılığı azalmış ile ilişkili coğrafi nüfus özellikleri yanı sıra varyasyonları da dahil olmak üzere sıtma sorumlu Plasmodium parazit türler hakkında artan genomik bilgiler eşlik etti.
Bir ortak genetik varyasyon, tek nükleotid polimorfizmleri (SNP), parazit genotipleme için cazip hedefler sunuyor. Bu belirteçler ilaç direnci belirteçlerinin izlemek için değil, aynı zamanda ilaç veya diğer seçilmiş basınç altında işaretlerini kullanarak parazit popülasyonlarını izlemek için sadece yararlıdır.
SNP genotipleme yöntemleri, ilaç direncini izlemek yanı sıra özellikle Eliminat yaklaşıyor bölgelerde sıtma kontrol çabalarına yanıt olarak, nüfus gözetim için bireysel parazitleri parmak olanağı sunmakiyon durumu.
Bilgilendirici SNP belirli genotipleme teknolojilere agnostik olduğunu tespit edilmiştir ederken, yüksek çözünürlüklü erime (HRM) analizi saha bazlı çalışmalar uygundur. Tek etiketli prob bireysel SNP gerektiren ve birden fazla genomları (polygenomic) ihtiva örneklerde SNP tespit etmek, en iyi% 10 hassasiyeti sunan standart floresan prob dayalı yöntemlerle karşılaştırıldığında, HRM% 2-5 hassasiyeti sunuyor. Böyle bloke prob ve asimetrik primer konsantrasyonları yanı sıra küçük alel amplifikasyonu doğru eğilim PCR amplifikasyon tavlama sıcaklıkları optimizasyonu olarak HRM Değişiklikler, ayrıca İKY'nin duyarlılığını artırmak. Hassasiyet düzelme, spesifik tahlil bağlıdır birlikte, küçük bir alelin en az% 1 algılama hassasiyeti artmaktadır.
Sıtma eradikasyonu yaklaşan bölgelerde ortaya çıkan veya ithal ilaç direnci erken teşhis pr için gereklidirOmpT yanıt. Benzer şekilde, polygenomic enfeksiyonları algılamak ve şifreli yerel rezervuar ithal parazit türlerini ayırt yeteneği kontrol programları bilgilendirebilir.
Bu yazıda ayrıca, hasta örneklerinde polygenomic enfeksiyonları tespit hassasiyetini artırmak yüksek çözünürlüklü eritme teknolojisi değişiklikleri açıklar.
Introduction
Sıtma kontrol ve eradikasyon yenilenen ilgiye rağmen, sıtma neredeyse enfeksiyon riski dünya nüfusunun yarısı ve yıllık en fazla 550.000 ölüm, Sahra-altı Afrika'da 1 özellikle çocuklarla, dünya çapında bir yük olmaya devam etmektedir.
Bu yeni kontrol ve eradikasyon programlarının azaltılmış ilaç duyarlılığı ile ilişkili mutasyonlar için sıralı ve analiz sıtma parazitlerinin çok sayıda artmış virülans ile, genomik rönesans tarafından desteklenen ve nüfus özellikleri 2,3 için oylandı. Tek nükleotid polimorfizmleri (SNP) en yaygın tanımlanan genetik varyantlar 4-7 arasındadır.
Taşınabilir SNP genotipleme yöntemleri yerinde ve gerçek zamanlı nüfus gözetim ve 8 izleme sunuyoruz. Tek tek parazitlerin izini ek olarak, "moleküler barkod 'de alel sıklığı dramatik zamansal kaymalarını belirlemek için kullanılırhem de varyans etkili nüfus büyüklüğü ve enfeksiyon 9 karmaşıklığı olarak.
Bilgilendirici SNP bu seti kolayca birçok genotipleme platformlara adapte edilirken, yüksek çözünürlüklü (HRM) analizi, özellikle hassas ve kolay kullanım ve düşük maliyetlerle yeni mutasyonların tespit sıralama ve diğer karşılaştırıldığında çalışmaları, dayalı alana çok uygundur eritme yaklaşımlar kaynak fakiri ortamlarda caziptir.
İK, bir floresan boya içeren standart polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile başlar. Post-PCR eritme analiz zirve amplikon erime sıcaklığına belirler; Kısa bir amplikon tek bir SNP farkı önemli zirve erime sıcaklığı (Tm) farklılıklara sebep olabilir.
Bu yöntemin çeşitli iyileştirmeler (mevcut çoklu alleller ile numunelerde polyg minör mutant allel sınıf IV (AT) SNP de dahil olmak üzere SNP farklılaştırmak ve tespit etmek için daha Genotipleme çözünürlük sunanenomic enfeksiyonları). İlk olarak, deneyler, ileri ve farklı konsantrasyonlarda mevcut olan ters primerleri ilave olarak SNP bölge üzerinde merkezlenmiş, kısa problar içermektedir. Bunlar engellenen sondalar nedeniyle prob-şablon ürününün üretimini artırmak asimetrik primer konsantrasyonları PCR sırasında güçlendirilmiş, ancak fazla üretilen ipliğine bağlamak değildir. Aşırı şablon iplikçiği bağlanan prob oluşan bu ayrı bir çift sicimli amplikonlar ~ 20-30 bp; onların anlamlı 10 uyuşmuyor tek veya birden fazla baz prob-şablonla ilişkili çok büyük Tm farklılıklara tüm amplikona (80-150 bp) kurşun oranla uzunluğu azalmıştır.
İkincisi, mutant alel amplifikasyon önyargı (MAAB) önyargı polygenomic enfeksiyonlarda düşük oranlarda bulunan mutant alleller doğru reaksiyonu reaksiyon tavlama sıcaklığını düşürür. Tavlama sıcaklığı, mükemmel şekilde uyumlu (vahşi tip), TMS ve uyumsuz (mutan) sonda arasında yer almaktadırs. Bu sıcaklıkta, doğal tipte alel bağlanmasının bu amplifikasyon böylece her iki tek bir örnek 10 içinde mevcut olan mutant aleli doğru amplifikasyon eğimlendirme olarak, uyumsuzluk eşdeğerine göre engellendiği kadar stabildir.
Bu İK arıtmalar ile bu teknoloji, bu en az 1 epidemik Güney Amerika'da 11 enfeksiyon ve yeni mutasyonun saptanması, sırayla birbirine hemen yanında yer alan çok sayıda SNP farklılaşma ve mutasyonlarla bağlantılı parazit kökenli izleme ve kimlik sağladı polygenomic örneklerinde 10 allellerin%.
Artan hassasiyet ön eleme durumu ve ilaç direncini ortaya çıkan riski olanlara yaklaşan bölgelerde özellikle önemlidir. Hızla ve kolayca bünyesinde azaltılmış hassasiyet ile ilişkili ithal parazitleri ve SNP tespit yeteneği gözetim çabaları ve kontrol programları hakkında bilgiOnların uygulamaları ve artan sıtma eradikasyonu ve eliminasyon çabaları için tanımlar noktaları etkinliği. Bu protokol yöntemleri açıklar bloke prob-bazlı ve MAAB artan HRM genotipleme hassasiyeti.
Protocol
Not: Bu protokol, 96 oyuklu bir plaka, 8 borulu şeritler ve kılcal tabanlı sistemler (10 ul reaksiyon hacmi) için miktarlar ve konsantrasyonlarda içerir; Bununla birlikte, İK ayrıca buna uygun olarak, tüm miktarlar ölçekleme ile 5 ul reaksiyon hacmi 384 oyuklu plaka bazlı sistemlerde gerçekleştirilebilir. Çoğu sistemler için algılama aralığı 10 ng şablon DNA 10 pg olduğunu.
1. Şablonları hazırlayın
- Kan alan yeri çalışmalara katılan hastalardan elde edilen ve bütün kan gibi saklanan topak kırmızı kan hücreleri ya da filtre kağıdı üzerinde şirketinden Plasmodium falciparum örnekleri elde edilir.
Not: Numuneler, aynı zamanda, kültür adapte in vitro büyümesi olabilir; Analiz için bazı standart laboratuar suşları, Sıtma Araştırma ve Referans Reaktif Resource Center (MR4 sipariş edilebilir, Örnekler topak kırmızı kan hücreleri veya kültüründen direkt olarak kullanılabilir ya da bütün kan, kırmızı kan hücreleri, ya da filtre kağıdı elde edilebilir. - DNA, elde edilenFiltre kağıdı veya kültür adapte suşlar
Not: İK tuz konsantrasyonunda karşı duyarlıdır; nedeniyle değişken emme yöntemleri konsantrasyon farklılıkları belirgin erime sıcaklıkları etkileyebilir. Belirli nihai tamponlar başarı için önemli bir faktör olmasa da, standart bir ortak elüsyon veya tabanda tampon (yani, su, 1x Te ['düşük Te' veya 'DNA süspansiyon tamponu': 10 mM Tris-Cl, 0.10 mM EDTA] kullanın veya 1x TE [10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA]) Tüm numuneler anormal veya tutarsız eriyik eğrileri engellemek için.- Şablonu dilüe 10 pg -10 ng başına ul standart Te, TE, ya da su her 10 ul reaksiyon için.
- Peletlenmiş kırmızı kan hücrelerinin doğrudan büyütme
- Ince smear mikroskopi kullanılarak kırmızı kan hücrelerinin parasitemia belirleyin
Not: Enfekte kırmızı kan hücrelerinin parasitemia saptanması için yöntemler Hastalık Kontrol ve Önleme (CDC) Merkezleri edinilebilir: http: //www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html - % 0.5 1 Yukarıdaki parasitemias seyreltin: 400 PCR sınıf su, TE, veya Te. Her bir 5 ila 10 ul reaksiyon için 3 ul kullanabilir.
- Ince smear mikroskopi kullanılarak kırmızı kan hücrelerinin parasitemia belirleyin
- Kontroller
Not: İK sekansı, bir popülasyonda 12 varyantları saptamak için, gen tarama için de kullanılabilir; Ancak, doğru genotipleme standartları dizisi doğrulanmış SNP içeren ifadeleri alındıktan gerektirir. Bilinen genotipleri kullanılabilir plazmid yapıları veya sıtma ayırır. Çoğu uygulama için, 3D7 (MR4 MRA-151), vahşi tip bir kontrol olarak kullanılır. Nedeniyle arası vadede değişkenliği, her zaman pozitif ve negatif kontrolleri içerir.- Pozitif kontroller: - dizi-doğrulanmış SNP genotipleri ile 1 ul plazmid dilüsyonları veya standartlara göre 10 ng 10 pg hazırlayın.
- Amplifikasyon reaksiyonları için no-şablon kontrolü (NTC) olarak kullanın PCR sınıf su: Negatif kontrol.
- Reaksiyon karışımı hazırlayın
- (İsteğe bağlı) Madeni yağ kaplaması. Not: Bazı HRM sistemleri bağımsız erime platformları ve amplifikasyon sırasında yoğuşma ve ürün buharlaşmayı önlemek için ısıtılmış bir kapak yok.
- Reaksiyon karışımı yüklemeden önce her plaka 20 ul hafif mineral yağı ekleyin.
- Tüm deneyler 10x çalışma stokları hazırlayın
- Tavsiye 10x çalışma stok konsantrasyonları yanı sıra bloke prob tabanlı HRM genotipleme için nihai konsantrasyonlar için Tablo 1'e bakınız.
- Reaksiyon karışımlarını hazırlayın
- Plaka ya da boru içinde her birine, ileri çalışma stok 1 ul 10x ekleme ve primerler ve problar, 4,0 - ters 10 ul bir toplam reaksiyon hacmi 5.0 ul 2.5 x 2.0 x veya İK ana karışımı, 1 ul şablonu ve PCR dereceli su .
- Kapak plakaları veya tüpler
- Optik plaka s kullanınkılcal tabanlı sistemler için plaka bazlı amplifikasyon için eals, şerit boru tabanlı sistemler için optik kapaklar ve plastik kapaklar. Be emin kapsamı tamamlandı ve levhalar, kapaklar tamamen kapalı ve yükseltme sırasında buharlaşmasını önlemek için şifrelenmektedir.
- Spin örnekleri
- Spin plakalar 1800 x g'de 3 dakika hava kabarcıklarını çıkarmak için ve mineral yağı kullanılırsa, yağ ve sulu fazlar ayrıldı.
- (İsteğe bağlı) Madeni yağ kaplaması. Not: Bazı HRM sistemleri bağımsız erime platformları ve amplifikasyon sırasında yoğuşma ve ürün buharlaşmayı önlemek için ısıtılmış bir kapak yok.
- Amplifikasyon protokolü
- Termal döngü reaksiyon plakaları veya tüp yerleştirin. Run standart bloke sonda veya MAAB amplifikasyon protokolleri (Tablo sırasıyla 2 ve 3). Bu yöntemler arasında, tavlama sıcaklık farkı dikkat edin.
3. HRM Analizi
- Eriyik
- PCR amplifikasyonu sonra, analiz erime devam edin. Yerleşik olmayan amplifikasyon bağımsız erime sistemleri (örneğin., BIOFIRE Savunma LightScanner sistemleri) için yenidenİK alet termal döngü cihazı ve yerden yükseltilmiş plaka hareket ettirin. Hem prob ve amplikon eritme doruklarına üretmek için 80 ° C - sistem yazılım arayüzünde, 40 plaka eritebilir.
Not: erime ve analiz zamandan tasarruf etmek için, erime pencere sadece soruşturma veya amplikon erime bölgeleri için sıcaklık aralıklarını kapsayacak şekilde kısaltılabilir. Gerekli ve -20 ° C ya da 4 ° C 'de muhafaza edildiğinde erimesinden sonra, plakalar ve tüpler yeniden eritilebilir. Sadece 4 ° C'de saklayın cam borular çatlama tüpleri önlemek için.
- PCR amplifikasyonu sonra, analiz erime devam edin. Yerleşik olmayan amplifikasyon bağımsız erime sistemleri (örneğin., BIOFIRE Savunma LightScanner sistemleri) için yenidenİK alet termal döngü cihazı ve yerden yükseltilmiş plaka hareket ettirin. Hem prob ve amplikon eritme doruklarına üretmek için 80 ° C - sistem yazılım arayüzünde, 40 plaka eritebilir.
- Erime analizi
- Negatif örnekleri kaldır
- Analiz yazılımı içinde, yükseltmek ya da pürüzlü erime zirveleri yoktu ileri analiz örnekleri çıkarın. Not: Tek bir çalışma dosyası için analiz modunu seçtikten sonra, cihaz otomatik olarak gruplar olumlu ve olumsuz örnekleri. Her alt kümesini genotiplenmesi önce, kullanıcı el aramaları değiştirebilir.
- Ya erimesinieğri ya da erime zirvesi görünümü, eğriler sağ tıklayın seçmek için kaldırılacak. Sınıflandırılmamış örnekleri seçtikten sonra, "Yeni Çağrı," uygun gruplama seçin ve tıklayın gidin "Değiştir uygulayın."
- Analiz yazılımı içinde, yükseltmek ya da pürüzlü erime zirveleri yoktu ileri analiz örnekleri çıkarın. Not: Tek bir çalışma dosyası için analiz modunu seçtikten sonra, cihaz otomatik olarak gruplar olumlu ve olumsuz örnekleri. Her alt kümesini genotiplenmesi önce, kullanıcı el aramaları değiştirebilir.
- Normalleştirmek
- Sıcaklıkta (-df / dT) ('Fark Eğrileri') görünümü açısından normalize floresan negatif türevi, bölgeyi eritmek probu çevreleyen normalleştirme çubuklarını hareket ettirin.
Not: Prob bölgesi iki erime sıcaklığı bölgelerinin düşük bir sıcaklık eriyik. Normalizasyon çubukları eriyik tepe tabanında olmalıdır.
- Sıcaklıkta (-df / dT) ('Fark Eğrileri') görünümü açısından normalize floresan negatif türevi, bölgeyi eritmek probu çevreleyen normalleştirme çubuklarını hareket ettirin.
- Grupları hesaplayın
- Normalleşme sonra, seçin 'Hesapla grupları' otomatik gruplara örnekleri atamak.
Gerekirse, elle belirli gruplara örnekler atamalı yeniden.
Not: Bazı analiz yazılımı değiştirilemez yüksek hassasiyet eşiklerini vardır; bu gibi durumlarda, software görsel başka ait farklı gruplara örnekleri atayabilirsiniz.
- Normalleşme sonra, seçin 'Hesapla grupları' otomatik gruplara örnekleri atamak.
- Genotipleri atama
- Standartlara (pozitif kontroller) dayalı her bir grup için genotipleri atayın.
- (Ki doğru değişiklikler Sınıflandırılmamış örnekleri seçerek ve "Yeni Arama" yanındaki açılan kutudan doğru grubunu seçerek gruplandırma sekmesi altında yapılmış değilse) kullanıcı hesaplanan gruplar doğru olduğunu teyit sonra "Edit Grubu Adları seçin Gruplama "sekmesi" altında ".
- İlgili renkli kutunun içine standartların genotipleri girin (standart 3D7 bilinen bir genotipi vardır ve kırmızı grupta ise, örneğin, kırmızı grup genotip A vardır). "OK" tuşuna ve sonuçları kaydedin.
- Standartlara (pozitif kontroller) dayalı her bir grup için genotipleri atayın.
- İhracat sonuçları
- İhracat genotipi daha örnek popülasyon analiz için bir elektronik tablo olarak çağırır.
- Negatif örnekleri kaldır
Representative Results
Veri analizi yazılımları ve enstrüman bağlı çeşitli şekillerde görülebilir. Tipik haliyle, sıcaklık sonuçlarına karşı sıcaklık (-df / dT) göre normalize floresan negatif türevinin bir grafiğidir erime zirvesine görselleştirilmesi ve genotiplerinin tespiti için çok basittir.
Tam bir ergime penceresi (40 ° C-80 ° C). Her iki amplikon ve prob eritme bölgelerinde neden 1 her iki bölge için normalize erime zirveleri bir örneğini göstermektedir olacaktır. Belirli SNP tekabül zirveleri net ayrımında sadece sonda bölge sonuçlarına analiz penceresi ayarlanması (Şekil 2).
Probe tabanlı analiz açıkça homozigot SNP zirveleri (Şekil 3) maç erime sıcaklıklarında bireysel zirveleri hem allellerin varlığını gösterir.
Şekil 4, bu progressi göstermektedirf karışık allel (Şekil 4B) oluşan bir popülasyonda mutant alel için artmış duyarlılık ile sonuçlanan, mutant aleli (sol taraftaki tepe) (Şekil 4A) doğru bir önyargı amplifikasyon (MAAB) sonuç sırasında tavlama sıcaklığı azaltır.
Analiz edilebilir, her iki prob (daha düşük bir sıcaklığa) geniş bir erime penceresinde sonuçları sıcaklığın göre normalleştirilmiş floresan negatif türevinin çizimi Şekil 1. Prob ve amplikon eritme bölgeleri. Ve amplikon erime zirveleri. (. Daniels ve diğerleri DOI uyarlanmıştır: 10,1128 / AAC.05737-11) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
SNP uyumsuzlukları (gri) düşük erime sıcaklıklarına varken Şekil 2. Probe erime zirveleri. Mükemmel maçlar (genellikle vahşi tip alleller), yüksek erime zirveleri (kırmızı) neden olur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Her iki allel bir numunede mevcut olduğunda doruklarına erime Şekil 3. Polygenomic., Prob bazlı HRM analizi, tek alel örnekleri (kırmızı ve gri) maç zirveleri ile iki tepe eğrileri (turuncu) olarak her iki allel temsil eder. (. Daniels ve diğerleri DOI uyarlanmıştır: 10,1128 / AAC.05737-11) büyük v görüntülemek için lütfen buraya tıklayınızBu rakamın ersion.
Şekil 4. Mutant alel amplifikasyon önyargı (MAAB). A. Kademeli zirve polygenomic ya polyallelic örnek mutant (düşük sıcaklık) alel karşılık gelen doğru erime zirvesi reaksiyonu amplifikasyon tavlama sıcaklığı yanlılıkları düşürülmesi. B. MAAB polygenomic ya polyallelic numunelerde% 1'den daha az mevcut minör allelleri tespit etmek için İK duyarlılık ile sonuçlanır. (. Bölüm B Daniels ve ark DOI uyarlanmıştır: 10,1128 / AAC.05737-11) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Prob tabanlı yüksek çözünürlüklü erime amplifikasyon reaksiyonları Tablo 1. Set-up.
| Bileşen | Re başına hacimişlem (96 oyuklu plaka ve kılcal tüp) | Reaksiyon başına hacmi (384 oyuklu plaka) | Nihai konsantrasyon |
| HRM Master Mix | 4-5 ul | 2-2.5 ul | 1 x |
| 10 x Aşırı astar | 1 ul | 0.5 ul | 0.50 uM |
| 10 x Diğer astar | 1 ul | 0.5ul | 0,1 uM |
| 10x Probe | 1 ul | 0.5 ul | 0.40 uM |
| PCR sınıf su | 1-2 ul | 0.5-1 ul | |
| Şablon DNA, | 1 ul | 0.5 ul | 0.01-10 ng / | il |
| 10 ul | 5 ul |
Tablo 2. Standard yüksek çözünürlüklü erime amplifikasyon koşulları.
| Isı | Zaman | |
| Ambar | 95 ° C | 120 sn |
| 45 devir | 95 ° C | 30 sn |
| 68 ° C * | 30 sn | |
| 1 döngü | 95 ° C | 30 sn |
| 28 ° C | 30 sn |
* Bu sıcaklık amplikon bağımlıdır
Tablo mutant alel büyütme önyargı 3. Çoğaltma koşulları.
| Isı | Zaman | Bisikletler | Rampa hızı | Toplama modu | Analiz modu | |
| Denatüre | 95 ° C | 30 sn | 1 | 20 | Hiçbiri Hiçbiri | |
| Döngü | 95 ° C | 2 sn | 55 | 20 | Hiçbiri | Niceleme |
| 56 ° C * | 15 sn | 20 | Tek | |||
| Eriyik | 40 ° C | 0 sn | 0.3 | Hiçbiri | Hiçbiri | |
| 45 ° C * | 0 sn | Sürekli | Eriyik | |||
| 90 ° C * | 0 sn |
* Bu sıcaklık amplikon bağlıdır ve MAAB gerçekleştirirken azalacaktır
Discussion
Sürekli HRM bir post-PCR analizi adımdır; Bu nedenle, numune ve deney kurulumu geçişi izlemek için kullanılan bir fluoresan araya eklenen boyanın ilave dahil edilmesi ile, standart PCR protokollerine benzer çift kollu yüksek çözünürlüklü eritme aşaması sırasında, tek-şeritli DNA'ya bağlanır. Başarılı HRM analizi için tek ve en önemli faktör sağlam bir PCR ürünüdür. Tahlil tasarım anahtarıdır ve HRM tahlil tasarımı için optimize edilmiş çeşitli araçlar, ticari ve çevrimiçi 13 mevcuttur. ~ 20 baz çifti eşliğinde 80-150 baz çifti amplikon uzunlukları sonda bölgede SNP yanı sıra birden fazla SNP haplotipleri ayırt etmek SNP veya ilgi işin en iyi SNP üzerine merkezli problar engelledi. Sondalar, bir 3 'C3 ara parçası veya 3 bir baz çifti uyuşmazlığı 2', amplifikasyon sırasında uzantısı bilmek sonunda kullanılarak bloke edilebilir. Sondalar Watson ve Crick'in template şeridini eşleştirmek için dizayn edilebilir; seçimkabul edilebilir erime zirveleri üreten prob tasarımı belirlemek için deneysel testler bağlıdır. İleri ya da geri primerler Aşırı problar bloke tavlanan tek sarmallı amplifikasyon ürünü üretmek için kullanılır. Prob ileri şeridi dizisi içeriyorsa, o zaman, primer fazla kullanılan tersine tipik olarak, 1: 5 oranında ve ters iplikçik eşleşen problar için tam tersi.
Benzer şekilde, HRM yeterli ve sağlam PCR ürünü en iyi şekilde çalışır. PCR reaksiyon optimizasyonu optimum tavlama belirlemek için degrade PCR ve agaroz jeller veya Bioanalyzer analiz gerektirir. Şablon konsantrasyonu, ön amplifikasyon, şablon konsantrasyonunun 13 geliştirmek için, düşük primer konsantrasyonu ve döngü sayıları kullanarak tüm hedeflerin yanlı çoğaltılmış çok katlı amplifikasyon gibi yöntemler kullanılarak arttırılabilir.
Araçların sadece bir avuç MAAB ile uyumludur. Cam kapilerleri tüplerin ısıl özellikleri i kullanılırn bu sistemler, bu yöntem kolaylaştırır. Kılcalların, küçük iç çapı, yanı sıra cam yoluyla hızlı bir ısı transferi plastik termal izolasyon özellikleri nedeniyle, tavlama ve denatürasyon döngüleri arasında yavaş bir geçiş oranına sahip standart PCR plasticware, daha sıkı bir sıcaklık kontrolü vardır. Bu yöntem ile, algılama hassasiyeti, yabani tip ve mutant alelleri 10 oluşan bir karışım içinde, bir mutant alelinin az% 1 2-5 ile% azaltılabilir.
HRM kanser gen varyantları için tarama bulaşıcı hastalık gözetim gelen ayarları ve birçok uygulama çeşitli SNP genotipleme için, basit, verimli ve ekonomik bir araçtır. Böyle Roche Nano ve LightCycler sistemleri (480 ve 96) yanı sıra standart büyütme, gerçek zamanlı ve kopya numarası işlevselliğine ek olarak Eko Real-time PCR sistemi teklif İKY gibi çeşitli diğer enstrümanlar. Yüksek verim makineleri kullanarak, HRM barkod maliyeti lesTüm reaktifler ve sarf malzemeleri dahil olmak üzere elinde deney başına 0,50 $, daha s.
Burada anlatılan bağlamda, alan bazlı uygulamalar azaltılmış nüfus çeşitliliği, ithal parazit türlerinin tespiti ve azaltılmış ilaç duyarlılığı ile ilişkili SNP görünüm ve yayılma dahil sıtma kontrolü çabaları ile ilişkili değişiklikler için gerçek zamanlı nüfus gözetimi sağlar. Yöntemi Ayrıntılandırmalar sıtma ortadan kaldırılması ve eradikasyon doğru ilerlemeyi bilgilendirdiğiniz için kullanışlı ek hassasiyeti sunuyoruz.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar teknoloji geliştirme ve eğitim verdiği destek için Bill ve Melinda Gates Vakfı'na teşekkür ediyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LightScanner Master Mix | BioFire Defense | HRLS-ASY-0003 | |
| Light mineral oil | Sigma | M5904 | for BioFire Defense plate-based HRM systems |
| TE | Teknova | T0226 | |
| Te | Teknova | T0221 | TE buffer with reduced EDTA |
| PCR grade water | Teknova | W3330 | |
| Plasmodium falciparum standards | MR4 | MRA-151, 156, 205, 330 | MR4.org offers free genomic DNA |
| Light Scanner Primer Design Software | BioFire Defense | commercial sofware for HRM assay design | |
| LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix | Roche | 4909631001 | For use in LightCycler-480, -96, and nano. 2x concentration |
| Bioanalyzer | Agilent | G2938A | Agilent 2100 bioanalyzer |
| LightCycler 2.0 | Roche | 3531414001 | Capillary-based system for MAAB |
| LightCycler Nano | Roche | 6407773001 | Strip tube-based HRM and amplification |
| LightCycler 96 | Roche | 5815916001 | Strip-tube and plate-based HRM and amplification |
| LightCycler 480 | Roche | 5015278001 | plate-based HRM (96 and 384-well plates) and amplification |
| LightScanner-96 | BioFire Defense | LSCN-ASY-0011 | plate-based HRM (96-well) |
| LightScanner-384 | BioFire Defense | LSCN-ASY-0001 | plate-based HRM (96-well) |
| 96-well plates | Roche | 4729692001 | 96-well plates for HRM (LightCycler |
| 384-well plates | Roche | 4729749001 | 384-well plates for HRM (LightCycler) |
| 96-well plates | Bio-Rad | HSP-9665 | 96-well plates for HRM (LightScanner) |
| 384-well plates | Bio-Rad | HSP-3865 | 384-well plates for HRM (LightScanner) |
| LightCycler 8-Tube Strips (clear) | Roche | 6327672001 | strip tubes for HRM (Light Cycler 96 and Light Cycler Nano) |
| LightCycler Capillaries (20 μl) | Roche | 4929292001 | capillaries for HRM |
| Optical plate seals | Roche | 4729757001 | other brands also work |
References
- World Health Organization report 2013. , 1-286 (2013).
- Hayton, K., Su, X. -Z. Drug resistance and genetic mapping in Plasmodium falciparum. Current genetics. 54 (5), (2008).
- Neafsey, D. E., et al. Genome-wide SNP genotyping highlights the role of natural selection in Plasmodium falciparum population divergence. Genome biology. 9 (12), R171 (2008).
- Volkman, S. K., et al. A genome-wide map of diversity in Plasmodium falciparum. Nature. 39 (1), 113-119 (2007).
- Volkman, S. K., Neafsey, D. E., Schaffner, S. F., Park, D. J., Wirth, D. F. Harnessing genomics and genome biology to understand malaria biology. Nature Reviews Genetics. 13 (5), 315-328 (2012).
- Manske, M., et al. Analysis of Plasmodium falciparum diversity in natural infections by deep sequencing. Nature. 487 (7407), 375-379 (2012).
- Auburn, S., et al. Characterization of within-host Plasmodium falciparum diversity using next-generation sequence data. PLoS ONE. 7 (2), e32891 (2012).
- Daniels, R., et al. A general SNP-based molecular barcode for Plasmodium falciparum identification and tracking. Malaria Journal. 7, 223 (2008).
- Daniels, R., et al. Genetic surveillance detects both clonal and epidemic transmission of malaria following enhanced intervention in Senegal. PLoS ONE. 8 (4), e60780 (2013).
- Daniels, R. R., et al. field-deployable method for genotyping and discovery of single-nucleotide polymorphisms associated with drug resistance in Plasmodium falciparum. Antimicrobial agents and chemotherapy. 56 (6), 2976-2986 (2012).
- Olbadia, N., et al. Clonal outbreak of Plasmodium falciparum in eastern Panama. The Journal of infectious diseases. , (2014).
- Montgomery, J., Wittwer, C. T., Palais, R., Zhou, L. Simultaneous mutation scanning and genotyping by high-resolution DNA melting analysis. Nature protocols. 2 (1), 59-66 (2007).
- Mharakurwa, S., Daniels, R., Scott, A., Wirth, D. F., Thuma, P., Volkman, S. K. Pre-amplification methods for tracking low-grade Plasmodium falciparum populations during scaled-up interventions in Southern Zambia. Malaria Journal. 13, 89 (2014).
