Protocol
1. Clonage de plasmides recombinants Encodage pour AECM Protéines
- Conception de la séquence d'acides aminés du domaine fonctionnel (par exemple, le domaine de liaison aux cellules et d'élastine répétitions analogues). les sites de restriction flanquant design les extrémités des domaines fonctionnels pour faciliter la sous-clonage en utilisant le logiciel libre selon l'une des instructions de logiciel (par exemple, http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/). Ici, sélectionner des sites de restriction uniques qui ne sont pas présents dans le domaine fonctionnel de limiter la digestion des sites destinés. Choisissez sites de restriction qui apparaissent dans le site de clonage multiple (MCS) du vecteur hôte (par exemple, pET22b (+)) pour le sous-clonage.
- Inverser traduire la séquence d'acides aminés dans la séquence de nucleotides en utilisant des sites libres selon les instructions du logiciel. (Par exemple, http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). Assurer codons sont optimisés pour E. coli hôtes.
- Gène d'intérêt peut être Purchasoligonucléotides échoués ed commercialement comme simples (par exemple, si les oligonucléotides <100 paires de bases (pb)) et effectuer l'ADN recuit (voir l'étape 1.4) afin de réduire le coût. Sinon, pour les gènes de plus de 100 pb, ils pourraient être achetés par les sociétés commerciales.
- ADN annelage des oligonucleotides
- Recuire les oligomères d'ADN pour obtenir la séquence de gène souhaité. Dissoudre oligonucleotides d'ADN dans un tampon d'ADN oligomère (Tris 10 mM: 2-amino-2- (hydroxyméthyl) -propane-1,3-diol, pH 8,0, filtré) jusqu'à une concentration finale de 1 pg / pl.
- Ajouter 4 ul de chaque oligomère à 32 pi de tampon d'hybridation d'ADN (Tris 10 mM, NaCl 100 mM et MgCl2 100 nM) afin d'obtenir un mélange total de 40 ul.
- Faire bouillir un bécher d'eau en utilisant une plaque de cuisson et plongez le mélange pendant 5 min, 95 ° C. Retirer le bécher et refroidir progressivement l'ensemble mis en place dans une boîte en polystyrène O / N. Les oligomères ont été recuit et sont prêts pour la digestion.
NOTE: Le pET22b (+) vecteur plasmidique est antibiotique ampicilline-résistant et contient une 6x-His à l'extrémité C-terminale. Le 6x-His présent dans pET22b (+) nous permet d'utiliser ses anticorps marqués pour identifier la protéine cible par western blot à l'étape 7. - Ajouter 6x colorant de chargement de chaque mélange de digestion. Exécuter les mélanges de digestion comprenant séparément une échelle d'ADN de 1,2% de gels d'ADN d'agarose contenant un colorant d'ADN fluorescent aux UV pendant 1 heure à 100 V. Visualiser le gel d'agarose d'ADN de 1,2% avec un illuminateur UV.
- Trancher le gel pour extraire les produits de ADN digéré en utilisant des kits de purification de gel commerciale. Elute en utilisant le volume minimum de la colonne pour obtenir une concentration minimum d'ADN de 50-100 ng / ul.
- Moissonneuse le gène d'intérêt séquentiellement par ligature l'insert d'ADN digéré (par exemple, des répétitions d'élastine ou des domaines de liaison de cellules obtenues par l'ADN recuit) dans le vecteur plasmidique en utilisant la ligase de T4 en utilisant la recette suivante: (2 pi de vecteur, 1 pi de ligase de T4, 1,5 pi de tampon de ligature T4, x ul de l'insert, 10,5 pi x-eau pour un mélange total 15 ul). Incuber le mélange de ligature à la température ambiante pendant 2 heures.
NOTE: concentration molaire de vecteur à insérer doit être modifiée pour optimiser l'efficacité de ligature. Volume de l'insert comme décrit dans la recette x dépend de la concentration de l'ADN élué à l'étape 1.7. - Thaw E. coli DH5a cellules chimiquement compétentes (ou toute souche de clonage) sur de la glace. Des plaques de gélose YT 2x chaud (tableau 1) contenant de l'ampicilline (25 ug / ml) à 37 ° C.
- Transformer les cellules en utilisantchoc thermique:
- Aliquote de 50 pi de cellules compétentes dans des tubes micro-centrifugeuse propres, pré-réfrigérés. Introduire à la pipette 5 ul (entre 100 pg à 100 ng) du mélange de ligation dans les cellules, le pipetage de haut en bas doucement pour mélanger. Laisser le mélange sur de la glace pendant 20 min.
- Immerger le tube de micro-centrifugation contenant le mélange de cellules dans un bain d'eau à 42 ° C pendant 2 min et est retourné à la glace pendant 2 min. Chronométrer le temps d'immersion pour minimiser les dommages de la chaleur vers les cellules.
- Ajouter 500 ul de milieu SOC (tableau 1) dans le tube de micro-centrifugeuse et incuber à 37 ° C avec agitation par secousses pendant 1 heure.
- Diffuser 50 500 ul du mélange de cellules / ligation sur une plaque de gélose YT 2x qui a été pré-chauffé à la température ambiante, contenant de l'ampicilline (25 ug / ml) et on incube les plaques à l'envers à 37 ° CO / N (12-16 h) .
- Le lendemain, ramasser colonies d'ADN provenant de la plaque de gélose en utilisant des embouts de pipette propres. Développer les colonies dans 5 ml de milieu 2YT (tableau1) contenant de l'ampicilline (25 pg / ml) O / N à 37 ° CO / N (12 à 16 h) sous agitation (225 rpm).
- Le jour suivant, utiliser un kit d'isolement de plasmide pour extraire les plasmides d'ADN de chaque colonie choisi selon le protocole du fabricant. Eluer l'ADN avec 50 ul d'eau.
- Effectuez un test digérer avec des enzymes de restriction en utilisant la recette suivante: (ADN 5 pi, 0,2 pi de chaque enzyme de restriction, tampons de l'enzyme 1 ul 10x de restriction et l'appoint d'eau pour un mélange total de 10 pi), incuber pendant 2 heures à 37 ° C à l'écran pour les colonies qui contiennent probablement l'insert et sur un gel de l'ADN d'agarose à 1,2% comme dans l'étape 1.6.
REMARQUE: Lors de la digestion, d'une ligature réussie devrait les résultats dans deux bandes, une pour chaque vecteur et insert qui correspondent à leur poids moléculaire respectif (Figure 1). - Envoyer les colonies probables pour le séquençage de l'ADN en utilisant le promoteur T7 amorces sens et antisens à séquenceurs commerciales.
- A partir du résultat de séquençage, sélectionner une colonie qui a été ligaturé avec succès et en utilisant le plasmide d'ADN pour la transformation dans un E. hôte d'expression coli.
- Thaw E. coli souche d'expression (BL21 (DE3) pLysS) sur de la glace. Pendant ce temps, des plaques d'agar contenant de l'ampicilline chaudes (25 ug / ml) et du chloramphenicol (34 ug / ml) à TA.
NOTE: Le plasmide pLysS présent dans les bactéries souche BL21 (DE3) pLysS contient un gène de résistance au chloramphénicol. Le plasmide pLysS contient un gène de répresseur T7 qui est exprimé de manière constitutive à limiter l'expression de la protéine qui fuit AECM. Le chloramphénicol est nécessaire de sélectionner les cellules bactériennes qui contiennent pLysS au cours de la culture. - Répétez l'étape 1.10 pour obtenir transformé E. cellules de E. coli qui sont prêts à exprimer les protéines artificielles. Enveloppez plaques d'agar dans Parafilm et stocker à l'envers dans 4 6; C pendant jusqu'à un mois.
3. Expression bactérienne de l'AECM Protéines
- Reportez-vous à la figure 2, choisir une colonie à partir de la plaque de gélose transformée avec une pointe de pipette et l'inoculer dans 10 ml de bouillon Terrific (TB) milieux stériles (tableau 1) contenant de l'ampicilline et les antibiotiques de chloramphénicol dans un tube à essai. Incuber cette culture de départ à 37 ° CO / N (12-16 h) avec agitation à 225 rpm.
- Transfert 10 ml de la culture de départ dans 1 litre du milieu frais et stériles TB supplémenté avec les mêmes antibiotiques dans un flacon Erlenmeyer de 3 litres. Incuber la culture à 37 ° C sous agitation à 225 tours par minute pendant 2-3 heures et observer la densité optique de la culture (OD 600) atteint 0,6-0,8 par pipetage 1 ml de la culture dans une cuvette vide pour la lecture. Enregistrer 1 ml de culture avant l'induction pour SDS-PAGE caractérisation.
- Pour mesurer DO 600 de la culture cellulaire, préparer 1 flacon de médias de la tuberculose dans une cuvettepour une mesure à blanc. Séparément, transférer 1 ml de la culture de la fiole de culture dans une nouvelle cuvette vide. Mesurer la densité optique de la culture en utilisant un spectrophotomètre par rapport au témoin à blanc à une absorbance de 600 nm.
- Économisez de l'échantillon (pour analyse ultérieure SDS-PAGE) en transférant les 1 ml d'échantillon de la culture dans un tube de 1,5 ml, centrifuger à 12 000 g pendant 2 min et décanter le surnageant.
- Induire la culture avec isopropyle β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration finale de 1 mM et on incube à 37 ° C sous agitation à 225 tours par minute pendant 4 h un autre. Enregistrer 1 ml de la culture à la fin de l'induction à 4 h pour SDS-PAGE caractérisation.
- Récolter les cellules par transfert de la culture à 1 L flacons de centrifugation et centrifuger à 12 000 xg pendant 30 min à 4 ° C. Jeter le surnageant, peser les culots de cellules et remettre en suspension dans un tampon TEN (1 M de Tris, 0,01 M d'EDTA, 0,1 M de NaCl, pH = 8,0) à 0,5 g / ml.
4. lyse des cultures bactériennes
- Geler la culture de cellules remises en suspension à -80 ° CO / N. Décongeler la culture de cellules congelées dans un bain d'eau à température ambiante ou sur de la glace pour lyser les cellules. Ajouter 10 ug / ml de désoxyribonucléase I (DNase I), 10 ug / ml de ribonucléase A (RNase I), et 50 ug / ml de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) pendant la décongélation et homogénéiser la solution sous agitation lente.
- Une fois que toutes les cellules remises en suspension sont décongelés, ajuster la solution à un pH de 9,0 à augmenter la solubilité de la protéine dans de l'eau 12. Ajouter NaOH 6 N goutte à goutte sous agitation sur de la glace pour obtenir une consistance homogène. Lyse par la perturbation ultrasons pendant 20 min sur la glace en utilisant un diamètre pointe plate de 2 mm, 5 impulsion de sec.
- Centrifuger la solution de cellules à 12.000 g pendant 30 min à 4 ° C. Transférer le surnageant, une bouteille et un magasin vide propre à 4 ° C pour la purification plus tard.
- Pendant ce temps, la remise en suspension de nouveau le culot cellulaire avec un tampon TEN et re-congélation à -80 ° C. Àlyse cellulaire complète, répétez gel / dégel et sonication processus jusqu'à trois fois. Économisez 20 lysat cellulaire pi pour SDS-PAGE caractérisation.
5. Purification de protéines en utilisant l'AECM inverse transition vélo
- Rassembler le lysat cellulaire de l'étape 4.3 et passez à purifier les protéines AECM utilisant ITC, similaire à celle utilisée pour la purification de protéines à base d'élastine 21. Cycles seront effectuées avec les différentes températures qui sont de 4 ° C (appelés «à froid») et 37 ° C (appelés "chaudes") cycles, respectivement.
- Diviser le lysat cellulaire dans 50 ml des flacons de centrifugation, et centrifuger à 40 000 g pendant 2 h à 4 ° C. L'apparition de la pastille cellulaire devrait être brun foncé et de regarder qui coule.
- Eliminer le surnageant par pipetage pour obtenir une séparation nette du culot. Récupérer le surnageant dans des flacons à centrifuger propre et ajouter NaCl à une concentration finale de 1 M (pour un maximum de 3 M). Chaleureuxla solution à 37 ° C pendant 2 heures sous agitation à 225 tours par minute.
NOTE: L'addition de NaCl va déclencher la transition de la composante de l'élastine provoquant l'agrégation AECM. Le surnageant deviendra trouble. Si la concentration en protéine est suffisamment élevée, la protéine de blanc mousseux peut être vu sur les côtés de la bouteille de centrifugeuse. - Centrifuger le surnageant de l'étape 5.3 à 40.000 g pendant 2 heures à 37 ° C. Décanter le surnageant. Écraser la pastille à l'aide d'une spatule métallique et remettre les morceaux de boulettes dans l'autoclave de l'eau distillée glacée (50 mg / ml) avec agitation vigoureuse O / N à 4 ° C en utilisant une barre d'agitation magnétique et la plaque. Le culot doit être complètement dissous.
- Répéter les étapes 5.2 à 5.4 pendant trois à cinq fois pour obtenir une plus grande pureté de la protéine.
- Après le cycle final de purification, dessaler la solution de protéine par dialyse contre de l'eau distillée à 4 ° C. Dialyser solution de protéines contre l'eau pendant 2-3 jours avec des changements dans l'eau tous les 4h ou 8 h pour O / N. Économisez 20 pi de la protéine purifiée pour SDS-PAGE et lyophiliser le reste de la protéine purifiée et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
6. Caractérisation des protéines en utilisant l'AECM Electrophorèse SDS-PAGE
- Préparer un gel SDS-PAGE 12% (si le poids moléculaire est grande, utiliser 8% de gels de SDS-PAGE pour une meilleure séparation). Ajouter tampon 2x de chargement SDS à chaque échantillon, chauffer les échantillons pendant 10 min à 100 ° C et analyser des échantillons sur le gel pendant 1 heure à 100 V ou jusqu'à ce que l'échelle de la protéine correspondant au poids moléculaire de la protéine AECM atteint le milieu de la gel.
- Récupérer le gel de la SDS-PAGE mettre en place et ajouter du bleu de Coomassie tache (tableau 2) avec un volume de submerger le gel pendant 1 h dans une boîte de Petri. Rincer gel dans une solution de décoloration (tableau 2) pendant 5 minutes sur une bascule. Changer la solution de décoloration, et de continuer à décolorer le gel avec bascule jusqu'à ce que le fond de la til devient clair gel. Les bandes de protéines doivent être clairement visibles.
- Comparer la position de la protéine cible contre l'échelle de la protéine pour déterminer le poids moléculaire de la protéine cible.
- Pour confirmer en outre la présence de la protéine cible, effectuer un transfert de Western comme à l'étape 7.
7. Caractérisation des protéines en utilisant l'AECM Western Blot
- Exécutez les échantillons sur un gel SDS-PAGE à 12%, comme dans l'article 6, sans taches.
- Couper une membrane de nitrocellulose à une taille légèrement plus grande que le gel SDS-PAGE. Coupez quatre morceaux de papier filtre à la même taille.
- Wet un morceau de papier filtre avec transfert Western tampon (20% v / v de méthanol, Tris 25 mM, glycine 190, pH 8,3), placer le gel SDS-PAGE sur le dessus du papier filtre, suivi par un autre morceau de papier filtre , puis la membrane de nitrocellulose et une finale autres deux morceaux de papier-filtre. Assurer l'ensemble set-up est submergé avec un tampon de transfert ouest suffisante.
NOTE: Le gel et la membrane ne doivent pas être en contact à ce point du temps que les protéines pourraient se lier à la membrane au contact. - Transférer les protéines sur la membrane de nitrocellulose en plaçant deux papiers-filtres dans une unité de transfert semi-sec occidentale, suivie par la membrane de nitrocellulose, et placer soigneusement le gel SDS-PAGE à l'intérieur et sur la membrane, placer enfin les deux derniers papier filtre humide sur le gel SDS-PAGE. Exécutez le transfert ouest à 45 mA, 30 min. Ajouter tampon si la tension est supérieure à 30 V.
REMARQUE: De préférence, placer le gel SDS-PAGE sur la membrane avec une tentative et éviter de déplacer inutilement le gel sur la membrane sous forme de protéines peuvent se lier à la membrane au moment du contact. - Récupérer et bloquer la membrane de nitrocellulose avec une solution de blocage (5% de lait écrémé dans du PBS pH 7,4, filtré avec un papier filtre) pendant 2 heures à la température ambiante. Éliminer tampon bloquant et ajouter PBS pour rincer.
NOTE: Changer pour de nouveaux gants pour éviter la contamination de la membrane avec prote indésirablesins. - Incuber primaire anticorps anti-His avec dilution dans du PBS à 1: 1 000 à température ambiante pendant 1 h avec bascule. Préparer un mélange dans un volume qui peut submerger l'ensemble membrane, par exemple, avec un rapport de dilution de 1: 1000, ajouter 1 pl d'anticorps (concentration de valeurs: 1 mg / ml) à 999 ul de PBS pour un 1 ml mélange total.
- Rincer la membrane avec 5 ml de PBST (PBS avec 0,1% de Tween 20).
- Incuber avec l'anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) avec une dilution dans du PBS à 1: 5,000 à TA pendant 1 h à bascule. Préparer un mélange dans un volume qui pourrait plonger l'ensemble membrane, par exemple, avec un rapport de dilution de 1: 5000, ajouter 1 pl de l'anticorps (concentration du stock: 1 mg / ml) à 4999 pi de PBS pour un 5 ml mélange total.
- Laver la membrane avec 5 ml de PBST et répéter deux fois.
- Appliquer le substrat chimioluminescent à la membrane avec un volume pour couvrir la membrane et incuber en suivant les instructions pour le substrat utilisé.
NOTE: La sensibilité du substrat à la détection de protéines peut varier, nous vous conseillons un substrat avec une sensibilité maximale pour les signaux très faibles dans le cas augmentation de la concentration d'anticorps ne pas augmenter signaux. - Capturez les signaux chimiluminescents en utilisant un imageur caméra CCD. Ajustez le taux d'anticorps dilution primaire et secondaire si les signaux sont faibles et non spécifique. Incuber plus dans la solution de blocage si le signal de fond est élevé.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lors de la conception des protéines de fusion contenant des séquences répétées en élastine analogue, il est important de maintenir une teneur en élastine dans l'ensemble, assez grande fraction de la protéine de fusion 18. Ceci afin d'assurer que la construction de la protéine de fusion conserve ses caractéristiques de type élastine, afin d'utiliser l'ITC pour la purification. La conception et les séquences décrites dans cette section protéines AECM ont été spécifiquement pris de l'ouvrage de Tjin et al. 14. Dans ce travail, trois protéines AECM ont été clonés avec succès dans le vecteur d'expression pET22b (+). Ligature séquentielle a commencé avec la ligature des séquences répétées d'élastine insérer dans le vecteur pET, suivie par l'insertion, le domaine de liaison cellulaire. Enfin, le dernier groupe de répétitions d'élastine ont été insérés à l'extrémité terminale du domaine de liaison de cellule en utilisant la même méthode. Pour vérifier si les gènes recombinants ont été construits avec succès, chaque plasmide recombinant a été essai digéré avec Xhol et Sali pendant 3 heures à 37 °C. La figure 1 montre l'insert d'ADN et de vecteurs bandes après la digestion de test. Pour chacune des protéines AECM, la taille des inserts correspond à la taille du gène, ce qui confirme que le clonage est en effet réussi. Une vérification supplémentaire par séquençage de l'ADN a également confirmé les résultats de la digestion de test.
Nous étions en mesure de purifier les protéines AECM par teneur en élastine suffisante ITC donnée présente dans chaque protéine AECM. La figure 2 montre le schéma de l'ensemble du processus de purification. Le / N O culture a été inoculé dans 1 litre flacon d'agitation avec un départ OD typique 600 de 0,01. La culture a grandi pour DO 600 de 0,6-0,8 après 3-4 heures. L'expression des protéines a été induite en utilisant 1 mM d'IPTG. Après 4 h, l'OD typique de 1,5 est atteint. La culture bactérienne a été recueilli et soumis à une centrifugation. Le surnageant a été jeté et le culot de cellules a été pesé. Le poids moyen de la pastille de cellules est d'environ 3 g / L deculture. Le culot a été remis en suspension dans un tampon TEN et congelé à -80 ° CO / N.
Une série de cycles de congélation / décongélation ont été utilisés pour lyser les cellules. L'étape de gel-dégel provoque la cellule à gonfler et se rétrécir, en fin de compte la rupture en raison de cristaux de glace formés pendant le processus de congélation. Par la suite, la désoxyribonucléase I et la RNase I ont été ajoutés au lysat cellulaire pour digérer tout l'ADN et l'ARN. PMSF est un inhibiteur de protéase, qui a été également ajouté au lysat cellulaire pour réduire au minimum la dégradation des protéines. Tandis que pour assurer en outre la lyse cellulaire complète, le lysat a été soumis à une sonication en outre maintenu sur de la glace.
Le lysat cellulaire a ensuite été soumis à trois cycles de purification ITC. A la fin des 3 cycles, le culot, à la fin du cycle chaud ressemblait miel dans la cohérence et eu une légère coloration jaune. Le culot tourné transparent au contact avec de l'eau, et dissout facilement dans l'eau à l'autoclave pré-refroidi avec agitation. La protéine purifiée est dialysée pour enlever les résidus salt. La solution de protéines obtenue à l'issue du cycle de préchauffage final a été transféré à une courte longueur de tube de dialyse (avec 12 kDa de poids moléculaire coupé). A la fin de la dialyse, la solution de protéine a été transférée à un 50 tube de centrifugation ml propre et congelé à -20 ° C. Le jour suivant, la solution de protéines congelée est lyophilisée pour éliminer la teneur en eau. La figure 3 montre une image de la protéine dialysée, ayant un aspect typique de la laine en forme.
Pour déterminer si l'expression des protéines a été induite en effet, des échantillons prélevés avant et après induction ont été analysées par électrophorèse SDS-PAGE. Ici, 12% de gel SDS-PAGE était suffisante pour séparer les protéines avec des poids moléculaires de 20-150 kDa. Dans le cas où le poids moléculaire est élevé, à savoir,> 100 kDa, 8% de gels de SDS-PAGE peuvent être utilisés pour une meilleure séparation des protéines. La figure 4 montre une bande de protéine intense à la masse moléculaire prédite à sa induite par lample (piste 2). Typiquement, l'analyse SDS-PAGE a été réalisée immédiatement après l'expression des protéines avant la purification commence. Par la suite, les échantillons prélevés par le procédé de purification peut également être analysé en utilisant une électrophorèse SDS-PAGE afin d'assurer la purification efficace de la protéine cible. La figure 4 montre également un gel de SDS-PAGE contenant un échantillon de la protéine purifiée avec un poids moléculaire de 22 kDa (piste 4 ), correspondant à la LN-5 AECM 14. La pureté estimée des protéines AECM était d'environ 90% -95%; cette valeur a été calculée en comparant les rapports des intensités de la bande de la protéine cible et d'autres bandes de protéine présentes sur le gel SDS (figure 4, voie 4). Enfin, pour déterminer si la protéine purifiée était en effet les protéines AECM, western blot a été effectuée. Par la suite, MALDI-TOF a été également effectué pour déterminer avec précision la teneur en impuretés de la matière purifiée 14. La figure 5 représente la pureté de la protéine de the trois protéines AECM avec un gel SDS-PAGE à la figure 5A et à comparer contre une image de la membrane de nitrocellulose pour western blot à la figure 5B, montrant la présence de protéines cibles Col-IV AECM et LN-5 AECM, étiquetés utilisant des anticorps anti -6x anticorps His-tag conjugués à la peroxydase de raifort (HRP). Les rendements finaux des protéines AECM variait entre 60 mg / L à 120 mg / L.
Figure 1. ADN gel d'agarose électrophorèse des protéines AECM. Vérification de la protéine finale AECM constructions d'ADN par des enzymes de restriction digestion couru sur gel ADN d'agarose à 1,2%. Les plasmides recombinants codant pour chacune des protéines AECM ont été doublement digéré avec Xhol et Sali pendant 3 heures à 37 ° C Les tailles des inserts correspondent à la taille de chaque gène de la protéine AECM (FN910: 1,8kbp, Col-IV: 696 pb, LN-5: 699 pb) et la taille du vecteur pET22b (+) utilisée est de 5,5 kbp.
Figure 2. schématique pour l'expression de la protéine, la lyse et la purification de protéines AECM. Le guide de base pour l'expression de protéines recombinantes, à partir de l'inoculation d'une seule colonie de petite culture et évoluer jusqu'à 1 L de la culture, la récolte et la remise en suspension de cellules, suivie par la lyse des protéines. La purification des protéines a été effectuée en utilisant le comportement LCST des domaines comme élastine présents dans les protéines de la MEC artificiels. Les protéines AECM sont purifiés par l'ITC. Cycles chauds et froids multiples ont été effectuées pour atteindre une pureté élevée de la protéine cible. Enfin, la protéine cible a été dialysée avec de l'eau et on lyophilise jusqu'à utilisation ultérieure. "O / N" = la nuit. "S / n" = surnageant.
Figure 3. Image de la protéine lyophilisée AECM purifié par Inverse transition cyclisme. Lyophilisée LN5-AECM a une apparence de laine comme.
Figure 4. SDS-PAGE électrophorèse sur gel de protéine AECM (LN-5 AECM). La piste 1 et 2 montre la culture avant et après l'induction des protéines. Présence d'une bande épaisse près de 22 kDa montre que la LN-5 AECM a été exprimé avec succès. Lane 3 montre le lysat cellulaire complète tout en piste 4 montre la LN-5 purifié la protéine AECM après 3 cycles de l'ITC.
Figure 5. gel (A) SDS-PAGE des protéines AECM. (B) de Western blot sondé pour 6x His-tag pour Col-IV Et LN-5 AECM protéines. Les deux protéines Col-IV et LN-5 AECM contiennent extrémité C-terminale 6xHis-tag. Chimiluminescence positive observée au poids moléculaire prédit à 22 kDa pour l'échantillon LN-5 AECM et 24 kDa pour l'échantillon Col-IV AECM représentant 6x His-tag présent dans la protéine purifiée.
| Médias / L | Composants et instructions |
| médias SOC | 20 g de tryptone |
| 5 g d'extrait de levure | |
| 0,6 g de NaCl | |
| 0,2 g de KCl | |
| Ajouter et autoclave en 940 de l'eau, | |
| puis ajouter stérile (stérilisé par filtration) | |
| 10 ml de MgCl2 1 M | |
| 10 ml 1 M MgSÛ4 | |
| 40 ml 20% de glucose | |
| 16 g de tryptone | |
| 10 g d'extrait de levure | |
| 5 g de NaCl | |
| 15 g de Bacto Agar (plus seulement pour plaque de gélose) | |
| Dissoudre dans l'eau et compléter à 1 L et autoclave. | |
| Pour préparer des plaques d'agar, refroidir à 55 ° C avant l'addition d'antibiotiques. | |
| Mélangez bien avant de verser dans un plat Petri. | |
| Refroidir jusqu'à ce que les plaques de gélose est solidifiée. | |
| Enveloppez plaques dans Parafilm et les stocker à l'envers dans 4 ° C. | |
| Bouillon Terrific (TB) | 12 g de tryptone |
| 24 g d'extrait de levure | |
| 4 ml Glycerol | |
| Dissoudre dans l'eau et autoclave de 700. | |
| 16.42 g K 2 HPO 4(Merck) | |
| 2,31 g de KH 2 PO 4 (Merck) | |
| Dissoudre dans 300 de l'eau et autoclave séparément, pour assurer sels sont complètement dissous. | |
| Combiner les deux moyennes et des sels après refroidissement. |
Tableau 1. Recettes pour les médias de SOC, 2xYT médias / agar et Terrific Broth. Media pour E. coli culture utilisé dans le clonage moléculaire et l'expression des protéines.
| Solution / L | Composants et instructions |
| Coomassie Brilliant Blue tache | 0,25 g de Coomassie blueR250 |
| 100 ml d'acide acétique glacial | |
| 450 ml d'alcool de méthyle | |
| 450 de l'eau | |
| 100 ml d'acide acétique glacial | |
| 400 ml d'alcool de méthyle | |
| 500 de l'eau |
Tableau 2. Recettes pour des solutions à la tache et Destain gel SDS-PAGE. Bleu de Coomassie brillant R250 pour la coloration et une solution de décoloration pour la caractérisation en utilisant SDS-PAGE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Recombinant ingénierie des protéines est une technique polyvalent pour créer de nouveaux matériaux de protéines en utilisant une approche bottom-up. Les matériaux à base de protéines peuvent être conçues pour avoir de multiples fonctionnalités, adaptées en fonction de l'application d'intérêts. En raison de l'augmentation progrès dans les technologies de clonage et d'expression de protéine, il est devenu relativement simple (et rentable) pour créer une variété de protéines artificielles de façon reproductible et évolutive. Le domaine de l'élastine-like a été incorporée dans un certain nombre de protéines artificielles, pour servir de marqueur de purification, ainsi que de conférer des propriétés mécaniques. Protéines artificielles qui contiennent une séquence d'élastine analogue peuvent être facilement purifiés à l'aide du CCI, ce qui élimine la nécessité pour les colonnes et les anticorps coûteuses de purification.
Ce protocole décrit les étapes pour construire les plasmides recombinants codant pour des protéines AECM. Les gènes codant pour les répétitions de type élastine ont été achetés. Pourséquence peptidique très répétitif comme élastine comme polypeptides, il est recommandé de concevoir la stratégie de clonage tels que la ligature directionnelle récursif (RDL) stratégies peuvent être utilisées 22. En utilisant RDL, polypeptides répétitives avec une longueur spécifique de chaîne pouvaient être synthétisés et donc des gènes d'intérêt peuvent être achetés en tant que monomères courtes.
Dans notre travail, les domaines de liaison aux cellules ont été conçues pour contenir des sites de restriction flanquant Nhel sur les deux extrémités pour permettre la permutation modulaire du domaine de liaison à la cellule centrale. Il est important de sélectionner des sites de restriction qui sont uniques et ne sont pas présents dans le domaine fonctionnel ou ailleurs à l'extérieur du site de clonage multiple (MCS) du vecteur hôte. Ceci est de limiter la digestion de l'insert ou un vecteur à des sites visés. Dans certains cas, il peut être nécessaire d'introduire de nouveaux sites de restriction dans le vecteur d'hôte en utilisant une mutagenèse avant l'insertion du domaine fonctionnel.
Notrestratégie de clonage nous a permis de changer facilement le domaine central de liaison cellulaire pour obtenir trois variantes de protéines AECM. Nous avons également constaté que l'insertion d'un résidu lysine après la méthionine à partir augmenté le rendement en protéines de plus de 10 fois. Cette augmentation considérable du rendement en protéine était plus apparent avec LN-5 protéine AECM, où le rendement en protéine finale est passée de 5 mg / l à 60 mg / L.
Divers E. coli hôtes d'expression ont été comparés, et le BL21 (DE3) pLysS de E. coli a donné les meilleurs rendements en protéines. L'amélioration du rendement en protéine était minime lorsque l'expression des protéines a été induite avec de l'IPTG pendant plus de 4 heures. Il n'y avait pas de différence significative dans l'expression de protéines à des concentrations supérieures à IPTG 1 mM. Cependant, l'expression des protéines a été induite quand la plus haute à une DO proche de 0,6.
Pour la récupération efficace de protéines AECM utilisant ITC, il est important de noter la température de l'appareil de la centrifugeuse. Pour examenple, la plupart des étapes de purification ont été réalisées dans une chambre froide (4 ° C) pour assurer la solubilité maximale des protéines AECM. Il peut également être nécessaire d'effectuer une pré-refroidissement à (4 ° C) le rotor de centrifugeuse O / N avant le cycle froid. De même, le rotor de la centrifugeuse a été pré-chauffé à (37 ° C) avant le cycle de préchauffage pour faire en sorte que la température de la solution de protéine a été maintenue au-dessus de son T t.
En résumé, les procédures de concevoir et de plasmides recombinants clones codant pour des protéines ECM artificielles sont décrits. En particulier, l'expression et la purification des protéines à l'aide de l'AECM ITC sont décrites. Enfin, la caractérisation des protéines AECM utilisant électrophorèse SDS-PAGE et Western Blot ont été décrits.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le financement du ministère de l'Éducation ACRF Tier 1 (RG41) et démarrer bourse de l'Université technologique de Nanyang. Low et Tjin sont financés par la bourse de recherche pour étudiants (RSS) de Nanyang Technological University, Singapour.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET22b (+) | Novagen | 69744 | T7 expression vectors with resistance to ampicillin |
| BL21(DE3)pLysS | Invitrogen | C6060-03 | additional antibiotics - chloramphenicol |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | 1 M stock solution with autoclaved water, make fresh prior to induction. |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | plasmid isolation kit |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Ampicillin | Affymetrix | 11259 | |
| Chloramphenicol | Affymetrix | 23660 | |
| Zymoclean™ gel DNA recovery kit | Zymo Research | D4001 | |
| XL10-gold strain | Agilent Technologies | 200315 |
References
- Chen, Q., Liang, S., Thouas, G. A. Elastomeric biomaterials for tissue engineering. Prog Polym Sci. 38 (3-4), 584-671 (2013).
- Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering - In vivo and in vitro applications. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 352-366 (2011).
- Kushner, A. M., Guan, Z. Modular Design in Natural and Biomimetic Soft Materials. Angewandte Chemie International Edition. 50 (39), 9026-9057 (2011).
- Gagner, J. E., Kim, W., Chaikof, E. L. Designing protein-based biomaterials for medical applications. Acta Biomater. 10 (4), 1542-1557 (2014).
- Gomes, S., Leonor, I. B., Mano, J. F., Reis, R. L., Kaplan, D. L. Natural and genetically engineered proteins for tissue engineering. Prog Polym Sci. 37 (1), 1-17 (2012).
- Werkmeister, J. A., Ramshaw, J. A. M. Recombinant protein scaffolds for tissue engineering. Biomedical Materials. 7 (1), 012002 (2012).
- MacNeil, S. Biomaterials for tissue engineering of skin. Materials Today. 11 (5), 26-35 (2008).
- Fong, E., Tirrell, D. A. Collective Cell Migration on Artificial Extracellular Matrix Proteins Containing Full-Length Fibronectin Domains. Advanced Materials. 22 (46), 5271-5275 (2010).
- Ratner, B. D., Bryant, S. J. BIOMATERIALS: Where We Have Been and Where We are Going. Annual Review of Biomedical Engineering. 6 (1), 41-75 (2004).
- Cai, L., Heilshorn, S. C. Designing ECM-mimetic materials using protein engineering. Acta Biomater. 10 (4), 1751-1760 (2014).
- Annabi, N., et al. Elastomeric recombinant protein-based biomaterials. Biochemical Engineering Journal. 77 (0), 110-118 (2013).
- Heilshorn, S. C., DiZio, K. A., Welsh, E. R., Tirrell, D. A. Endothelial cell adhesion to the fibronectin CS5 domain in artificial extracellular matrix proteins. Biomaterials. 24 (23), 4245-4252 (2003).
- Simnick, A. J., Lim, D. W., Chow, D., Chilkoti, A. Biomedical and Biotechnological Applications of Elastin-Like Polypeptides. Polymer Reviews. 47 (1), 121-154 (2007).
- Tjin, M. S., Chua, A. W. C., Ma, D. R., Lee, S. T., Fong, E. Human Epidermal Keratinocyte Cell Response on Integrin-Specific Artificial Extracellular Matrix Proteins. Macromolecular Bioscience. 14 (8), 1125-1134 (2014).
- MacNeil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).
- Kariya, Y., et al. Differential regulation of cellular adhesion and migration by recombinant laminin-5 forms with partial deletion or mutation within the G3 domain of α3 chain. J Cell Biochem. 88 (3), 506-520 (2003).
- Shang, M., Koshikawa, N., Schenk, S., Quaranta, V. The LG3 module of laminin-5 harbors a binding site for integrin α3Β1 that promotes cell adhesion, spreading, and migration. J Biol Chem. 276 (35), 33045-33053 (2001).
- Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins. Current Protocols in Protein Science. , 6.11.1-6.11.16 (2010).
- Keeley, F. Ch. 4. Evolution of Extracellular Matrix.Biology of Extracellular Matrix. , Springer. Berlin Heidelberg. 73-119 (2013).
- Le, D. H. T., et al. Self-Assembly of Elastin-Mimetic Double Hydrophobic Polypeptides. Biomacromolecules. 14 (4), 1028-1034 (2013).
- MacEwan, S. R., Hassouneh, W., Chilkoti, A. Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), e51583 (2014).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).
