Coxiella burnetii är en obligat intracellulär gramnegativ bakterie som är ansvarig för den zoonos Q-feber. Här beskriver vi metoder för generering av Coxiella fluorescerande transposonmutanter mutanter samt automatisk identifiering och analys av de resulterande interna, replikering och cytotoxiska fenotyper.
Invasion och kolonisering av värdceller från bakteriella patogener beror på aktiviteten hos ett stort antal prokaryota proteiner, definierat som virulensfaktorer, som kan undergräva och manipulera viktiga värdfunktioner. Studiet av värd / patogen interaktioner är därför oerhört viktigt att förstå bakterieinfektioner och utveckla alternativa strategier för att motverka infektionssjukdomar. Detta tillvägagångssätt kräver emellertid utvecklingen av nya hög genomströmning analyser för objektiv, automatiserad identifiering och karakterisering av bakterie virulensdeterminanter. Här beskriver vi en metod för generering av en GFP-märkt mutantbibliotek genom transposon mutagenes och utveckling av hög halt screening metoder för samtidig identifiering av multipla transposoninfogningar associerade fenotyper. Vår arbetsmodell är den intracellulära bakteriell patogen Coxiella burnetii, det etiologiska medlet för zoonos Q-feber, som är associerad med sigVere utbrott med åtföljande hälsa och ekonomisk börda. Den obligat intracellulära naturen hos denna patogen har, tills nyligen, allvarligt försvåras identifieringen av bakteriella faktorer som värd patogen interaktioner, vilket av Coxiella den idealmodell för genomförandet av hög genomströmning / hög innehålls metoder.
Den framväxande, endemisk bakterien Coxiella burnetii är ansvarig för stora utbrott av Q-feber, en försvagande influensaliknande zoonos med allvarliga hälso- och ekonomiska konsekvenser 1. De viktigaste reservoarerna Coxiella är husdjur och lantbruksdjur, och man räknar med att mer än 90% av mjölkkor i USA bär C. burnetii 2. Människor är oavsiktliga värdar som är infekterade av inandning av förorenade aerosoler. Human Q-feber manifesterar antingen som en akut eller kronisk sjukdom, som kan få ödesdigra komplikationer med en dödlighet når 65% 1,3. Med en infektiös dos av 1 till 10 organismer, är Coxiella den mest infektiösa patogenen känd och det har undersökts som ett potentiellt biologiskt vapen 4. Den senaste tidens explosiva utbrott av Q-feber i Nederländerna (2007 – 2010), med fall eskalerande från 182 till mer än 2.000 per år, står som ett exempel på den allvarliga virulens hos denna patogen5.
Den anmärkningsvärda effektivitet Coxiella infektioner sannolikt i samband med dess motståndskraft mot miljöstress i kombination med dess unika anpassning till värdceller. Faktum är Coxiella närvarande i miljön i form av metaboliskt inaktiva små cellvarianter (SCV), som är anmärkningsvärt resistenta mot flera svåra förhållanden (uttorkning, temperatur, etc.). SCVs är upp tagen av fagocytiska celler via α V β 3 integriner 6 medan invasion av icke-fagocytiska celler medieras av Coxiella vidhäftning / invasion OmpA 7 och en ännu oidentifierad receptor. Efter upptag, Coxiella bosatt i åtsittande vakuoler, positiva för de tidiga endosomala markörer Rab5 och EEA1 8. Bakterier svarar på endosomal försurning genom att konvertera till metaboliskt aktiva stora cell varianter (lätta nyttofordon) och aktivera en Dot / Icm typ 4 sekretionssystemet (T4SS) 9, Mycket homolog med den av Legionella pneumophila 10. Utsöndringen av Dot / Icm effektorer tillåter Coxiella att generera ett stort, LAMP1 positiva sura fack som innehåller aktiva lysosomala enzymer där bakterier kan frodas och aktivt skydda infekterade celler från apoptos 11. Därför är den intracellulära cykel av Coxiella kontrolleras av Dot / ICM-medierad translokation av bakteriella effektorer 12, dock mikrobiella faktorer i värdcellinvasion, bakteriell replikering och spridning av infektionen fortfarande till stor del okända.
Kombinera transposonmutagenes och fluorescensbaserade analyser, utvecklar vi objektiva metoder för samtidig identifiering av bakteriella faktorer inblandade i de viktigaste stegen av Coxiella infektioner: 1) internalisering inom värdceller, 2) intracellulär replikering, 3) cell till cell sprids och 4) uthållighet. Till dags dato har vi screenas över 1.000 mutations i 500 Coxiella kodande sekvenser, som försett oss med oöverträffade insikter värd-patogen interaktioner som reglerar Coxiella patogenes 7. Notera kan tillämpat denna metod för studier av andra intracellulära patogener som delar cellbiologi funktioner med Coxiella.
Studiet av värd / patogen interaktioner har visat sig vara en märklig metod för att förstå bakterieinfektioner och utveckla alternativa strategier för att motverka infektionssjukdomar. Men på grund av den mångfald av strategier som utarbetats av olika bakteriella patogener, identifiering och karakterisering av bakteriella virulensfaktorer och värd signalvägar som är riktade vid infektioner utgör en verklig utmaning. Detta kräver utveckling av nya metoder för storskalig kartläggning av viktiga värden / patogen interaktion nav. Den senaste tidens utveckling av innovativa, hög genomströmning och hög-innehåll screeningmetoder utgör en ovärderlig resurs som kan anpassas till studiet av intracellulära bakteriella patogener 15. Här har vi använt zoonotiska bakteriell patogen Coxiella burnetii som en modell för att utveckla screening strategier som kombinerar transposonmutagenes och fluorescensbaserade analyser. Importantly denna screeningmetod medger samtidig övervakning av flera steg i Coxiella intracellulära cykeln, vilket ger en helhetsbild av de strategier som utvecklats av denna bakterie att invadera, replikera och kvarstå inom infekterade celler.
Den strategi som beskrivs här bygger på två väletablerade tekniker, transposonmutagenes och fluorescensbaserade analyser, som med framgång har tillämpats till studiet av bakteriella patogener. Kombinera dessa tekniker i samband med hög genomströmning / high-innehåll skärmar ger oss möjlighet att utvärdera effekterna av ett stort antal bakteriella mutationer genom att analysera ett mycket stort antal händelser (typiskt 15.000 infekterade celler per bakterie mutationer avbildade och analyseras). Detta ger en viktig statistisk analys av händelser såsom bakteriell invasion av värdceller och intracellulär replikering, som är till sin natur, med förbehåll för hög variabilitet. Det är viktigt att notera att andra än ep cellinjerithelial kan användas för denna typ av screening. Emellertid platta och stora epitelceller är optimala för bildanalys som värdcellorganeller är lättare att upptäcka. Eftersom majoriteten av automatiserade mikroskop kan automatiskt hantera ett stort antal plattor, det finns nästan inga gränser för antalet mutanter som kan screenas samtidigt. Beroende på den patogen, kan användaren förmånen att använda en epifluorescens eller ett konfokalt mikroskop. Tidpunkten för bildtagning kommer främst att bero på känsligheten hos mikroskopkamera, på antalet fält som förvärvats per brunn och på antalet kanaler som köps per synfält. Användaren kan bestämma hur man justera dessa faktorer för att optimera screening protokollet. Som ett exempel, avbildas vi en 96-brunnsplatta / h med användning av de betingelser som anges i punkt 5.1. Bildanalys beror till stor del på maskinen (eller kluster av maskiner) används. Vi använder en 12-core (2 x 3,06 GHz 6 kärnor), 48 GB RAM arbetsstation. Denna maskin kräver approxifär 40 minuter för att analysera bilder som förvärvats från en platta.
En viktig aspekt som skall tas med i beräkningen vid utveckling av dessa analyser är inrättandet av nya (eller optimering av befintliga) protokoll för att tillåta manipulation och bearbetning av ett stort antal prover. Ett typiskt exempel är utvecklingen av den inre primer koloni-PCR metod, som tillät oss att snabbt förstärka och sekvens Coxiella DNA-fragment innehållande platsen för insättning av varje transposon, från mycket små prover. Baserat på vår erfarenhet, har hifi-polymeras noga utvalda och testade för att få reproducerbara resultat. Den enda begränsningen av denna metod kan gömma sig i observationen att, i de flesta fall, ca 30% av de behandlade proverna inte utnyttjas, antingen på grund av PCR eller sekvense steg. Men med tanke på att isoleringen av nya transposonmutanter mutanter Coxiella inte är ett hastighetsbegränsande steg, detta inte represkickade en viktig fråga. På samma sätt har utvecklingen av en tillförlitlig analys för att kvantifiera bakteriell koncentration av muterade bestånd varit avgörande för denna strategi. På grund av tendensen hos Coxiella att aggregera när i suspension, är användningen av optiska densitetsavläsningarna inte är tillämpliga för att beräkna koncentrationen av Coxiella kulturer och den enda existerande alternativet var kvantitativ PCR (qPCR). Här är användningen av ett fluorescensmärkta DNA-inskjutande medlet signifikant påskyndas bakterier kvantifiering.
Detta tillvägagångssätt kan också dra nytta av användningen av stabila cellinjer som uttrycker fluorescerande markörer för flera intracellulära avdelningar beroende på patogenen används. En annan viktig aspekt är användningen av cellodlingsmedier som saknar fenolrött. Vi observerade att denna pH-indikator har en naturlig fluorescens spänner de röda och gröna spektrum som mättar signal som är inspelad på den automatiserade fluorescensläsare.
THan strategi som presenteras här bygger på slumpmässigt transposonmutagenes. För mutanter av intresse, rekommenderar vi att validera unika införlivande (och clonality) med hjälp av Southern blot och PCR-amplifieringar av transposonen insättningsstället.
Förutom den utrustning som beskrivs i protokollet avsnittet lag intresserade av att använda metoden screening presenteras här kommer att ta stor fördel i inrättandet av en relationsdatabas för datainsamling, en server för lagring av data och en arbetsstation för snabb bildanalys.
Viktigt är att metoden beskrivs här är lämpad för studier av andra intracellulära bakteriella patogener som en slumpmässig mutagenes metod existerar för patogenen kan cellinjer infekteras av patogenen och detta visar en specifik fenotyp under infektion.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by an Avenir/ATIP grant to Matteo Bonazzi and a Marie Curie CIG (N° 293731) to Eric Martinez. The authors would like to thank Dr. Robert Heinzen for sharing C. burnetii strains, antibodies and tools, Virginie Georget and Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) for their technical assistance and data analysis.
Citric acid | Sigma | C0759-500G | ACCM-2 medium component |
Sodium citrate | Sigma | S4641-500G | ACCM-2 medium component |
Potassium phosphate | Sigma | 60218-100G | ACCM-2 medium component |
Magnesium chloride | Sigma | M2670-100G | ACCM-2 medium component |
Calcium chloride | Sigma | C5080-500G | ACCM-2 medium component |
Iron sulfate | Sigma | F8633-250G | ACCM-2 medium component |
Sodium chloride | Sigma | S9625-500G | ACCM-2 medium component |
L-cysteine | Sigma | C6852-25G | ACCM-2 medium component |
Bacto Neopeptone | BD (Beckton-Dickinson) | 211681 | ACCM-2 medium component |
Casamino acids | BD (Beckton-Dickinson) | 223050 | ACCM-2 medium component |
Methyl-B-Cyclodextrin | Sigma | C4555-10G | ACCM-2 medium component |
RPMI w/glutamax | Gibco | 61870-010 | ACCM-2 medium component |
RPMI w/glutamax, without phenol red | Gibco | 32404-014 | For cell culture and infection |
Fetal Bovine Serum | GE healthcare | SH30071 | For cell culture |
Trypsin EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | For cell culture |
Saponin | Sigma | 47036 | For immunofluorescence staining |
Ammonium chloride | Sigma | A9434 | For immunofluorescence staining |
Bovine Serum Albumine | Sigma | A2153 | For immunofluorescence staining |
Electroporation cuvette 0.1 cm | Eurogentec | ce0001-50 | For Coxiella transformation |
Trackmates screw top tubes with caps | Thermo Scientific | 3741 | 2D barcoded screwcap |
96-well microplate with black walls and bottom | Greiner | 655076 | Flat dark bottom, for dsDNA quantitation |
96-well microplate, ��clear, black walls | Greiner | 655090 | Flat transparent bottom, for cell culture and imaging |
96-well PCR microplate | Biorad | 2239441 | DNAse/RNAse free |
96-well plate, Deepwell | Labcon | 949481 | For Coxiella mutants infections |
PicoGreen | Life Technologies | P7581 | For dsDNA quantitation |
Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | For dsDNA quantitation |
Phusion High fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | For single primer colony PCR |
Celltracker Red CMTPX | Life Technologies | C34552 | For imaging |
Anti-LAMP1 antibody | Sigma | 94403-1ML | For immunofluorescence staining |
Hoechst 33258 | Sigma | L1418 | For imaging |
Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro | Tecan | ||
Epifluorescence automated microscope Cellomics | Thermo Scientific |