Coxiella burnetii er en obligat intracellulær Gram-negativ bakterie er ansvarlig for zoonotisk sygdom Q-feber. Her beskriver vi fremgangsmåder til generering af Coxiella fluorescerende transposon mutanter samt automatiseret identifikation og analyse af de resulterende internalisering, replikations- og cytotoksiske fænotyper.
Invasion og kolonisering af værtsceller ved bakterielle patogener afhænge af aktiviteten af et stort antal af prokaryote proteiner, defineret som virulensfaktorer, som kan nedbryde og manipulere centrale vært funktioner. Studiet af vært / patogen interaktioner er derfor yderst vigtigt at forstå bakterielle infektioner og udvikle alternative strategier til infektionssygdomme. Denne tilgang dog kræver udvikling af nye high-throughput assays til fordomsfri, automatiseret identifikation og karakterisering af bakterielle virulensdeterminanter. Her beskriver vi en fremgangsmåde til frembringelse af et GFP-mærket mutant bibliotek ved transposon-mutagenese og udvikling af høj-indhold screeningsmetoder til samtidig identifikation af multiple transposon-associerede fænotyper. Vores arbejdsmodel er det intracellulære bakterielle patogen Coxiella burnetii, det ætiologiske agens for zoonosen Q-feber, som er forbundet med SEvere udbrud med en deraf følgende sundhedsmæssige og økonomiske byrder. Den obligat intracellulære karakter af denne patogen har, indtil for nylig, alvorligt hæmmet identifikationen af bakterielle faktorer involveret i vært patogen interaktioner, hvilket gør af Coxiella den ideelle model for gennemførelse af high-throughput / højt indhold tilgange.
Den spirende, endemiske bakterie Coxiella burnetii er ansvarlig for store udbrud af Q-feber, en invaliderende influenzalignende zoonose med alvorlige sundheds- og økonomiske konsekvenser 1. De vigtigste reservoirer af Coxiella er indenlandske og husdyr, og det anslås, at mere end 90% af malkekvæg i USA bærer C. burnetii 2. Mennesker er tilfældige værter, der er smittet ved indånding af forurenede aerosoler. Menneskelig Q-feber manifesterer enten som en akut eller kronisk sygdom, som kan have fatale komplikationer med en dødelighed nåede 65% 1,3. Med en infektiøs dosis på 1 – 10 organismer, Coxiella er den mest infektiøse patogen kendes, og det er blevet undersøgt som en potentiel bio våben 4. Den nylige eksplosive udbrud af Q-feber i Nederlandene (2007 – 2010), med sager eskalerende fra 182 til mere end 2.000 året, står som et eksempel på den alvorlige virulens af dette patogen5.
Den bemærkelsesværdige effektivitet Coxiella infektioner er sandsynligvis forbundet med dets resistens over for miljømæssig stress, kombineret med sin unikke tilpasning til værtsceller. Faktisk Coxiella er til stede i miljøet i form af metabolisk inaktive små celle-varianter (SCV), som er bemærkelsesværdigt modstandsdygtigt over for flere barske betingelser (udtørring, temperatur, etc.). Olieudtag er op taget af fagocytiske celler via α V β 3 integriner 6 mens invasion af ikke-fagocytiske celler medieres af Coxiella adhæsion / invasion OmpA 7 og en endnu uidentificeret receptor. Efter optagelse, Coxiella bosat i tætsiddende vakuoler, positive for de tidlige endosomale markører Rab5 og EEA1 8. Bakterier reagere på endosomal forsuring ved at konvertere til metabolisk aktive store celle varianter (lette erhvervskøretøjer) og aktivere en Dot / Icm type 4 sekretionssystem (T4SS) 9, Stærkt homolog med den for Legionella pneumophila 10. Udskillelsen af Dot / integrerede dyrkningsmetoder effektorer tillader Coxiella at generere et stort, LAMP1-positive sure rum indeholdende aktive lysosomale enzymer, hvor bakterier kan trives og aktivt beskytte inficerede celler fra apoptose 11. Derfor er den intracellulære cyklus af Coxiella kontrolleres af Dot / Icm-medieret translokation af bakterielle effektorer 12 imidlertid de mikrobielle faktorer involveret i værtscelle invasion, bakteriel replikation og udbredelse af infektionen forbliver stort set ukendt.
Kombinere transposon mutagenese og fluorescens-baserede assays, udvikler vi uvildige metoder til samtidig identifikation af bakterielle faktorer involveret i de vigtigste trin af Coxiella infektioner: 1) internalisering inden værtsceller, 2) intracellulær replikation, 3) celle-til-celle-spredning og 4) vedholdenhed. Til dato har vi screenet over 1.000 mutations i 500 Coxiella kodende sekvenser, som gav os med hidtil usete indblik i værten-patogen interaktioner, der regulerer Coxiella patogenese 7. Af note, kan denne fremgangsmåde anvendes til studiet af andre intracellulære patogener, der deler cellebiologiske funktioner med Coxiella.
Studiet af vært / patogen interaktioner har vist sig at være en bemærkelsesværdig metode til at forstå bakterielle infektioner og udvikle alternative strategier til infektionssygdomme. Men på grund af mangfoldigheden af strategier udarbejdet af forskellige bakterielle patogener, identifikation og karakterisering af bakterielle virulensfaktorer og værten signalveje, der er målrettet under infektioner udgør en reel udfordring. Det kræver udvikling af nye metoder til storstilet identifikation af centrale vært / patogen interaktion hubs. Den nylige udvikling af innovative, high-throughput og høj-indhold screeningsteknikker repræsenterer en uvurderlig ressource, der kan tilpasses til studiet af intracellulære bakterielle patogener 15. Her har vi brugt den zoonotiske bakterielt patogen Coxiella burnetii som model til at udvikle screening tilgange, der kombinerer transposon mutagenese og fluorescens assays. Importantly, denne screeningsmetode muliggør samtidig overvågning af flere trin i Coxiella intracellulære cyklus, hvilket giver et samlet overblik over strategier udviklet af denne bakterie til at invadere, replikere og persistere i inficerede celler.
Den her beskrevne fremgangsmåde er baseret på to veletablerede teknikker, transposon mutagenese og fluorescens-baserede assays, som er blevet anvendt med succes til studiet af bakterielle patogener. Kombinere disse teknikker i forbindelse med high-throughput / high-content skærme giver os mulighed for at vurdere virkningerne af et stort antal bakterielle mutationer ved at analysere et meget stort antal af hændelser (typisk 15.000 inficerede celler pr bakterielle mutationer afbildes og analyseres). Dette giver et vigtigt statistisk analyse af begivenheder, såsom bakteriel invasion af værtsceller og intracellulær replikation, som i sagens natur underlagt høj variabilitet. Det er vigtigt at bemærke, at celle bortset ep linjerithelial kan anvendes til denne type screening. Imidlertid flade og store epitelceller er optimale til billedanalyse som vært celleorganeller er lettere at afsløre. Fordi størstedelen af automatiserede mikroskoper automatisk kan håndtere et stort antal plader, der er næsten ingen grænser for antallet af mutanter, der kan screenes samtidigt. Afhængig af patogenet, kan brugeren privilegium anvendelsen af et epifluorescens eller et konfokalt mikroskop. Tidspunktet for billedregistrering vil mest afhænge af følsomheden af mikroskopet kamera, om antallet af felter, der er erhvervet pr brønd og af antallet af kanaler, der er erhvervet pr synsfelt. Brugeren kan beslutte, hvordan man justere disse faktorer for at optimere screeningsprotokol. Som et eksempel, vi afbildes en plade med 96 brønde / time ved anvendelse af betingelserne angivet i punkt 5.1. Billedanalyse afhænger i høj grad på maskinen (eller klynge af maskiner), der anvendes. Vi bruger en 12-kerne (2 x 3,06 GHz 6-Core), 48 GB RAM arbejdsstation. Denne maskine kræver indbyrdesende 40 min at analysere billeder erhvervet fra én plade.
Et vigtigt aspekt, der skal tages i betragtning ved udviklingen af disse assays er etableringen af nye (eller optimering af eksisterende) protokoller for at tillade manipulation og bearbejdning af et stort antal prøver. Et typisk eksempel er udviklingen af den enkelt primer koloni-PCR tilgang, hvilket tillod os til hurtigt at amplificere og sekvens Coxiella DNA-fragmenter indeholdende insertionsstedet af hvert transposon, fra meget små prøver. Baseret på vores erfaring, high-fidelity-polymerase skal nøje udvalgt og testet for at opnå reproducerbare resultater. Den eneste begrænsning af denne fremgangsmåde kan gemme sig i den iagttagelse, at i de fleste tilfælde, ca. 30% af de behandlede prøver ikke udnyttes, enten som følge af PCR eller sekventering trin. Men i betragtning af at isolering af nye Coxiella transposonsekvenser mutanter er ikke en hastighedsbegrænsende trin, dette ikke repræsensendt et stort problem. Ligeledes har udviklingen af en pålidelig analyse for at kvantificere den bakterielle koncentration af mutante bestande været nøglen for denne fremgangsmåde. På grund af tendensen til, Coxiella til at aggregere, når i suspension, anvendelse af absorbansaflæsningerne gælder ikke for beregning af koncentrationen af Coxiella kulturer og den eneste eksisterende alternativ var kvantitativ PCR (qPCR). Her er anvendelsen af en fluorescens-mærkede DNA interkalationsmiddel signifikant fremskyndet bakterier kvantificering.
Denne fremgangsmåde kan også drage fordel af anvendelsen af stabile cellelinjer, der udtrykker fluorescerende markører for adskillige intracellulære rum afhængigt af patogenet anvendes. Et andet vigtigt aspekt er anvendelsen af celledyrkningsmedier blottet for phenolrødt. Vi observerede, at denne pH-indikator har en naturlig fluorescens spænder over røde og grønne spektrum, mætter signalet optaget på automatiseret fluorescens-læser.
THan strategi præsenteres her bygger på tilfældige transposon mutagenese. For mutanter af interesse, anbefaler vi validere unikke gennemførelser (og klonalitet) ved hjælp af Southern blot og PCR-amplifikationer af transposon insertion site.
Udover det udstyr, der er beskrevet i protokollen afsnittet teams interesseret i at bruge screening metode præsenteres her, vil tage stor fordel i opsætningen af en relationel database for indsamling af data, en server til lagring af data og en arbejdsstation til hurtig billedanalyse.
Vigtigt er det, hvilken fremgangsmåde er beskrevet her er egnet til undersøgelse af andre intracellulære bakterielle patogener tilvejebragt en tilfældig mutagenese metode findes for patogenet, kan cellelinier blive inficeret af patogenet, og dette viser en specifik fænotype under infektion.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by an Avenir/ATIP grant to Matteo Bonazzi and a Marie Curie CIG (N° 293731) to Eric Martinez. The authors would like to thank Dr. Robert Heinzen for sharing C. burnetii strains, antibodies and tools, Virginie Georget and Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) for their technical assistance and data analysis.
Citric acid | Sigma | C0759-500G | ACCM-2 medium component |
Sodium citrate | Sigma | S4641-500G | ACCM-2 medium component |
Potassium phosphate | Sigma | 60218-100G | ACCM-2 medium component |
Magnesium chloride | Sigma | M2670-100G | ACCM-2 medium component |
Calcium chloride | Sigma | C5080-500G | ACCM-2 medium component |
Iron sulfate | Sigma | F8633-250G | ACCM-2 medium component |
Sodium chloride | Sigma | S9625-500G | ACCM-2 medium component |
L-cysteine | Sigma | C6852-25G | ACCM-2 medium component |
Bacto Neopeptone | BD (Beckton-Dickinson) | 211681 | ACCM-2 medium component |
Casamino acids | BD (Beckton-Dickinson) | 223050 | ACCM-2 medium component |
Methyl-B-Cyclodextrin | Sigma | C4555-10G | ACCM-2 medium component |
RPMI w/glutamax | Gibco | 61870-010 | ACCM-2 medium component |
RPMI w/glutamax, without phenol red | Gibco | 32404-014 | For cell culture and infection |
Fetal Bovine Serum | GE healthcare | SH30071 | For cell culture |
Trypsin EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | For cell culture |
Saponin | Sigma | 47036 | For immunofluorescence staining |
Ammonium chloride | Sigma | A9434 | For immunofluorescence staining |
Bovine Serum Albumine | Sigma | A2153 | For immunofluorescence staining |
Electroporation cuvette 0.1 cm | Eurogentec | ce0001-50 | For Coxiella transformation |
Trackmates screw top tubes with caps | Thermo Scientific | 3741 | 2D barcoded screwcap |
96-well microplate with black walls and bottom | Greiner | 655076 | Flat dark bottom, for dsDNA quantitation |
96-well microplate, ��clear, black walls | Greiner | 655090 | Flat transparent bottom, for cell culture and imaging |
96-well PCR microplate | Biorad | 2239441 | DNAse/RNAse free |
96-well plate, Deepwell | Labcon | 949481 | For Coxiella mutants infections |
PicoGreen | Life Technologies | P7581 | For dsDNA quantitation |
Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | For dsDNA quantitation |
Phusion High fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | For single primer colony PCR |
Celltracker Red CMTPX | Life Technologies | C34552 | For imaging |
Anti-LAMP1 antibody | Sigma | 94403-1ML | For immunofluorescence staining |
Hoechst 33258 | Sigma | L1418 | For imaging |
Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro | Tecan | ||
Epifluorescence automated microscope Cellomics | Thermo Scientific |