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Immunology and Infection

जनरेशन और मल्टी-प्ररूपी उच्च सामग्री स्क्रीनिंग doi: 10.3791/52851 Published: May 13, 2015

Summary

Coxiella burnetii जूनोटिक बीमारी क्यू बुखार के लिए जिम्मेदार एक लाचार इंट्रासेल्युलर ग्राम नकारात्मक जीवाणु है। यहाँ हम Coxiella फ्लोरोसेंट transposon म्यूटेंट की पीढ़ी के रूप में अच्छी तरह से स्वचालित पहचान और जिसके परिणामस्वरूप internalization, प्रतिकृति और साइटोटोक्सिक phenotypes के विश्लेषण के लिए विधियों का वर्णन।

Abstract

आक्रमण और बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के मेजबान कोशिकाओं के उपनिवेशन नाश और चाबी मेजबान कार्यों में हेरफेर कर सकते हैं जो विषैलापन कारकों के रूप में परिभाषित प्रोकार्योटिक प्रोटीन की एक बड़ी संख्या है, की गतिविधि पर निर्भर करते हैं। मेजबान / रोगज़नक़ बातचीत के अध्ययन के जीवाणु संक्रमण को समझते हैं और संक्रामक रोगों का मुकाबला करने के लिए वैकल्पिक रणनीति विकसित करने के लिए इसलिए बेहद जरूरी है। यह दृष्टिकोण हालांकि, बैक्टीरियल विषैलापन निर्धारकों की निष्पक्ष, स्वचालित पहचान और लक्षण वर्णन के लिए नए उच्च throughput assays के विकास की आवश्यकता है। यहाँ, हम transposon उत्परिवर्तजनन द्वारा एक GFP टैग उत्परिवर्ती पुस्तकालय की पीढ़ी के लिए एक विधि का वर्णन है और उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के विकास के कई transposon जुड़े phenotypes की एक साथ पहचान के लिए दृष्टिकोण। हमारा काम मॉडल एसई के साथ जुड़ा हुआ है जो इंट्रासेल्युलर बैक्टीरियल रोगज़नक़ Coxiella burnetii, पशुजन्य रोग क्यू बुखार की etiological एजेंट है,वेरे एक फलस्वरूप स्वास्थ्य और आर्थिक बोझ के साथ प्रकोप। इस रोगज़नक़ के लाचार इंट्रासेल्युलर प्रकृति, हाल ही में जब तक, गंभीर रूप से Coxiella के उच्च throughput / उच्च सामग्री दृष्टिकोणों के कार्यान्वयन के लिए आदर्श मॉडल है, जिससे मेजबान रोगज़नक़ बातचीत में शामिल बैक्टीरियल कारकों की पहचान बाधा उत्पन्न की है।

Introduction

इमर्जिंग, स्थानिक जीवाणु Coxiella burnetii क्यू बुखार, गंभीर स्वास्थ्य और आर्थिक प्रभाव 1 के साथ एक दुर्बल फ्लू जैसे पशुजन्य रोग की बड़ी फैलने के लिए जिम्मेदार है। Coxiella के मुख्य जलाशयों घरेलू और खेत जानवरों रहे हैं, और यह अमेरिका में डेयरी पशु के 90% से अधिक सी है कि ले जाने का अनुमान है 2 burnetii। मनुष्य दूषित एरोसोल की साँस लेना द्वारा संक्रमित हैं कि आकस्मिक मेजबान हैं। मानव क्यू बुखार से प्रकट होता है, या तो 65% 1,3 तक पहुँचने मृत्यु दर के साथ घातक जटिलताएं हो सकती है जो एक तीव्र या पुरानी बीमारी, के रूप में। 1 के एक संक्रामक खुराक के साथ - 10 जीवों, Coxiella जाना जाता है सबसे अधिक संक्रामक रोगजनक है और यह एक संभावित जैव हथियार के रूप में 4 जांच की गई है। नीदरलैंड (2007 - 2010) में क्यू बुखार की हाल ही में विस्फोटक प्रकोप मामलों में प्रति वर्ष 2,000 से अधिक करने के लिए 182 से बढ़ते के साथ, इस रोगज़नक़ के गंभीर डाह का एक उदाहरण के रूप में खड़ा है5।

Coxiella संक्रमण की उल्लेखनीय दक्षता संभावना कोशिकाओं की मेजबानी के लिए अपनी अनूठी अनुकूलन के साथ संयुक्त पर्यावरण के तनाव के लिए अपने प्रतिरोध के साथ जुड़ा हुआ है। दरअसल, Coxiella कई कठोर परिस्थितियों (सुखाना, तापमान, आदि) के लिए उल्लेखनीय प्रतिरोधी रहे हैं, जो पाचन निष्क्रिय छोटे सेल वेरिएंट (SCV), के रूप में वातावरण में मौजूद है। गैर phagocytic कोशिकाओं के आक्रमण Coxiella आसंजन / आक्रमण OMPA 7 और एक अभी तक अज्ञात रिसेप्टर द्वारा मध्यस्थता है, जबकि SCVs ऊपर से 3 integrins 6 β α वी के माध्यम से phagocytic कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है। तेज के बाद, Coxiella Rab5 और EEA1 8 जल्दी endosomal मार्करों के लिए सकारात्मक चुस्त रिक्तिकाएं, में रहता है। जीवाणु एक डॉट / आईसीएम प्रकार 4 स्राव सिस्टम (T4SS) 9 पाचन सक्रिय बड़े सेल वेरिएंट (एलसीवी) को परिवर्तित करने और सक्रिय द्वारा endosomal अम्लीकरण का जवाब, लीजोनेला pneumophila 10 की है कि अत्यधिक मुताबिक़। डॉट / आईसीएम प्रभावोत्पादक का स्राव Coxiella बैक्टीरिया पनपे और सक्रिय रूप से एपोप्टोसिस 11 से संक्रमित कोशिकाओं की रक्षा कर सकते हैं जहां सक्रिय लाइसोसोमल एंजाइमों युक्त एक बड़े, LAMP1 पॉजिटिव अम्लीय डिब्बे उत्पन्न करने के लिए अनुमति देते हैं। इसलिए, Coxiella के intracellular चक्र बैक्टीरियल प्रभावोत्पादक 12 के डॉट / आईसीएम की मध्यस्थता स्थानान्तरण द्वारा नियंत्रित किया जाता है, हालांकि, मेजबान सेल आक्रमण, बैक्टीरियल प्रतिकृति है और संक्रमण के प्रसार में शामिल माइक्रोबियल कारकों काफी हद तक अनजान रहते हैं।

मेजबान कोशिकाओं के भीतर 1) internalization, 2) इंट्रासेल्युलर प्रतिकृति, 3) सेल के लिए सेल प्रसार: transposon उत्परिवर्तजनन और प्रतिदीप्ति आधारित assays के संयोजन, हम Coxiella संक्रमण के मुख्य चरण में शामिल बैक्टीरियल कारकों का एक साथ पहचान के लिए निष्पक्ष दृष्टिकोण विकसित कर रहे हैं , और 4) हठ। तिथि करने के लिए, हम 1,000 मीटर से अधिक जांच की हैCoxiella रोगजनन 7 को नियंत्रित करने वाले मेजबान रोगज़नक़ बातचीत में अभूतपूर्व अंतर्दृष्टि के साथ हमें प्रदान की है जो 500 Coxiella कोडिंग दृश्यों में utations। ध्यान से, इस दृष्टिकोण Coxiella साथ कोशिका जीव विज्ञान सुविधाओं का हिस्सा है कि अन्य इंट्रासेल्युलर रोगजनकों के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है।

Protocol

GFP टैग Coxiella transposon म्यूटेंट के एक पुस्तकालय की 1. पीढ़ी

स्थानीय नियमों के अनुपालन में एक माइक्रोबियल सुरक्षा कैबिनेट (एमएससी) में एक जैव सुरक्षा रोकथाम स्तर 2 (बीएसएल -2) में Coxiella burnetii RSA439 NMII हेरफेर। इस्तेमाल किया बैक्टीरियल मॉडल के साथ संगत है, 1.4.1 से 1.4.4 के लिए चरणों को दोहराएँ प्रतिरूप म्यूटेंट प्राप्त करने की संभावना को बढ़ाने के लिए। एक ठेठ उत्परिवर्ती पुस्तकालय बना है (कम से कम) का इस्तेमाल किया जीव के जीनोम में एनोटेट दृश्यों कोडिंग का तीन गुना संख्या के बराबर है कि म्यूटेंट के एक नंबर की।

  1. Electrocompetent Coxiella RSA439 NMII की तैयारी:
    1. 13.4 मिमी साइट्रिक एसिड, 16.1 मिमी सोडियम साइट्रेट, 3.67 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट, 1 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड, 0.02 मिमी कैल्शियम क्लोराइड, 0.01 मिमी लोहा सल्फेट, 125.4 मिमी सोडियम क्लोराइड, 1.5 मिमी एल सिस्टीन, 0.1 जी: 1x ACCM-2 13 की तैयारी / एल Bacto Neopeptone, 2.5 ग्राम / एल casamino एसिड, 1 ग्राम / एल मिथाइल बीटा cyclodextrin, 125 मिलीग्राम / एल RPMI। 4.75 और फिल्टर बाँझ (आटोक्लेव नहीं है) पीएच को समायोजित करें। नोट: तरल ACCM-2 लगभग 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है।
    2. -80 डिग्री सेल्सियस शेयरों से (पहले उत्पन्न होता है और 1.5 कदम के रूप में मात्रा निर्धारित एक जीवाणु स्टॉक से) 2 एक्स 10 6 जीनोम समकक्ष (जीई) Coxiella RSA439 NMII की / मिलीलीटर के साथ ACCM-2 की 100 मिलीलीटर टीका लगाना और 75 में जीवाणु निलंबन वितरित (- फ्लास्क प्रति जीवाणु निलंबन के 15 मिलीलीटर 10) निकाल टोपी के साथ 2 सेमी सेल संस्कृति बोतल। 5% सीओ 2 और 2.5% 2 हे की एक humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 7 दिनों के लिए आगे बढ़ें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 3,900 XG पर जिसके परिणामस्वरूप बैक्टीरियल 50 मिलीलीटर ट्यूब में निलंबन और सेंट्रीफ्यूज पूल।
    4. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 10% ग्लिसरॉल के 30 मिलीलीटर में गोली resuspend। 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 3,900 XG पर अपकेंद्रित्र।
    5. 10% ग्लिसरॉल (आम तौर पर 2 मिलीलीटर) और विभाज्य 500 μl ट्यूबों में 50 μl की पर्याप्त मात्रा में गोली resuspend। Resuspended बी रखेंपूरी प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर acteria। नोट: इस स्तर पर, बैक्टीरिया electrocompetent कर रहे हैं और एक विभाज्य एक electroporation के प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त है। बैक्टीरियल निलंबन 6 महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है या सीधे प्लास्मिड डीएनए की electroporation के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  2. Transposon- और transposase एन्कोडिंग plasmids के साथ सक्षम Coxiella के electroporation:
    नोट: निम्न प्रोटोकॉल के लिए, transposable तत्व और transposase (क्रमशः, pITR-कैट-GFP और pUC19-Himar1C9) दो अलग अलग प्लास्मिड द्वारा इनकोडिंग हैं 7। Coxiella में electroporated जब दोनों प्लास्मिड उन्हें आत्महत्या प्लास्मिड बना रही है, एक Coxiella-विशिष्ट प्रतिकृति मूल की कमी है। यह स्थिर transposon सम्मिलन सुनिश्चित करता है। transposable तत्व चयन के लिए Coxiella प्रमोटर p1169 और GFP के साथ उत्पन्न म्यूटेंट टैग करने के लिए Coxiella प्रमोटर p311 के नियमन के तहत GFP जीन के नियमन के तहत एक chloramphenicol प्रतिरोध कैसेट शामिल हैं।
    1. जनसंपर्कबर्फ पर 10 मिनट के लिए एक 0.1 सेमी electroporation क्युवेट ई-शांत करते हैं। 50 10 माइक्रोग्राम transposon प्लाज्मिड के साथ electrocompetent Coxiella के μl और transposase प्लाज्मिड 7 में से 10 माइक्रोग्राम से मिलाएं। कि प्लाज्मिड एकाग्रता ग्लिसरॉल के कमजोर पड़ने कम करने के लिए अधिक से अधिक 500 माइक्रोग्राम / एमएल है सुनिश्चित करें।
    2. निम्नलिखित स्थापना का उपयोग Electroporate: 18 केवी, 500 Ω, 25 μF। जिसके परिणामस्वरूप समय लगातार 9 और 13 मिसे के बीच शामिल है सुनिश्चित करें।
    3. इसके तत्काल बाद, RPMI के 950 μl जोड़ने electroporated बैक्टीरिया resuspend और एक पेंच टोपी ट्यूब को हस्तांतरण और कमरे के तापमान पर रखने के लिए।
    4. Electroporated बैक्टीरिया के 200 μl ले लो और 6 अच्छी तरह प्लेटों में 1% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक ACCM-2 के 3 मिलीलीटर जोड़ें। Electroporated जीवाणुओं की शेष मात्रा करने के लिए DMSO के 88 μl जोड़ें -80 डिग्री सेल्सियस और दुकान (10% DMSO के अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए)।
  3. Transposon म्यूटेंट का चयन:
    1. Incubaते 5% सीओ 2 और 2.5% 2 हे की एक humidified माहौल में रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस (1.2.4) के ऊपर वर्णित के रूप में टीका 6 अच्छी तरह प्लेटें। उचित एंटीबायोटिक दवाओं जोड़ें (375 माइक्रोग्राम / एमएल केनामाइसिन या 3 माइक्रोग्राम / एमएल chloramphenicol)। ऊपर वर्णित परिस्थितियों में 3 अतिरिक्त दिनों के लिए जीवाणु संस्कृति सेते हैं।
  4. व्यक्तिगत म्यूटेंट के अलगाव:
    1. Coxiella transposon म्यूटेंट के ठोस ACCM-2 प्लेटों की तैयारी और चढ़ाना
      नोट: निम्न निर्देश 1 पेट्री डिश के लिए, बैक्टीरियल संस्कृतियों के कई dilutions कॉलोनी अलगाव के लिए इष्टतम टीका मात्रा का आकलन करने के लिए परीक्षण किया जाना है कर रहे हैं।
      1. एक माइक्रोवेव में agarose 10.5 मिलीलीटर 0.5% की गर्मी और एक 55 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में इसे ठंडा। 37 डिग्री सेल्सियस (पीएच 4.75) 2x ACCM -2 के 11.25 मिलीलीटर हीट।
      2. नीचे agarose तैयार:
        1. उचित एंटीबायोटिक दवाओं के agarose 2x ACCM-2 के 10 एमएल के साथ पिघल 0.5% की 10 मिलीलीटर मिक्स और जोड़ (375 माइक्रोग्राम / एमएल केनामाइसिन या 3माइक्रोग्राम / एमएल chloramphenicol)।
        2. पेट्री डिश में तुरंत डालो। 30 मिनट और हवा शुष्क 20 मिनट के लिए के लिए मध्यम शांत करते हैं, पेट्री डिश unlidded रखें।
      3. शीर्ष agarose तैयार:
        1. उचित एंटीबायोटिक दवाओं (375 माइक्रोग्राम / एमएल केनामाइसिन या 3 माइक्रोग्राम / एमएल chloramphenicol) जोड़ने के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, एक 5 मिलीलीटर polystyrene ट्यूब में पानी की 0.75 मिलीलीटर के साथ 2x ACCM-2 के 1.25 मिलीलीटर मिलाएं।
        2. 5 सेकंड के लिए जीवाणु संस्कृति (आम तौर पर 1 μl 100) और भंवर जोड़ें।
        3. , पिघल agarose के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें मिश्रण और तुरंत नीचे agarose पर डालना।
        4. 20 मिनट के agarose दृढ़ीभवन की सुविधा के लिए के लिए, 20 मिनट के लिए शांत पेट्री डिश पर ढक्कन की जगह है और 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते दें।
        5. एक एमएससी में unlidded 20 मिनट के लिए शुष्क हवा। 6 से 7 दिनों के लिए 5% सीओ 2 और 2.5% 2 हे की एक humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों के लिए आगे बढ़ें।
    2. शेष बैक्टीरिया को DMSO के जोड़ेंआदेश में एल संस्कृतियों -80 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम 10% DMSO के एकाग्रता और दुकान तक पहुँचने के लिए।
    3. इस प्रकार के रूप इष्टतम कमजोर पड़ने का आकलन करें: कालोनियों व्यास में 0.5 से 1 मिमी हैं और ठीक से पार संक्रमण से बचने के लिए अलग कर रहे हैं कि सुनिश्चित करते हैं। 1.4.1.2 और 1.4.1.3 में वर्णित के रूप में ACCM -2 अगर पर उपयुक्त कमजोर पड़ने पर बिंदु 1.4.2 और थाली से बैक्टीरियल संस्कृतियों शेष गला लें। 1.4.1.3.5 में वर्णित के रूप में 6 से 7 दिनों के लिए सेते हैं।
    4. कालोनियों detectable हैं एक बार, एक 1 मिलीलीटर टिप के अंत काटने प्लग उठा अलग कालोनियों युक्त और ACCM-2 की 1.5 एमएल उचित एंटीबायोटिक दवाओं युक्त (375 माइक्रोग्राम में pipetting द्वारा कॉलोनी dispersing द्वारा उन्हें इकट्ठा / एमएल केनामाइसिन या 3 माइक्रोग्राम / 24 अच्छी तरह से थाली में एमएल chloramphenicol)। 1.3.1 में वर्णित शर्तों में 6 दिनों के लिए अलग-अलग कालोनियों बढ़ाना। ऊष्मायन के 3 दिन, प्रत्येक संस्कृति pipetting द्वारा बैक्टीरियल clumps को फैलाने के।
    5. 10 में 96 अच्छी तरह से प्लेट में 2 डी बारकोड वाले screwcap ट्यूबों में प्रत्येक उत्परिवर्ती निलंबन स्टोर-80 डिग्री सेल्सियस% DMSO के।
  5. बैक्टीरियल एकाग्रता का मूल्यांकन:
    नोट: निम्न प्रोटोकॉल axenic माध्यम में नकल बैक्टीरियल म्यूटेंट (1.4.4 देखें) का विकास घटता प्राप्त करने के लिए लागू किया जा सकता है।
    1. मानक वक्र की तैयारी:
      1. DsDNA के एक 2 माइक्रोग्राम / एमएल शेयर समाधान 1x Tris EDTA (ते) में (ज्ञात आकार और एकाग्रता का आम तौर पर एक यादृच्छिक प्लाज्मिड) तैयार करें। 2 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर से 2 एनजी / एमएल से लेकर सांद्रता प्राप्त करने के लिए शेयर समाधान से 10 गुना धारावाहिक dilutions तैयार करें। काली दीवारों और नीचे के साथ एक 96 अच्छी तरह से microplate के एकल वेल्स को प्रत्येक एकाग्रता के 50 μl बांटना (सामग्री की तालिका देखें)।
      2. 1x ते बफर में 200 और 96 अच्छी तरह से microplate में प्रत्येक नमूने के लिए पतला अभिकर्मक के 55 μl जोड़ें: dsDNA quantitation के अभिकर्मक 1 पतला। अच्छी तरह मिक्स एक थाली प्रकार के बरतन का उपयोग करने और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 2 मिनट से 5 के लिए सेते हैं।
      3. एक प्रतिदीप्ति का उपयोग कर नमूने प्रतिदीप्ति उपायमानक fluorescein तरंग दैर्ध्य (उत्तेजना ~ 480 एनएम, उत्सर्जन ~ 520 एनएम) के लिए nce के microplate रीडर और फिल्टर।
      4. प्रतिदीप्ति तीव्रता रीडिंग के खिलाफ प्लाज्मिड एकाग्रता रेंज प्लॉट।
    2. जीवाणु निलंबन quantitation:
      1. काली दीवारों और नीचे के साथ एक 96 अच्छी तरह से microplate में 10% ट्राइटन X-100 प्रति अच्छी तरह के 5 μl बांटना (सामग्री की तालिका देखें)। एक थाली प्रकार के बरतन पर, प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए जीवाणु निलंबन के 50 μl जोड़ें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
      2. 1x ते बफर में 200 और 96 अच्छी तरह से microplate में प्रत्येक नमूने के लिए पतला अभिकर्मक के 55 μl जोड़ें: dsDNA quantitation के अभिकर्मक 1 पतला। अच्छी तरह मिक्स एक थाली प्रकार के बरतन का उपयोग करने और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 2 मिनट से 5 के लिए सेते हैं।
      3. मानक fluorescein तरंग दैर्ध्य (उत्तेजना ~ 480 एनएम, उत्सर्जन ~ 520 एनएम) के लिए एक प्रतिदीप्ति microplate रीडर और फिल्टर का उपयोग कर नमूने प्रतिदीप्ति उपाय।
      4. बैक्टीरियल डी.एन. प्राप्त करने के लिएएक एकाग्रता, बिंदु 1.5.1.4 पर प्राप्त चार्ट में प्रतिदीप्ति रीडिंग साजिश है। बैक्टीरियल सांद्रता प्राप्त करने के लिए Coxiella जीनोम (2.2 FG) के द्रव्यमान से डीएनए एकाग्रता फूट डालो। जीनोम समतुल्य / एमएल में परिणाम व्यक्त करें।
      5. ACCM-2 में एक महत्वपूर्ण वृद्धि दोष का प्रदर्शन त्यागें म्यूटेंट।

2. एकल प्राइमर कॉलोनी पीसीआर, अनुक्रमण, और एनोटेशन

नोट: निम्न प्रोटोकॉल 96 नमूनों की डीएनए प्रवर्धन के लिए है, एक multichannel विंदुक निम्न चरणों के लिए सिफारिश की है। एक transposon-विशिष्ट प्राइमर (2.3) के साथ चुंबकीय माला और डीएनए अनुक्रमण का उपयोग करते हुए पीसीआर उत्पादों के स्तंभ शुद्धि एक बाहरी कंपनी को subcontracted कर रहे हैं।

  1. प्रवर्धन प्राइमर Coxiell पर transposon प्रविष्टि साइट को कवर पीसीआर उत्पादों को प्राप्त करने के लिए उल्टे मिलकर दोहराने (आईटीआर), के ऊपर 100 और 200 आधार जोड़े के बीच संकरण के क्रम में बनाया गया है कि यह सुनिश्चित करेंएक जीनोम। 3 पीसीआर मिश्रण का मिलीलीटर (1x उच्च निष्ठा बफर, 200 माइक्रोन dNTPs, 1 माइक्रोन प्रवर्धन प्राइमर, 20 यू / एमएल उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़) तैयार करें और बर्फ पर सेट एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली में अच्छी तरह से प्रति 29 μl बांटना। स्थानांतरण पीसीआर मिश्रण करने के लिए ACCM -2 में स्थिर चरण में प्रत्येक उत्परिवर्ती के 1 μl।
  2. प्रारंभिक विकृतीकरण के साथ चलाने पीसीआर (98 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट), 20 उच्च तंगी चक्र (98 डिग्री सेल्सियस, 10 सेकंड, 50 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड, 72 डिग्री सेल्सियस, 90 सेकंड), 30 कम तंगी चक्र (98 डिग्री सेल्सियस, 10 सेकंड, 30 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड, 72 डिग्री सेल्सियस, 90 सेकंड) और 30 उच्च तंगी चक्र (10sec 98 डिग्री सेल्सियस, 50 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड, 72 डिग्री सेल्सियस, 90 सेकंड) 72 पर एक अंतिम विस्तार के द्वारा पीछा किया 7 मिनट के लिए सी °।
  3. एक transposon-विशिष्ट प्राइमर के साथ चुंबकीय माला और अनुक्रम डीएनए का उपयोग पीसीआर उत्पादों शुद्ध। 50 डिग्री सेल्सियस और 75 डिग्री सेल्सियस, 40% और 60% के बीच एक जीसी सामग्री, 18 और 25 न्यूक्लियोटाइड और एक annealing एसआई के बीच एक लंबाई के बीच शामिल एक भविष्यवाणी पिघलने के तापमान के साथ transposon-विशिष्ट प्रथम डिजाइनtransposon आईटीआर के पहले आधार जोड़ी के अपस्ट्रीम ते प्रवर्धन प्राइमर संकरण साइट के बहाव और कम से कम 100 आधार जोड़े।
  4. अनुक्रम विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग, Coxiella burnetii 493 NMI का पूरा, एनोटेट जीनोम लोड। लोड और (blastn) अनुक्रमण परिणाम संरेखित करें और स्थानांतरण के स्थल निर्धारित करने के लिए "संरेखित संदर्भ के लिए" समारोह का उपयोग करें। गैर-मेल और / या डबल reads.To उत्परिवर्ती पुस्तकालय की संतृप्ति की निगरानी प्रदर्शित करने के साथ म्यूटेंट त्यागने के लिए, एक ही स्थल पर कई transposon सम्मिलन की घटना का एक रिकॉर्ड रखें।

3. कोशिकाओं Coxiella म्यूटेंट और intracellular विकास की निगरानी के साथ चुनौती

नोट: एक multichannel विंदुक निम्न चरणों के लिए सिफारिश की है। संक्रमण काले दीवारों और फ्लैट पारदर्शी नीचे के साथ microplates बाँझ 96 अच्छी तरह से में triplicates में प्रदर्शन किया गया। डब्ल्यू GFP के 14 व्यक्त WT Coxiella burnetiiडॉ रॉबर्ट Heinzen द्वारा प्रदान की गई है।

  1. एंटीबायोटिक दवाओं के अभाव में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक फिनोल लाल (RPMI मीडिया पूर्ण) के बिना RPMI में वेरो कोशिकाओं को विकसित।
  2. संक्रमण से पहले दिन, पीबीएस के 10 एमएल के साथ मिला हुआ या उप मिला हुआ सेल संस्कृति कुप्पी से वेरो कोशिकाओं को धोने।
  3. सेल संस्कृति फ्लास्क trypsin EDTA के समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़कर वेरो कोशिकाओं को अलग और 5% सीओ 2 के एक humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट से 5 के लिए सेते हैं।
  4. पूरा RPMI मीडिया के 10 मिलीलीटर में Resuspend कोशिकाओं। कोशिकाओं की गणना और एमएल प्रति 10 5 कोशिकाओं के एक सेल निलंबन तैयार करते हैं।
  5. फ्लैट पारदर्शी नीचे के साथ एक काले रंग की 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के 100 μl बांटना।
  6. आरटी पर 400 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र कुओं के तल पर कोशिका आसंजन को सुविधाजनक बनाने और 5% सीओ 2 के एक humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
  7. सह युक्त 96 अच्छी तरह प्लेटें पिघलनाआरटी पर xiella म्यूटेंट और एक गहरी अच्छी तरह से 96 अच्छी तरह से थाली में फिनोल लाल और FBS बिना RPMI के 300 μl में जीवाणु निलंबन के 150 μl पतला।
  8. वेरो कोशिकाओं से युक्त microplate से मीडिया निकालें और 100 μl / अच्छी तरह से पतला Coxiella म्यूटेंट (100 के MOI), बांटना। सकारात्मक नियंत्रण (WT Coxiella 100 और 200 के संक्रमण (MOI) के multiplicities में GFP के 14 व्यक्त करने से संक्रमित कोशिकाओं) के रूप में (गैर संक्रमित कोशिकाओं) नियंत्रण और कुओं A2 और A3 नकारात्मक रूप में अच्छी तरह से A1 का प्रयोग करें।
  9. एक एयरोसोल तंग सेंट्रीफ्यूज थाली धारक का उपयोग कर आरटी पर 400 XG पर 10 मिनट के लिए थाली अपकेंद्रित्र।
  10. तो 100 μl / अच्छी तरह से ताजा, पूरा RPMI मध्यम के साथ मध्यम बैक्टीरिया युक्त की जगह 2 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के एक humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  11. मानक fluorescein तरंग दैर्ध्य (उत्तेजना ~ 480 एनएम, उत्सर्जन ~ 520 एनएम) के लिए एक प्रतिदीप्ति microplate रीडर और फिल्टर का उपयोग कर 7 दिनों के लिए GFP प्रतिदीप्ति हर रोज उपाय। बचने के लिएहस्तक्षेप संस्कृति के माध्यम में संघनन और संकेत फैलाव के लिए, microplate रीडर पर नीचे उत्तेजना और उत्सर्जन रिकॉर्डिंग का उपयोग के कारण।

स्वचालित छवि अधिग्रहण के लिए नमूने के 4. तैयारी

, प्रक्रिया एक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए है तदनुसार संस्करणों के ऊपर स्केल: ध्यान दें। 4.2 से कदम एक थाली वॉशर का लाभ उठा सकते हैं।

  1. 7 वें दिन के बाद संक्रमण पर, थाली से मध्यम हटाने और आम तौर पर 1 उपयुक्त कमजोर पड़ने (कम एक सेल पारगम्य फ्लोरोसेंट रंजक युक्त / अच्छी तरह से ताजा, पूरा माध्यम के 50 μl के साथ बदलें: इस्तेमाल किया सेल लाइन के अनुसार अनुकूलित किया जाना, 1000 )। 5% सीओ 2 के एक humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट - 30 के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
  2. फिर पीएफए ​​युक्त बफर निकालें और पीबीएस के साथ 3 बार धोने के कमरे के तापमान (आर टी) पर 30 मिनट के लिए सेते हैं, अच्छी तरह / 4% paraformaldehyde के 50 μl पीबीएस में (पीएफए) के साथ मध्यम बदलें।
  3. पीबीएस और dispens निकालेंई 50 μl / अच्छी तरह से 0.05% सैपोनिन के साथ पूरक समाधान (0.5% गोजातीय सीरम albumin, पीबीएस में 50 मिमी एनएच 4 सीएल, 7.4 पीएच) अवरुद्ध की। 30 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
  4. 500 कमजोर पड़ने: 40 μl / अच्छी तरह से (ऊपर) के रूप में सैपोनिन के साथ पूरक ताजा अवरुद्ध समाधान के साथ और एक 1 पर एक विरोधी LAMP1 एंटीबॉडी के साथ अवरुद्ध समाधान बदलें। आरटी पर 30 मिनट के लिए थाली सेते हैं।
  5. अवरुद्ध समाधान निकालें और 100 μl / पीबीएस के साथ अच्छी तरह से 96 अच्छी तरह से थाली में 5 बार धो लें।
  6. बांटना 40 / अच्छी तरह से (1 के एक कमजोर पड़ने पर: 1,000) (ऊपर) के रूप में सैपोनिन के साथ पूरक समाधान, उचित fluorescently लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी अवरुद्ध की μl कदम 4.4 पर लागू विरोधी LAMP1 एंटीबॉडी प्रकट करने के लिए, और 5 माइक्रोग्राम पर Hoechst के 33,258 से / मिली। आरटी पर 30 मिनट के लिए थाली सेते हैं।
  7. अवरुद्ध समाधान निकालें और 100 μl / पीबीएस के साथ अच्छी तरह से 96 अच्छी तरह से थाली में 5 बार धो लें। तय कोशिकाओं के बाहर सूखी नहीं होना चाहिए, के रूप में 96 अच्छी तरह से थाली में पिछले धोने के लिए इसी पीबीएस की मात्रा छोड़ दें।
  8. छवि बाद के विश्लेषण के लिए प्रकाश से रक्षा 4 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत थाली या दुकान प्लेट,।

5. छवि अधिग्रहण

  1. एक epifluorescence स्वचालित माइक्रोस्कोप का उपयोग 33258 (350 एनएम, मेजबान सेल नाभिक), लाल (~ 555 एनएम, कोशिका झिल्ली मार्कर) और दूर के लाल (~ 615 एनएम, LAMP1) चैनलों सुसज्जित GFP में छवियों (488 एनएम, बैक्टीरिया), Hoechst के मोल एक 20x उद्देश्य के साथ। छवि के क्रम में नमूना प्रति 5,000 कोशिकाओं की एक न्यूनतम अच्छी तरह से प्रति 21 स्वतंत्र क्षेत्रों मोल। एक संदर्भ के रूप में मेजबान सेल नाभिक चैनल का उपयोग autofocusing लागू करें। बैक्टीरियल रोगज़नक़ों मेजबान कोशिकाओं के कम प्रतिशत से संक्रमण के साथ काम करते हैं, उपयोगकर्ताओं का विश्लेषण करने के लिए 500 संक्रमित कोशिकाओं की एक न्यूनतम प्राप्त करने के लिए, अच्छी तरह से प्रति imaged स्वतंत्र क्षेत्रों की संख्या को समायोजित कर सकते हैं।

6. छवि प्रसंस्करण

नोट: निम्न चरणों छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर CellProfiler के उपयोग के लिए विशिष्ट हैं। सभी मामलों में, इष्टतम algoritविभाजन के लिए एचएम प्रयोगात्मक परिभाषित किया जाना चाहिए और छवि की सीमा को छू वस्तुओं उपयुक्त समारोह के साथ समाप्त किया जाना चाहिए।

  1. CellProfiler में सभी छवियों को लोड करें।
  2. निम्न चरणों में मेजबान सेल नाभिक के रूप में (यह भी Hoechst के द्वारा लेबल) Coxiella कालोनियों का पता लगाने से बचने के लिए, हेक्स्ट चैनल से GFP चैनल घटाना मॉड्यूल "ImageMath" का प्रयोग करें।
  3. 6.2 कदम के परिणामस्वरूप छवि से खंड मेजबान सेल नाभिक के लिए मॉड्यूल "IdentifyPrimaryObjects" का प्रयोग करें। खंडित वस्तुओं "नाभिक" नाम।
  4. बीज के रूप में कदम 6.3 में पता चला नाभिक का उपयोग कर 555 एनएम छवियों से खंड मेजबान कोशिकाओं के लिए मॉड्यूल "IdentifySecondaryObjects" का प्रयोग करें। खंडित वस्तुओं "कोशिकाओं" नाम।
  5. (वैकल्पिक) कदम 6.4 में पहचान की कोशिकाओं से कदम 6.3 पर पहचान नाभिक घटाना मॉड्यूल "IdentifyTertiaryObjects" का प्रयोग करें। खंडित वस्तुओं नाम "कोशिका द्रव्य221 ;.
  6. पृष्ठभूमि को दूर करने और LAMP1 पॉजिटिव डिब्बों की निम्नलिखित पहचान की सुविधा के लिए 615 एनएम छवियों पर मॉड्यूल "EnhanceOrSuppressFeatures" का प्रयोग करें।
  7. LAMP1 पॉजिटिव डिब्बों की पहचान करने के लिए कदम 6.6 पर प्राप्त छवि पर मॉड्यूल "IdentifyPrimaryObjects" का प्रयोग करें। खंडित वस्तुओं "लाइसोसोम" नाम।
  8. Coxiella कालोनियों की पहचान करने के लिए 488 एनएम छवि पर मॉड्यूल "IdentifyPrimaryObjects" का प्रयोग करें। खंडित वस्तुओं "कालोनियों" नाम।
  9. बीज के रूप में कदम 6.8 में पता चला Coxiella कालोनियों का उपयोग कर Coxiella युक्त रिक्तिकाएं की पहचान करने के लिए 615 एनएम छवियों पर मॉड्यूल "IdentifySecondaryObjects" का प्रयोग करें। खंडित वस्तुओं "CCVs" नाम।
  10. (छवि की सीमा को छू कोशिकाओं का सफाया कर दिया गया है, के रूप में कुछ CCVs "बाहर" कोशिकाओं का पता लगाया जा सकता है) कोशिकाओं पर पता चला CCVs चयन करने के लिए मॉड्यूल "MaskObjects" का प्रयोग करें। Res के नामulting "छानने का CCVs" वस्तुओं।
  11. (छवि की सीमा को छू कोशिकाओं का सफाया कर दिया गया है, के रूप में कुछ कालोनियों "बाहर" कोशिकाओं का पता लगाया जा सकता है) कोशिकाओं पर पता चला कालोनियों का चयन करने के लिए मॉड्यूल "MaskObjects" का प्रयोग करें। जिसके परिणामस्वरूप वस्तुओं "छानने का कालोनियों" नाम।
  12. कोशिकाओं को लाइसोसोम संबद्ध करने के लिए मॉड्यूल "MaskObjects" का प्रयोग करें। जिसके परिणामस्वरूप वस्तुओं "छानने का लाइसोसोम" नाम।
  13. Coxiella कालोनियों युक्त कोशिकाओं को चुनने के लिए मॉड्यूल "MaskObjects" का प्रयोग करें। जिसके परिणामस्वरूप वस्तुओं "संक्रमित कोशिकाओं" नाम।
  14. मॉड्यूल का उपयोग माता पिता वस्तुओं "सेल" के बच्चों के रूप में वस्तुओं "छानने का CCVs" सेट करने के लिए "वस्तुओं से संबंधित हैं"। इस CCVs / सेल की संख्या की गणना के लिए अनुमति देगा।
  15. मॉड्यूल का उपयोग माता पिता वस्तुओं "सेल" के बच्चों के रूप में वस्तुओं "छानने का कालोनियों" सेट करने के लिए "वस्तुओं से संबंधित हैं"। यह करेगाकालोनियों / सेल की संख्या की गणना के लिए अनुमति देते हैं।
  16. माता पिता वस्तुओं "सेल" के बच्चों के रूप में वस्तुओं "छानने का लाइसोसोम" सेट करने के लिए "वस्तुओं से संबंधित" मॉड्यूल का उपयोग करें। इस लाइसोसोम / सेल की संख्या की गणना के लिए अनुमति देगा।
  17. नाभिक, सेल, छानने का CCVs, फ़िल्टर कालोनियों और छानने का लाइसोसोम के रूपात्मक विश्लेषण प्राप्त करने के लिए मॉड्यूल "MeasureObjectSizeShape" का प्रयोग करें
  18. छानने का CCVs के साथ जुड़े GFP प्रतिदीप्ति यों और CCVs भीतर Coxiella प्रतिकृति की दक्षता में अनुमान लगाने के लिए मॉड्यूल "MeasureObjectIntensity" का प्रयोग करें।
  19. मॉड्यूल "OverlayOutlines" और "SaveImages" का प्रयोग विभाजन के परिणाम और गुणवत्ता नियंत्रण के लिए मूल छवि ओवरले।
  20. सभी या छवि विश्लेषण के परिणामों की एक चयन के निर्यात करने के लिए मॉड्यूल "ExportToSpreadsheet" का प्रयोग करें।
  21. (वैकल्पिक) परिणामों का विश्लेषण करने के लिए मॉड्यूल "ExportToDatabase" का प्रयोग करेंसॉफ्टवेयर CellProfiler विश्लेषक का उपयोग कर।

7. डेटा विश्लेषण

  1. प्रत्येक पैरामीटर प्राप्त करने के लिए, की पहचान करने और फिर उत्परिवर्ती प्रति मतलब मूल्यों की गणना (कारण छवि विभाजन में त्रुटियों के लिए) outliers के खत्म।
  2. महत्वपूर्ण phenotypes की पहचान करने के लिए जेड के स्कोर का उपयोग करें। > एक जेड स्कोर के साथ phenotypes पर विचार -2 गैर महत्वपूर्ण के रूप में, एक जेड स्कोर ≤ -4 के रूप में मजबूत के साथ -2 और -4 के रूप में हल्के और phenotypes के बीच एक जेड स्कोर के साथ phenotypes।
  3. प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार मापदंडों का प्लॉट संयोजन।

Representative Results

Transposon म्यूटेंट के अलगाव पर, एक प्राइमर कॉलोनी पीसीआर प्रत्येक उत्परिवर्ती के लिए transposon प्रविष्टि के स्थल की पहचान करने के लिए एक मजबूत, उच्च throughput विधि है। यह दृष्टिकोण एक ठेठ नेस्टेड पीसीआर प्रोटोकॉल से निकला है, लेकिन यहां एक भी प्राइमर annealing तापमान (चित्रा 1 ए) की तंगी के आधार पर टेम्पलेट डीएनए के लिए विशेष रूप से और / या गैर-विशेष रूप से hybridizes। ठेठ पीसीआर उत्पादों विशिष्ट हैं, जिनमें से अधिकांश कई डीएनए टुकड़े, (चित्रा 1 बी) से मिलकर बनता है। सही transposon आईटीआर के अपस्ट्रीम, और प्रवर्धन प्राइमर द्वारा मान्यता प्राप्त अनुक्रम के बहाव anneals कि एक अलग अनुक्रमण प्राइमर का उपयोग अनुक्रमण कदम (चित्रा 1C) के लिए विशिष्टता प्रदान करता है। अनुक्रम विश्लेषण के लिए स्वचालित सॉफ्टवेयर transposon सम्मिलन (चित्रा 1C) की सटीक साइट उपलब्ध कराने Coxiella जीनोम को प्राप्त दृश्यों संरेखित करता है। सभी transposon सम्मिलन तो एन किया जा सकता हैCoxiella जीनोम (चित्रा -1) पर otated।

प्रत्येक Coxiella उत्परिवर्ती पृथक और भंडारण या स्क्रीनिंग के लिए या तो पूर्व ACCM-2 मध्यम में axenically परिलक्षित होता है। 2 16 डॉट / आईसीएम Coxiella जीन (2A चित्रा) में 38 transposon म्यूटेंट का एक उदाहरण दिखाता है चित्रा। Coxiella म्यूटेंट की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए, axenic विकास घटता 1.5 (Figurie 2 बी) में वर्णित बैक्टीरियल एकाग्रता परख टीका पद 7 दिनों के लिए बैक्टीरियल संस्कृतियों नमूना और लागू करने के द्वारा प्राप्त कर रहे हैं। प्रवर्धित म्यूटेंट तो 7 दिनों के लिए तीन प्रतियों में 96 अच्छी तरह से प्लेट में, उपकला कोशिकाओं के साथ incubated हैं। उत्पन्न सभी Coxiella म्यूटेंट GFP टैग, इंट्रासेल्युलर विकास घटता अच्छी तरह से, हर 24 घंटा हर की GFP प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के लिए, और समय के एक समारोह (चित्रा -2) के रूप में मापा मूल्यों की साजिश रचने के द्वारा प्राप्त कर रहे हैं किया जा रहा है।

Intrअकोशिकीय विकास घटता Coxiella जीनोम में हर transposon प्रविष्टि के साथ जुड़े phenotypes की मात्रात्मक विश्लेषण प्रदान करते हैं। एक ही transposon म्यूटेंट के बारे में गुणात्मक जानकारी जोड़ने के लिए, हम स्वचालित छवि अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए चुना। सात दिनों प्लेटें 4 में वर्णित है और इस तरह के CellProfiler (ब्रॉड संस्थान के रूप में 5. स्वचालित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में वर्णित के रूप में एक स्वचालित, epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग विश्लेषण के रूप में इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए कार्रवाई, तय कर रहे हैं, के बाद संक्रमण www.cellprofiler.com हासिल कर ली चैनलों प्रक्रियाओं) स्वतंत्र रूप से और क्षेत्रों के तुलनात्मक विश्लेषण (चित्रा 3) के लिए वस्तुओं की पहचान की। यह मेजबान सेल नाभिक, सेल आकृति, लाइसोसोम और Coxiella कालोनियों (चित्रा 3 शीर्ष पैनल) की पहचान और रूपात्मक लक्षण वर्णन अनुमति देता है। कोशिकाओं और लाइसोसोम के साथ Coxiella कालोनियों Correlating identificati की अनुमति देता हैपर और सकारात्मक (LAMP1, चित्रा 3 निचले बाएं पैनल जो कर रहे हैं) Coxiella युक्त रिक्तिकाएं के विशिष्ट रूपात्मक विश्लेषण। मेजबान सेल आकृति के साथ Coxiella कालोनियों Correlating पहचान और संक्रमित कोशिकाओं के विशिष्ट रूपात्मक विश्लेषण (चित्रा 3 नीचे केंद्र पैनल) की अनुमति देता है। अंत में, 4 चैनलों चित्रण और गुणवत्ता नियंत्रण के प्रयोजनों (चित्रा 3 नीचे सही पैनल) के लिए विलय कर रहे हैं।

स्वचालित छवि विश्लेषण से प्राप्त आंकड़ों "बहु प्ररूपी बिखराव भूखंडों" प्राप्त करने के लिए एक दूसरे के खिलाफ साजिश रची जा सकता है। एक उदाहरण के रूप में, Coxiella कालोनियों की चित्रा -4 ए (माइक्रोन 2 में) औसत क्षेत्र में Coxiella (प्रतिकृति फेनोटाइप) और / या के intracellular प्रतिकृति को प्रभावित करने वाले म्यूटेशन की पहचान करने के लिए, सेल (चित्रा -4 ए) के अनुसार कालोनियों की संख्या के खिलाफ साजिश रची है मेजबान कोशिकाओं पर आक्रमण करने के लिए बैक्टीरिया की क्षमता (अंतरराष्ट्रीयlization फेनोटाइप)। सांख्यिकीय विश्लेषण हल्के (-4 <जेड स्कोर ≤ -2) और गंभीर (जेड स्कोर ≤ -4) phenotypes के लिए इसी जिसके परिणामस्वरूप तितर बितर साजिश में क्षेत्रों को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। म्यूटेंट 3 मुख्य समूहों में मनाया गया: Coxiella का एक दोषपूर्ण इंट्रासेल्युलर वृद्धि हुई है कि म्यूटेशन साजिश (चित्रा -4 ए, गुलाबी और लाल डॉट्स) के बाएं सबसे अधिक भाग में बांटा गया था; कोशिकाओं में Coxiella internalization के प्रभावित है कि म्यूटेशन की साजिश के नीचे हिस्से में बांटा गया (चित्रा -4 ए, प्रकाश और गहरे नीले रंग की डॉट्स) और अंत में, साजिश का अधिकार सबसे क्षेत्र में हरे रंग की डॉट्स (गैर महत्वपूर्ण phenotypes में जिसके परिणामस्वरूप म्यूटेशन के अनुरूप जेड स्कोर> -2)। महत्वपूर्ण बात है, दोहराने के लिए असफल हो, लेकिन अभी भी मेजबान कोशिकाओं पर आक्रमण करने में सक्षम हैं कि म्यूटेंट, सेल नाभिक (चित्रा 4C, दूसरा पैनल) की मेजबानी करने के लिए आसन्न एकल बैक्टीरिया, या छोटी कालोनियों के रूप में संक्रमण के 7 दिनों के बाद पता चला रहे हैं। इसलिए, Coxiella का आकार "Coloलोग "काफी प्रभावित हो जाएगा लेकिन संक्रमित कोशिकाओं की संख्या गुम्मट Coxiella -infected कोशिकाओं की तुलना में भिन्न नहीं होगा। इसके विपरीत, मेजबान कोशिकाओं पर आक्रमण करने Coxiella की क्षमता को प्रभावित करने वाले म्यूटेशन कालोनियों / सेल की संख्या में कमी का परिणाम। इस संख्या में काफी 1 से नीचे है, यह औसत पर, संक्रमित कोशिकाओं की कुल संख्या में कमी आई है, जो इंगित करता है। वैकल्पिक रूप से, Coxiella कालोनियों के (2 सुक्ष्ममापी में) औसत क्षेत्र Coxiella (साइटोटोक्सिक फेनोटाइप) को cytotoxicity प्रदान कि म्यूटेशन की पहचान करने के लिए संक्रमण (चित्रा 4 बी) जीवित मेजबान कोशिकाओं की संख्या के खिलाफ साजिश रची जा सकता है। जैसा कि ऊपर, सांख्यिकीय विश्लेषण हल्के (-4 <जेड स्कोर ≤ -2) और गंभीर (जेड स्कोर ≤ -4) phenotypes के लिए इसी जिसके परिणामस्वरूप तितर बितर साजिश में क्षेत्रों को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। अधिकांश म्यूटेशन काफी मेजबान के भीतर बैक्टीरियल प्रतिकृति की परवाह किए बिना, सेल अस्तित्व को प्रभावित नहीं किया है जांचकोशिकाओं (3B चित्रा हरी डॉट्स)। 37 म्यूटेशन हल्का प्रभावित मेजबान सेल अस्तित्व (चित्रा 3 बी, प्रकाश लाल डॉट्स), और 7 म्यूटेशन सेल अस्तित्व (3B चित्रा, गहरे लाल डॉट्स) की मेजबानी करने के लिए विशेष रूप से हानिकारक थे। प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार, स्वचालित छवि विश्लेषण की प्रक्रिया से प्राप्त अतिरिक्त पैरामीटर अन्य चार्ट प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कृपया ध्यान दें।

चित्र 1
चित्रा 1:। अनुक्रमण और Coxiella transposon म्यूटेंट के एनोटेशन (ए) एकल प्राइमर कॉलोनी पीसीआर transposon प्रविष्टि की साइट से युक्त डीएनए टुकड़े बढ़ाना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। एक प्रवर्धन प्राइमर (एएमपी) annealing तापमान की तंगी के आधार पर एक विशिष्ट और गैर विशिष्ट किताब के रूप में दोनों का इस्तेमाल किया जाता है। (बी) के एक प्राइमर कॉलोनी पीसीआर की विशिष्ट परिणाम। प्रत्येक reactiपर transposon प्रविष्टि साइट होते हैं, जिनमें से कुछ चर आकार के टुकड़े के एक नंबर का उत्पादन; कुछ अन्य लोगों के बेतरतीब ढंग से-उत्पादों को कम तंगी पीसीआर चक्र के रूप में परिलक्षित कर रहे हैं। (सी) transposon अनुक्रम को hybridizes कि एक अनुक्रमण प्राइमर (Seq) के उपयोग के हित के टुकड़े का अनुक्रमण अनुमति देता है। (डी) अनुक्रम विश्लेषण सॉफ्टवेयर बैक्टीरियल जीनोम पर transposon सम्मिलन का स्वत: एनोटेशन अनुमति देता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। Axenic और Coxiella transposon म्यूटेंट के intracellular विकास (ए) के पायलट स्क्रीन में, हम 16 कोर जी में 38 transposon म्यूटेंट अनुक्रम, पृथक और जांच की हैCoxiella डॉट / आईसीएम स्राव प्रणाली के enes (लाल रंग में संकेत दिया)। प्रत्येक transposon उत्परिवर्ती की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए (बी), प्रत्येक के विकास axenic मध्यम संस्कृति में अलग-थलग एक fluorescently डीएनए intercalating एजेंट में चिह्नित का उपयोग करते हुए 8 दिन से अधिक नजर रखी है। (सी) प्रत्येक उत्परिवर्ती तो उपकला कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। Transposon एक GFP कैसेट के पास के रूप में, इंट्रासेल्युलर बैक्टीरियल वृद्धि एक microplate रीडर का उपयोग, Coxiella प्रतिकृति के साथ जुड़े GFP प्रतिदीप्ति के रूपांतरों का पालन करते हुए संक्रमण के 7 दिनों से नजर रखी है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: Coxiella संक्रमण के स्वचालित छवि विश्लेषण एक ऑटो।mated epifluorescence खुर्दबीन छवि के लिए तीन प्रतियों 96 अच्छी तरह से प्लेटों के प्रति अच्छी तरह से 21 पदों पर प्रयोग किया जाता है। छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर खंडों मात्रा का ठहराव और विश्लेषण के लिए प्रत्येक हासिल कर ली चैनलों में वस्तुओं। सभी मामलों में, छवियों की सीमा को छू वस्तुओं बाहर रखा गया है। (ए) हेक्स्ट चैनल (हरे रंग में परिक्रमा) मेजबान सेल नाभिक की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है। (ख) इन Cy3 चैनल में मेजबान सेल आकृति की पहचान करने के लिए बीज के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं (नाभिक की स्थिति नीले रंग में परिक्रमा कर रहा है, सेल आकृति हरे रंग में) कर रहे हैं। (सी) Cy5 चैनल LAMP1 पॉजिटिव डिब्बों की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है (हरे रंग में परिक्रमा); केवल (लाल) में पहले से पहचान सेल आकृति में शामिल वस्तुओं छवि विश्लेषण के लिए रखा जाता है। (डी) GFP चैनल (हरे रंग में परिक्रमा) Coxiella कालोनियों की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है। (ई) LAMP1 पॉजिटिव डिब्बों के साथ Coxiella कालोनियों Correlating Coxiella की पहचान के लिए अनुमति देता है Coxiella कालोनियों Correlating (एफ) संक्रमित कोशिकाओं (pseudocolored) की पहचान की अनुमति देता है। 4 प्रतिदीप्ति चैनलों में अधिग्रहण (जी) छवियाँ (Coxiella कालोनियों (हरा), मेजबान सेल नाभिक (नीला), मेजबान सेल प्लाज्मा झिल्ली (ग्रे), LAMP1 पॉजिटिव डिब्बों (लाल) के लिए इसी) का विलय कर दिया और चित्रण और गुणवत्ता के लिए उपयोग किया जाता है नियंत्रण। स्केल 10 माइक्रोन वर्जित है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: मेजबान में शामिल Coxiella कारकों में से बड़े पैमाने पर पहचान / रोगज़नक़ बातचीतआयनों। (ए) Coxiella कालोनियों के (2 सुक्ष्ममापी में) सेल प्रति कालोनियों के सापेक्ष संख्या के खिलाफ साजिश रची है औसत क्षेत्र, ब्याज की प्रतिकृति और internalization के phenotypes के पहचान के लिए। हरे रंग की डॉट्स एक जेड स्कोर> -2 (महत्वपूर्ण नहीं) द्वारा गुम्मट Coxiella से विचलित है कि phenotypes के प्रतिनिधित्व करते हैं। गुलाबी और हल्के नीले रंग की डॉट्स -2 और -4 (हल्के phenotypes) के बीच एक जेड स्कोर के साथ, क्रमशः प्रतिकृति और internalization के phenotypes के प्रतिनिधित्व करते हैं। लाल और गहरे नीले रंग की डॉट्स एक जेड स्कोर ≤ -4 (मजबूत phenotypes) के साथ phenotypes के प्रतिनिधित्व करते हैं। Coxiella कालोनियों (बी) (2 सुक्ष्ममापी में) औसत क्षेत्र transposon सम्मिलन से उत्पन्न साइटोटोक्सिक प्रभाव का अनुमान लगाने के संक्रमण के 7 दिनों के बच गया है कि कोशिकाओं (संक्रमित और संक्रमित नहीं) की कुल संख्या के खिलाफ साजिश रची गई थी। हरे रंग की डॉट्स एक जेड स्कोर> -2 (महत्वपूर्ण नहीं) द्वारा गुम्मट Coxiella से विचलित है कि phenotypes के प्रतिनिधित्व करते हैं। गुलाबी डॉट्स साइटोटोक्सिक पीएच का प्रतिनिधित्व-2 और -4 (हल्के phenotypes) के बीच एक जेड स्कोर के साथ enotypes। लाल डॉट्स एक जेड स्कोर ≤ -4 (मजबूत phenotypes) के साथ साइटोटोक्सिक phenotypes के प्रतिनिधित्व करते हैं। तीर सी (सी) में इसी छोटा अक्षर से यह साफ म्यूटेंट प्रतिकृति, internalization और साइटोटोक्सिक phenotypes की छवियों प्रतिनिधि संकेत मिलता है। सभी मामलों में, मेजबान सेल नाभिक लाल रंग में हैं, Coxiella कालोनियों हरे रंग में हैं। स्केल 50 माइक्रोन वर्जित है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

मेजबान / रोगज़नक़ बातचीत के अध्ययन के जीवाणु संक्रमण को समझते हैं और संक्रामक रोगों का मुकाबला करने के लिए वैकल्पिक रणनीति विकसित करने के लिए एक उल्लेखनीय विधि साबित हो गया है। हालांकि, अलग बैक्टीरियल रोगज़नक़ों द्वारा सविस्तार रणनीतियों की विविधता के लिए, बैक्टीरियल विषैलापन कारकों की और संक्रमण के दौरान लक्षित कर रहे हैं कि रास्ते संकेतन मेजबान की पहचान और लक्षण वर्णन एक असली चुनौती का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह कुंजी मेजबान / रोगज़नक़ बातचीत केन्द्रों में बड़े पैमाने पर पहचान के लिए नए तरीकों के विकास के लिए कहता है। अभिनव, उच्च throughput और उच्च सामग्री स्क्रीनिंग तकनीक का हाल ही में विकास इंट्रासेल्युलर बैक्टीरियल रोगज़नक़ों 15 का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि एक अमूल्य संसाधन का प्रतिनिधित्व करता है। यहाँ, हम transposon उत्परिवर्तजनन और प्रतिदीप्ति आधारित assays कि गठबंधन स्क्रीनिंग दृष्टिकोण विकसित करने के लिए एक मॉडल के रूप में जूनोटिक बैक्टीरियल रोगज़नक़ Coxiella burnetii का इस्तेमाल किया है। Importantly, इस स्क्रीनिंग विधि, आक्रमण दोहराने के लिए और संक्रमित कोशिकाओं के भीतर जारी रहती है इस जीवाणु द्वारा विकसित की रणनीतियों में से एक वैश्विक सिंहावलोकन प्रदान करने, Coxiella इंट्रासेल्युलर चक्र के कई चरणों के एक साथ निगरानी की अनुमति देता है।

यहाँ वर्णित दृष्टिकोण सफलतापूर्वक बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के अध्ययन के लिए लागू किया गया है जो दो अच्छी तरह से स्थापित तकनीक, transposon उत्परिवर्तजनन और प्रतिदीप्ति आधारित assays, पर आधारित है। उच्च throughput / उच्च सामग्री स्क्रीन के संदर्भ में इन तकनीकों का मेल हमें घटनाओं की एक बहुत ही उच्च संख्या (बैक्टीरिया म्यूटेशन प्रति आम तौर पर 15,000 संक्रमित कोशिकाओं imaged और विश्लेषण कर रहे हैं) का विश्लेषण करके बैक्टीरियल म्यूटेशन के एक उच्च संख्या के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए अनुमति देता है। इस तरह, स्वभाव से, उच्च परिवर्तनशीलता के अधीन हैं, जो मेजबान कोशिकाओं और intracellular प्रतिकृति, के जीवाणु आक्रमण के रूप में की घटनाओं का एक महत्वपूर्ण सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदान करता है। यह ईपी के अलावा अन्य है कि सेल लाइनों नोट करना महत्वपूर्ण हैithelial स्क्रीनिंग के इस प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। मेजबान सेल organelles पता लगाने के लिए आसान कर रहे हैं लेकिन, जैसा कि फ्लैट और बड़े उपकला कोशिकाओं छवि विश्लेषण के लिए इष्टतम है। स्वचालित माइक्रोस्कोप के बहुमत स्वचालित रूप से प्लेटों की एक बड़ी संख्या को संभाल कर सकते हैं, साथ ही साथ जांच की जा सकती है कि म्यूटेंट की संख्या के लिए वास्तव में कोई सीमा नहीं है। रोगज़नक़ पर निर्भर करता है, कर सकते हैं उपयोगकर्ता विशेषाधिकार एक epifluorescence या एक confocal खुर्दबीन का उपयोग करें। छवि अधिग्रहण के समय ज्यादातर प्रति अच्छी तरह से और देखने के क्षेत्र में प्रति हासिल कर ली चैनलों की संख्या पर अधिग्रहीत क्षेत्रों की संख्या पर, माइक्रोस्कोप कैमरे की संवेदनशीलता पर निर्भर करेगा। उपयोगकर्ता स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने के लिए इन कारकों को समायोजित करने के लिए कैसे तय कर सकते हैं। एक उदाहरण के रूप में, हम बिंदु 5.1 में संकेत दिया शर्तों का उपयोग कर एक 96 अच्छी तरह से थाली / घंटा imaged। छवि विश्लेषण काफी हद तक इस्तेमाल किया मशीन (या मशीनों के क्लस्टर) पर निर्भर करता है। हम एक 12-कोर (2 एक्स 3.06 गीगा 6-कोर), 48 जीबी रैम कार्य केंद्र का उपयोग करें। इस मशीन का अनुमानित आवश्यकता हैmately 40 मिनट से एक थाली से प्राप्त कर लिया छवियों का विश्लेषण करने के लिए।

इन assays के विकास के नए सेट अप (या मौजूदा का अनुकूलन) के नमूनों की एक बड़ी संख्या में हेरफेर और प्रसंस्करण की अनुमति देने का प्रोटोकॉल है जब एक महत्वपूर्ण पहलू को ध्यान में रखा जाना है। एक विशिष्ट उदाहरण हमें तेजी से बढ़ाना और करने के लिए अनुमति दी है जो एक प्राइमर कॉलोनी पीसीआर दृष्टिकोण का विकास है, बहुत छोटे नमूनों से, प्रत्येक transposon की प्रविष्टि की साइट युक्त अनुक्रम Coxiella डीएनए टुकड़े। हमारे अनुभव के आधार पर, उच्च निष्ठा पोलीमर्स ध्यान से चयनित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के क्रम में परीक्षण किया जाना है। इस दृष्टिकोण का ही सीमा, मामलों के बहुमत में, संसाधित नमूनों के बारे में 30% से दोहन नहीं कर रहे हैं, अवलोकन में पीसीआर या अनुक्रमण चरणों की वजह से या तो छिपा सकते हैं। बहरहाल, नए Coxiella transposon म्यूटेंट के अलगाव के एक दर सीमित कदम नहीं है, विचार है कि इस प्रतिनिधि नहीं करताएक प्रमुख मुद्दा भेजा है। इसी तरह, उत्परिवर्ती शेयरों के जीवाणु एकाग्रता यों के लिए एक विश्वसनीय परख के विकास के इस दृष्टिकोण के लिए महत्वपूर्ण हो गया है। जब निलंबन में कुल करने के लिए Coxiella की प्रवृत्ति के कारण, ऑप्टिकल घनत्व रीडिंग का उपयोग किया गया Coxiella संस्कृतियों और केवल मौजूदा विकल्प की एकाग्रता मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) की गणना करने के लिए लागू नहीं है। इधर, एक fluorescently में चिह्नित डीएनए intercalating एजेंट का उपयोग काफी बैक्टीरिया quantitation के तेजी।

यह दृष्टिकोण भी इस्तेमाल किया रोगज़नक़ के आधार पर कई intracellular डिब्बों के लिए फ्लोरोसेंट मार्करों व्यक्त स्थिर सेल लाइनों के उपयोग का लाभ ले सकते हैं। एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू फिनोल लाल से रहित सेल संस्कृति मीडिया का इस्तेमाल होता है। हम इस पीएच सूचक स्वचालित प्रतिदीप्ति पाठक पर दर्ज संकेत संतृप्त है कि लाल और हरे रंग स्पेक्ट्रम फैले प्राकृतिक प्रतिदीप्ति है कि मनाया।

टीवह यहाँ प्रस्तुत रणनीति यादृच्छिक transposon उत्परिवर्तजनन पर निर्भर करता है। ब्याज की म्यूटेंट के लिए, हम दक्षिणी धब्बा और transposon प्रविष्टि साइट की पीसीआर amplifications का उपयोग कर अद्वितीय प्रतिस्थापन मान्य कर (और क्लोनालिटी) की सलाह देते हैं।

प्रोटोकॉल खंड में वर्णित उपकरणों के अलावा, यहाँ प्रस्तुत स्क्रीनिंग दृष्टिकोण उपयोग करने में रुचि टीमों, डेटा संग्रह, डेटा भंडारण के लिए एक सर्वर और तेजी से छवि विश्लेषण के लिए एक कार्य केंद्र के लिए एक संबंधपरक डेटाबेस का सेट अप करने में बहुत लाभ ले जाएगा।

महत्वपूर्ण बात है, यहाँ अन्य इंट्रासेल्युलर बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के अध्ययन के लिए अनुकूल है वर्णित विधि एक यादृच्छिक उत्परिवर्तजनन विधि रोगज़नक़ के लिए मौजूद है, बशर्ते सेल लाइनों रोगज़नक़ से संक्रमित हो सकता है और यह एक संक्रमण के दौरान एक विशिष्ट फेनोटाइप प्रदर्शित करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Citric acid Sigma C0759-500G ACCM-2 medium component
Sodium citrate Sigma S4641-500G ACCM-2 medium component
Potassium phosphate Sigma 60218-100G ACCM-2 medium component
Magnesium chloride Sigma M2670-100G ACCM-2 medium component
Calcium chloride Sigma C5080-500G ACCM-2 medium component
Iron sulfate Sigma F8633-250G ACCM-2 medium component
Sodium chloride Sigma S9625-500G ACCM-2 medium component
L-cysteine Sigma C6852-25G ACCM-2 medium component
Bacto Neopeptone BD (Beckton-Dickinson) 211681 ACCM-2 medium component
Casamino acids BD (Beckton-Dickinson) 223050 ACCM-2 medium component
Methyl-B-cyclodextrin Sigma C4555-10G ACCM-2 medium component
RPMI w/glutamax Gibco 61870-010 ACCM-2 medium component
RPMI w/glutamax, without phenol red Gibco 32404-014 For cell culture and infection
Fetal bovine serum GE healthcare SH30071 For cell culture
Trypsin EDTA (0.25%) Life Technologies 25200-056 For cell culture
Saponin Sigma 47036 For immunofluorescence staining
Ammonium chloride Sigma A9434 For immunofluorescence staining
Bovine serum albumin Sigma A2153 For immunofluorescence staining
Electroporation cuvette 0.1 cm Eurogentec ce0001-50 For Coxiella transformation
Trackmates screw top tubes with caps Thermo Scientific 3741 2D barcoded screwcap
96-well microplate with black walls and bottom Greiner 655076 Flat dark bottom, for dsDNA quantitation
96-well PCR microplate Biorad 2239441 DNAse/RNAse free
96-well plate, deepwell Labcon 949481 For Coxiella mutants infections
PicoGreen Life Technologies P7581 For dsDNA quantitation
Triton X-100 Sigma T9284-500ML For dsDNA quantitation
Phusion high fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0530L For single primer colony PCR
Celltracker Red CMTPX Life Technologies C34552 For imaging
Anti-LAMP1 antibody Sigma 94403-1ML For immunofluorescence staining
Hoechst 33258 Sigma L1418 For imaging
Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro Tecan
Epifluorescence automated microscope Cellomics Thermo Scientific

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References

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जनरेशन और मल्टी-प्ररूपी उच्च सामग्री स्क्रीनिंग<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon म्यूटेंट
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Martinez, E., Cantet, F., Bonazzi, M. Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants. J. Vis. Exp. (99), e52851, doi:10.3791/52851 (2015).More

Martinez, E., Cantet, F., Bonazzi, M. Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants. J. Vis. Exp. (99), e52851, doi:10.3791/52851 (2015).

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