Coxiella burnetii er en obligat intracellulær Gram-negative bakterien ansvarlig for zoonotisk sykdom Q-feber. Her beskriver vi fremgangsmåter for generering av Coxiella fluorescerende transposon-mutanter så vel som automatisk identifisering og analyse av de resulterende internalisering, replikering og cytotoksiske fenotyper.
Invasjon og koloniseringen av vertcellene med bakterielle patogener avhenge av aktiviteten av et stort antall prokaryote proteiner, definert som virulensfaktorer, som kan undergrave og manipulere sentrale vertsfunksjonene. Studiet av vert / patogen interaksjoner er derfor svært viktig å forstå bakterielle infeksjoner og utvikle alternative strategier for å motvirke smittsomme sykdommer. Denne fremgangsmåten krever imidlertid utvikling av nye high-throughput-analyser for objektiv, automatisert identifisering og karakterisering av bakterielle virulens-determinanter. Her beskriver vi en fremgangsmåte for generering av et GFP-merket mutant-biblioteket ved transposon-mutagenese og utvikling av høyt innhold screening tilnærminger for samtidig identifikasjon av flere transposon-assosiert fenotyper. Vår arbeidsmodell er den intracellulære bakterielle patogenet Coxiella burnetii, det etiologiske middel av den zoonosis Q-feber, som er forbundet med seg selvvere utbrudd med en påfølgende helse og økonomisk byrde. Den obligat intracellulære natur dette patogenet har, inntil nylig, sterkt hemmet identifisering av bakterielle faktorer involvert i verts patogen interaksjoner, noe av Coxiella den ideelle modellen for gjennomføring av high-throughput / høyt innhold tilnærminger.
De framvoksende, endemisk bakterien Coxiella burnetii er ansvarlig for store utbrudd av Q-feber, en ødeleggende influensalignende zoonose med alvorlig helse og økonomiske konsekvensene en. De viktigste reservoarer av Coxiella er innenlands og husdyr, og det er anslått at mer enn 90% av melkekyr i USA bære C. burnetii to. Mennesker er tilfeldige verter som er infisert ved innånding av forurenset aerosoler. Humant Q-feber manifesterer enten som en akutt eller kronisk sykdom, noe som kan ha fatale komplikasjoner med en dødelighet nådde 65% 1,3. Med en infeksiøs dose på 1 – 10 organismer, er Coxiella den mest smittsomme organismen kjent, og det er blitt undersøkt som en potensiell biologisk våpen 4. Den nylige eksplosive utbrudd av Q-feber i Nederland (2007 – 2010), med saker økende fra 182 til mer enn 2000 per år, står som et eksempel på alvorlig virulens dette patogenet5.
Den bemerkelsesverdige effektivitet av Coxiella infeksjoner er sannsynligvis forbundet med sin motstand mot miljømessig stress, kombinert med sin unike tilpasning til vertsceller. Faktisk er Coxiella tilstede i miljøet i form av metabolsk inaktive små cellevariantene (SCV), som er bemerkelsesverdig motstandsdyktige mot flere barske forhold (uttørking, temperatur, etc.). Hydraulikkventiler er opp tatt av fagocyttceller via α V β 3 inte 6 mens invasjonen av ikke-fagocyttceller medieres av Coxiella adhesjon / invasjon OmpA 7 og en ennå uidentifiserte reseptor. Etter opptaket, bosatt Coxiella i tettsittende vakuoler, positive for tidlig endosomale markører Rab5 og EEA1 8. Bakterier svare på endosomale forsuring ved å konvertere til metabolsk aktive store celle varianter (varebiler) og aktivere en Dot / Icm type 4 sekresjon system (T4SS) 9, Meget homologe med den i Legionella pneumophila 10. Utskillelsen av Dot / ICM effektorer tillate Coxiella å generere et stort, LAMP1-positive surt rommet inneholder aktive lysosomale enzymer hvor bakterier kan trives og aktivt beskytter infiserte celler fra apoptose 11. Derfor er den intracellulære syklus av Coxiella styres av Dot / Icm-mediert translokasjon av bakterielle effektorer 12 imidlertid den mikrobielle faktorer involvert i vertscellen invasjon, bakteriell replikasjon og spredning av infeksjonen forblir stort sett ukjent.
Kombinere transposon mutagenese og fluorescens-baserte analyser, utvikler vi objektive tilnærminger for samtidig identifisering av bakterielle faktorer involvert i de viktigste trinnene i Coxiella infeksjoner: 1) internalisering innenfor vertsceller, 2) intracellulær replikering, 3) celle-til-celle spredning og 4) utholdenhet. Hittil har vi vist over 1000 mutations i 500 Coxiella sekvenser, som ga oss med enestående innsikt i verts-patogen interaksjoner som regulerer Coxiella patogenesen 7. Av notatet, kan denne tilnærmingen brukes til studier av andre intracellulære patogener som deler cellebiologiske funksjoner med Coxiella.
Studiet av vert / patogen interaksjoner har vist seg å være en bemerkelsesverdig måte å forstå bakterielle infeksjoner og utvikle alternative strategier for å motvirke smittsomme sykdommer. Men på grunn av mangfoldet av strategier utarbeidet av forskjellige bakterielle patogener, identifisering og karakterisering av bakteriell virulens faktorer og av verten signalveier som er rettet ved infeksjoner, representerer en virkelig utfordring. Dette krever utvikling av nye metoder for storskala identifisering av viktige vert / patogen interaksjon huber. Den siste utviklingen av innovative, høy gjennomstrømming og høy innholdsscreeningteknikker representerer en uvurderlig ressurs som kan tilpasses til studiet av intracellulære bakterielle patogener 15. Her har vi brukt den zoonotisk bakterie patogen Coxiella burnetii som modell for å utvikle screening tilnærminger som kombinerer transposon mutagenese og fluorescens-basert analyser. Importantly, gjør dette screening metoden samtidig overvåking av flere trinn av Coxiella intracellulære syklus, og gir en global oversikt over de strategier utviklet av denne bakterien å invadere, replikere og vedvare i infiserte celler.
Den metode som er beskrevet her, er basert på to veletablerte teknikker, transposon-mutagenese og fluorescens-baserte analyser, noe som har blitt brukt til studiet av bakterielle patogener. Ved å kombinere disse teknikkene i sammenheng med høy gjennomstrømming / høyt innhold av skjermer gjør det mulig å evaluere effektene av et høyt antall av bakterielle mutasjoner ved å analysere et meget høyt antall hendelser (typisk 15 000 infiserte celler per bakterie mutasjoner blir avbildet og analysert). Dette gir et viktig statistisk analyse av hendelser som bakteriell invasjon av vertsceller og intracellulær replikering, som er, av natur, utsatt for høy variabilitet. Det er viktig å merke seg at andre cellelinjer enn epithelial kan anvendes for denne type screening. Imidlertid flate og store epitelceller er optimale for bildeanalyse som vertscelleorganeller, er lettere å oppdage. Fordi flertallet av automatiserte mikroskoper kan automatisk håndtere et stort antall plater, det er nesten ingen grenser for antall mutanter som kan bli vist samtidig. Avhengig av patogen, kan brukeren rettighet bruk av en epifluorescens eller et konfokalt mikroskop. Tidspunktet for bildeopptak vil for det meste avhenge av følsomheten av mikroskopet kameraet på antall felter ervervet per brønn, og på antall kanaler ervervet pr synsfelt. Brukeren kan bestemme hvordan du vil justere disse faktorene for å optimalisere screening-protokollen. Som et eksempel, avbildes vi en 96-brønns plate / time ved hjelp av de betingelser som er angitt i punkt 5.1. Bildeanalyse stor grad avhenger av maskinen (eller klynge av maskiner) benyttes. Vi bruker en 12-core (2 x 3.06 GHz 6-Core), 48 GB RAM arbeidsstasjon. Denne maskinen krever approxilag 40 min å analysere bilder ervervet fra en plate.
Et viktig aspekt som må tas i betraktning ved utvikling av disse analyser er det satt opp av ny (eller optimaliseringen av eksisterende) protokoller for å tillate manipulering og behandling av et stort antall prøver. Et typisk eksempel er utviklingen av en enkelt koloni PCR primer tilnærming, som tillot oss å forsterke og hurtig rekkefølge Coxiella DNA-fragmenter som inneholder stedet for innsetting av hvert transposon, fra meget små prøver. Basert på vår erfaring, har high-fidelity polymerase å være nøye utvalgt og testet for å oppnå reproduserbare resultater. Den eneste begrensning av denne tilnærmingen kan gjemme seg i den observasjon at, i de fleste tilfeller omtrent 30% av de behandlede prøvene er ikke utnyttes, enten på grunn av PCR eller sekvenseringsfremgangsmåten. Men tatt i betraktning at isoleringen av nye Coxiella transposon-mutanter er ikke et hastighetsbegrensende trinn, er dette ikke represendte et stort problem. Likeledes er utviklingen av en pålitelig analyse for å kvantifisere bakteriekonsentrasjon av mutante varelageret nøkkel for denne tilnærmingen. På grunn av tendensen til å aggregere Coxiella når i suspensjon, er bruken av optiske tetthetsavlesninger ikke anvendelig for å beregne konsentrasjonen av Coxiella kulturer og den eneste eksisterende alternativ var kvantitativ PCR (qPCR). Her, ved bruk av en fluorescerende merket DNA-interkalerende middel betydelig fremskyndet bakterier kvantifisering.
Denne fremgangsmåten kan også dra nytte av anvendelse av stabile cellelinjer som uttrykker fluorescerende markører for flere intracellulære avhengig av patogenet som brukes. Et annet viktig aspekt er anvendelse av cellekulturmedier blottet for fenolrødt. Vi observerte at denne pH-indikator har en naturlig fluorescens spenner den røde og grønne spekteret som metter signal registreres på den automatiserte fluorescens leseren.
THan strategi presenteres her er avhengig av tilfeldig transposon mutagenese. For mutantene av interesse, anbefaler vi å validere unike trans (og klonalitet) ved hjelp av Southern blot og PCR presiseringer av transposoninsersjon nettstedet.
Foruten utstyret som er beskrevet i protokollen delen, lag interessert i å bruke screening tilnærmingen presenteres her, vil ta stor fordel i oppsettet av en relasjonsdatabase for datainnsamling, en server for datalagring og en arbeidsstasjon for rask bildeanalyse.
Viktigere er fremgangsmåten som her er beskrevet er egnet for studier av andre intracellulære bakterielle patogener gitt et tilfeldig mutagenese metode finnes for patogenet, kan cellelinjer bli smittet av organismen, og dette viser en bestemt fenotype ved infeksjon.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by an Avenir/ATIP grant to Matteo Bonazzi and a Marie Curie CIG (N° 293731) to Eric Martinez. The authors would like to thank Dr. Robert Heinzen for sharing C. burnetii strains, antibodies and tools, Virginie Georget and Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) for their technical assistance and data analysis.
Citric acid | Sigma | C0759-500G | ACCM-2 medium component |
Sodium citrate | Sigma | S4641-500G | ACCM-2 medium component |
Potassium phosphate | Sigma | 60218-100G | ACCM-2 medium component |
Magnesium chloride | Sigma | M2670-100G | ACCM-2 medium component |
Calcium chloride | Sigma | C5080-500G | ACCM-2 medium component |
Iron sulfate | Sigma | F8633-250G | ACCM-2 medium component |
Sodium chloride | Sigma | S9625-500G | ACCM-2 medium component |
L-cysteine | Sigma | C6852-25G | ACCM-2 medium component |
Bacto Neopeptone | BD (Beckton-Dickinson) | 211681 | ACCM-2 medium component |
Casamino acids | BD (Beckton-Dickinson) | 223050 | ACCM-2 medium component |
Methyl-B-Cyclodextrin | Sigma | C4555-10G | ACCM-2 medium component |
RPMI w/glutamax | Gibco | 61870-010 | ACCM-2 medium component |
RPMI w/glutamax, without phenol red | Gibco | 32404-014 | For cell culture and infection |
Fetal Bovine Serum | GE healthcare | SH30071 | For cell culture |
Trypsin EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | For cell culture |
Saponin | Sigma | 47036 | For immunofluorescence staining |
Ammonium chloride | Sigma | A9434 | For immunofluorescence staining |
Bovine Serum Albumine | Sigma | A2153 | For immunofluorescence staining |
Electroporation cuvette 0.1 cm | Eurogentec | ce0001-50 | For Coxiella transformation |
Trackmates screw top tubes with caps | Thermo Scientific | 3741 | 2D barcoded screwcap |
96-well microplate with black walls and bottom | Greiner | 655076 | Flat dark bottom, for dsDNA quantitation |
96-well microplate, ��clear, black walls | Greiner | 655090 | Flat transparent bottom, for cell culture and imaging |
96-well PCR microplate | Biorad | 2239441 | DNAse/RNAse free |
96-well plate, Deepwell | Labcon | 949481 | For Coxiella mutants infections |
PicoGreen | Life Technologies | P7581 | For dsDNA quantitation |
Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | For dsDNA quantitation |
Phusion High fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | For single primer colony PCR |
Celltracker Red CMTPX | Life Technologies | C34552 | For imaging |
Anti-LAMP1 antibody | Sigma | 94403-1ML | For immunofluorescence staining |
Hoechst 33258 | Sigma | L1418 | For imaging |
Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro | Tecan | ||
Epifluorescence automated microscope Cellomics | Thermo Scientific |