Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Generasjon og Multi-fenotypiske Høy innhold Screening av doi: 10.3791/52851 Published: May 13, 2015

Summary

Coxiella burnetii er en obligat intracellulær Gram-negative bakterien ansvarlig for zoonotisk sykdom Q-feber. Her beskriver vi fremgangsmåter for generering av Coxiella fluorescerende transposon-mutanter så vel som automatisk identifisering og analyse av de resulterende internalisering, replikering og cytotoksiske fenotyper.

Abstract

Invasjon og koloniseringen av vertcellene med bakterielle patogener avhenge av aktiviteten av et stort antall prokaryote proteiner, definert som virulensfaktorer, som kan undergrave og manipulere sentrale vertsfunksjonene. Studiet av vert / patogen interaksjoner er derfor svært viktig å forstå bakterielle infeksjoner og utvikle alternative strategier for å motvirke smittsomme sykdommer. Denne fremgangsmåten krever imidlertid utvikling av nye high-throughput-analyser for objektiv, automatisert identifisering og karakterisering av bakterielle virulens-determinanter. Her beskriver vi en fremgangsmåte for generering av et GFP-merket mutant-biblioteket ved transposon-mutagenese og utvikling av høyt innhold screening tilnærminger for samtidig identifikasjon av flere transposon-assosiert fenotyper. Vår arbeidsmodell er den intracellulære bakterielle patogenet Coxiella burnetii, det etiologiske middel av den zoonosis Q-feber, som er forbundet med seg selvvere utbrudd med en påfølgende helse og økonomisk byrde. Den obligat intracellulære natur dette patogenet har, inntil nylig, sterkt hemmet identifisering av bakterielle faktorer involvert i verts patogen interaksjoner, noe av Coxiella den ideelle modellen for gjennomføring av high-throughput / høyt innhold tilnærminger.

Introduction

De framvoksende, endemisk bakterien Coxiella burnetii er ansvarlig for store utbrudd av Q-feber, en ødeleggende influensalignende zoonose med alvorlig helse og økonomiske konsekvensene en. De viktigste reservoarer av Coxiella er innenlands og husdyr, og det er anslått at mer enn 90% av melkekyr i USA bære C. burnetii to. Mennesker er tilfeldige verter som er infisert ved innånding av forurenset aerosoler. Humant Q-feber manifesterer enten som en akutt eller kronisk sykdom, noe som kan ha fatale komplikasjoner med en dødelighet nådde 65% 1,3. Med en infeksiøs dose på 1 - 10 organismer, er Coxiella den mest smittsomme organismen kjent, og det er blitt undersøkt som en potensiell biologisk våpen 4. Den nylige eksplosive utbrudd av Q-feber i Nederland (2007 - 2010), med saker økende fra 182 til mer enn 2000 per år, står som et eksempel på alvorlig virulens dette patogenet5.

Den bemerkelsesverdige effektivitet av Coxiella infeksjoner er sannsynligvis forbundet med sin motstand mot miljømessig stress, kombinert med sin unike tilpasning til vertsceller. Faktisk er Coxiella tilstede i miljøet i form av metabolsk inaktive små cellevariantene (SCV), som er bemerkelsesverdig motstandsdyktige mot flere barske forhold (uttørking, temperatur, etc.). Hydraulikkventiler er opp tatt av fagocyttceller via α V β 3 inte 6 mens invasjonen av ikke-fagocyttceller medieres av Coxiella adhesjon / invasjon OmpA 7 og en ennå uidentifiserte reseptor. Etter opptaket, bosatt Coxiella i tettsittende vakuoler, positive for tidlig endosomale markører Rab5 og EEA1 8. Bakterier svare på endosomale forsuring ved å konvertere til metabolsk aktive store celle varianter (varebiler) og aktivere en Dot / Icm type 4 sekresjon system (T4SS) 9, Meget homologe med den i Legionella pneumophila 10. Utskillelsen av Dot / ICM effektorer tillate Coxiella å generere et stort, LAMP1-positive surt rommet inneholder aktive lysosomale enzymer hvor bakterier kan trives og aktivt beskytter infiserte celler fra apoptose 11. Derfor er den intracellulære syklus av Coxiella styres av Dot / Icm-mediert translokasjon av bakterielle effektorer 12 imidlertid den mikrobielle faktorer involvert i vertscellen invasjon, bakteriell replikasjon og spredning av infeksjonen forblir stort sett ukjent.

Kombinere transposon mutagenese og fluorescens-baserte analyser, utvikler vi objektive tilnærminger for samtidig identifisering av bakterielle faktorer involvert i de viktigste trinnene i Coxiella infeksjoner: 1) internalisering innenfor vertsceller, 2) intracellulær replikering, 3) celle-til-celle spredning og 4) utholdenhet. Hittil har vi vist over 1000 mutations i 500 Coxiella sekvenser, som ga oss med enestående innsikt i verts-patogen interaksjoner som regulerer Coxiella patogenesen 7. Av notatet, kan denne tilnærmingen brukes til studier av andre intracellulære patogener som deler cellebiologiske funksjoner med Coxiella.

Protocol

1. Generering av et bibliotek av GFP-merket Coxiella transposon mutanter

Manipulere Coxiella burnetii RSA439 NMII i en biosikkerhet inneslutningsnivå 2 (BSL-2) i en mikrobiell sikkerhetskabinett (MSC) i samsvar med lokale regler. Hvis kompatibel med bakteriell modell som brukes, for å gjenta skritt fra 1.4.1 til 1.4.4 øke sannsynligheten for å få clonal mutanter. En typisk mutant bibliotek er sammensatt (i det minste) av en rekke mutanter som er lik tre ganger antallet kodende sekvenser kommenterte i genomet til organismen som brukes.

  1. Utarbeidelse av elektrokompetente Coxiella RSA439 NMII:
    1. Forbered 1x ACCM-2 13: 13,4 mM sitronsyre, 16,1 mM natriumcitrat, 3,67 mM kaliumfosfat, 1 mM magnesiumklorid, 0,02 mM kalsiumklorid, 0,01 mM jernsulfat, 125,4 mM natriumklorid, 1,5 mM L-cystein, 0,1 g / L Bacto Neopeptone, 2,5 g / l kasaminosyrer, 1 g / l methyl-beta cyklodekstrin, 125 ml / l RPMI. Juster pH til 4,75 og filter sterilisere (ikke autoklaver). Merknad: Væske ACCM-2 er stabil ved 4 ° C i omtrent 1 måned.
    2. Inokulere 100 ml ACCM-2 med 2 x 10 6 genomet tilsvarende (GE) / ml av Coxiella RSA439 NMII (fra et bakterielt lager tidligere generert og kvantifisert som i trinn 1.5) fra -80 ° C bestander og fordele den bakterielle suspensjonen i 75 cm2 cellekulturflasker med ventilerte caps (10 - 15 ml bakteriesuspensjon per kolbe). Vokse i 7 dager ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO2 og 2,5% O 2.
    3. Pool den resulterende bakteriesuspensjon i 50 ml rør og sentrifuger ved 3900 xg i 1 time ved 4 ° C.
    4. Kast supernatanten og resuspender pelleten i 30 ml 10% glycerol. Sentrifuger ved 3900 xg i 1 time ved 4 ° C.
    5. Resuspender pellet i et tilstrekkelig volum av 10% glycerol (typisk 2 ml) og 50 ul aliquot på 500 pl rør. Hold resuspenderte bacteria på is under hele prosessen. Merk: På dette stadiet, bakterier er elektrokompetente og en delmengde er tilstrekkelig til å utføre en elektroporering. De bakteriesuspensjoner kan oppbevares ved -80 ° C i 6 måneder eller brukes direkte for elektroporering av plasmid DNA.
  2. Electroporation av kompetent Coxiella med transposon- og transposase-koding plasmider:
    Merk: for følgende protokollen, er det transposable elementet og transposase kodet av to forskjellige plasmider (pITR-CAT-GFP og pUC19-Himar1C9 henholdsvis) 7. Begge plasmider mangler en Coxiella spesifikke replikering opprinnelse, noe som gjør dem selvmords plasmider når elektroporert i Coxiella. Dette sikrer stabile transposon innsettinger. Den transportabelt element som inneholder en motstand Chloramphenicol kassett under regulering av Coxiella promoteren p1169 for seleksjon og GFP-genet under regulering av Coxiella promoter P311 for å merke de genererte mutanter med GFP.
    1. Pre-kjøle en 0,1 cm elektroporeringskyvette i 10 minutter på isen. Bland 50 ul av elektrokompetente Coxiella med 10 mikrogram transposonet plasmid og 10 mikrogram av transposase plasmid 7. Påse at plasmid konsentrasjonen er høyere enn 500 ug / ml for å minimalisere fortynning av glycerol.
    2. Electroporate bruker følgende oppsett: 18 kV, 500 Ω, 25 uF. Sørg for at den resulterende tidskonstanten er mellom 9 og 13 msek.
    3. Tilsett umiddelbart 950 ul av RPMI, resuspender elektroporerte bakterier og overføre til en skrukork og hold ved romtemperatur.
    4. Ta 200 ul av elektroporerte bakterier og tilsett 3 ml ACCM-2 supplert med 1% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS) i 6-brønns plater. Legg 88 mL av DMSO til det gjenværende volumet av elektroporerte bakterier (for å oppnå en endelig konsentrasjon på 10% DMSO) og oppbevares ved -80 ° C.
  3. Valg av transposon-mutanter:
    1. Incubate 6-brønns plater ble inokulert som beskrevet ovenfor (1.2.4) over natten ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO2 og 2,5% O 2. Legg til de egnede antibiotika (375 ug / ml kanamycin eller 3 ug / ml kloramfenikol). Inkuber bakteriekultur i ytterligere 3 dager under de forholdene som er beskrevet ovenfor.
  4. Isolering av individuelle mutanter:
    1. Utarbeidelse av faste ACCM-2 plater og plating av Coxiella transposon mutanter
      Merk: Følgende instruksjoner er for en petriskål, flere fortynninger av bakteriekulturer må testes for å vurdere optimal vaksinasjonen volumet for kolonien isolasjon.
      1. Varm 10,5 ml 0,5% agarose i en mikrobølgeovn og la den avkjøles i en 55 ° C vannbad. Varm 11.25 ml av 2x ACCM-2 (pH 4,75) ved 37 ° C.
      2. Forbered bunnen agarose:
        1. Bland 10 ml smeltet 0,5% agarose med 10 ml 2x ACCM-2 og legg de aktuelle antibiotika (375 mikrogram / ml kanamycin eller 3ug / ml kloramfenikol).
        2. Hell straks inn i petriskål. Hold petriskål unlidded, la medium kjølig i 30 minutter og lufttørke i 20 min.
      3. Forbered toppagarose:
        1. Bland 1,25 ml av 2x ACCM-2 med 0,75 ml vann i en 5 ml polystyrenrør, tilsett de riktige antibiotika (375 ug / ml kanamycin eller 3 ug / ml kloramfenikol) og inkuber ved 37 ° C.
        2. Tilsett bakteriekultur (vanligvis 1 til 100 ul) og vortex i 5 sek.
        3. Legg 0,5 ml smeltet agarose, mikse og umiddelbart hell på bunnen agarose.
        4. Avkjøl i 20 min, sett på lokket på petriskålen og inkuberes ved 4 ° C i 20 min for å lette agarose størkning.
        5. Lufttørke i 20 min unlidded i et MSC. Dyrk plater ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO2 og 2,5% O 2 i 6 til 7 dager.
    2. Legg DMSO til de gjenværende bakterierl kulturer for å oppnå en endelig konsentrasjon på 10% DMSO og oppbevar ved -80 ° C.
    3. Vurdere optimal utvanning som følger: sikre at koloniene er 0,5 til 1 mm i diameter og er skikkelig isolert for å unngå krysskontaminering. Tine resterende bakteriekulturer fra punkt 1.4.2 og plate på riktig fortynning på ACCM-2 agar som beskrevet i 1.4.1.2 og 1.4.1.3. Inkuber i 6 til 7 dager som beskrevet i 1.4.1.3.5.
    4. Når koloniene er detekterbare, samle dem ved å kutte enden av en 1 ml spiss, plukke ut pluggen som inneholder isolerte kolonier og dispergering av kolonien ved pipettering i 1,5 ml ACCM-2 inneholdende de egnede antibiotika (375 ug / ml kanamycin eller 3 ug / ml kloramfenikol) i en 24-brønns plate. Forsterke enkelte kolonier i 6 dager i vilkårene som er beskrevet i 1.3.1. På dag 3 av inkubasjonen spre bakterielle klumper ved å pipettere hver kultur.
    5. Oppbevar hver mutant suspensjon i 2D strek screwcap rør i 96-brønners plater i 10% DMSO ved -80 ° C.
  5. Evaluering av bakteriekonsentrasjon:
    Merk: de følgende protokoll kan anvendes for å oppnå de vekstkurver bakterie mutanter replikere i axenic medium (se 1.4.4).
    1. Standardkurve forberedelse:
      1. Tilbered en 2 pg / ml stamløsning av dsDNA (vanligvis en tilfeldig plasmid med kjent størrelse og konsentrasjon) i 1 x Tris-EDTA (TE). Forbered 10-gangers seriefortynninger fra stamløsning for å oppnå konsentrasjoner som varierte fra 2 ng / ml til 2 ng / ml. Dispenser 50 ul av hver konsentrasjon til enkeltbrønner i en 96-brønns mikroplate med sorte vegger og bunn (se tabell of Materials).
      2. Fortynn dsDNA kvantifisering reagens 1: 200 i 1 x TE-buffer og tilsett 55 pl av de fortynnede reagens til hver prøve i 96-brønns mikroplate. Bland godt ved hjelp av en platerister og inkuberes i 2 til 5 minutter ved romtemperatur, i mørke.
      3. Mål prøvene fluorescens ved hjelp av en fluornce -mikroplateleser og filtre for standard fluoresceinfamilien bølgelengder (eksitasjon ~ 480 nm, emisjon ~ 520 nm).
      4. Plott plasmidet konsentrasjonsområdet mot fluorescensintensiteten opplesninger.
    2. Bakteriell suspensjon kvantifisering:
      1. Dispenser 5 ul av 10% Triton X-100 per brønn i en 96-brønns mikroplate med sorte vegger og bunn (se tabell of Materials). Tilsett 50 pl av bakteriesuspensjoner til hver brønn og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur på en plateryster.
      2. Fortynn dsDNA kvantifisering reagens 1: 200 i 1 x TE-buffer og tilsett 55 pl av de fortynnede reagens til hver prøve i 96-brønns mikroplate. Bland godt ved hjelp av en platerister og inkuberes i 2 til 5 minutter ved romtemperatur, i mørke.
      3. Mål prøvene fluorescens ved hjelp av en fluorescens mikroplateleser og filtre for standard fluoresceinfamilien bølgelengder (eksitasjon ~ 480 nm, emisjon ~ 520 nm).
      4. For å få den bakterielle DNEn konsentrasjon, plotter fluorescens målinger i diagrammet fås punkt 1.5.1.4. Fordel DNA-konsentrasjonen av massen av Coxiella genomet (2,2 FG) for å oppnå bakteriekonsentrasjoner. Uttrykke resultater i Genome Tilsvar / ml.
      5. Kast mutanter som utviser en betydelig vekst defekt i ACCM-2.

2. Enkelt Primer Colony PCR, sekvensering og annotering

MERK: Følgende protokoll er for DNA forsterkning av 96 prøver, er en multikanalspipette anbefales for de neste trinnene. Kolonne rensing av PCR-produkter ved hjelp av magnetiske kuler og DNA-sekvensering med en transposon spesifikk primer (2.3) er underleverandør til et eksternt selskap.

  1. Kontroller at amplifikasjonsprimer er utformet for å hybridisere mellom 100 og 200 basepar oppstrøms fra den inverterte tandem gjentagelse (ITR), for å oppnå PCR-produkter som dekker transposon innføringsstedet på Coxiellet genom. Forbered 3 ml av PCR-blanding (1 x high fidelity buffer, 200 uM dNTP, 1 uM amplifiseringsprimer, 20 U / ml high fidelity DNA-polymerase) og dispenser 29 ul pr brønn i en 96-brønners PCR-plate satt på is. Transfer 1 mL av hver mutant i stasjonær fase i ACCM-2 til PCR mix.
  2. Kjør PCR med innledende denaturering (98 ° C, 1 min), 20 høystringente sykluser (98 ° C, 10 sekunder; 50 ° C, 30 sek, 72 ° C, 90 sek), 30 sykluser lav stringens (98 ° C, 10 sekunder; 30 ° C, 30 sekunder; 72 ° C, 90 sek) og 30 høye stringens sykluser (98 ° C, 10 sek, 50 ° C, 30 sek, 72 ° C, 90 sek), fulgt av en sluttforlengelse ved 72 ° C i 7 min.
  3. Rense PCR produkter ved hjelp av magnetiske kuler og sekvens DNA med en transposon spesifikk primer. Design av transposon-spesifikk primer med en anslått smeltetemperatur på mellom 50 ° C og 75 ° C, et GC-innhold på mellom 40% og 60%, en lengde mellom 18 og 25 nukleotider og en gløde Site nedstrøms av forsterkningsprimeren hybridisering området og minst 100 basepar oppstrøms fra den første basepar av transposon ITR.
  4. Ved hjelp av sekvensanalyse programvare, laste komplett, kommenterte genomet Coxiella burnetii 493 NMI. Bruk "align til referanse" funksjon for å laste og justere (blastn) sekvenseringsresultatene og bestemme stedet for innarbeiding. Kast mutanter med ikke-matching og / eller vise dobbelt reads.To overvåke metning av mutant bibliotek, holde en oversikt over forekomsten av flere transposon innsett på samme sted.

3. eukaryote celler Utfordre med Coxiella Mutants og Overvåking av Intracellulær Vekst

Merk: En multikanalspipette anbefales for de neste trinnene. Infeksjoner ble utført i tre paralleller i sterile 96-brønns mikroplater med sorte vegger og flat gjennomsiktig bunn. wt Coxiella burnetii uttrykker GFP 14 wsom leveres av Dr. Robert Heinzen.

  1. Grow Vero-celler i RPMI uten fenol rød supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) i fravær av antibiotika (komplett RPMI media).
  2. Dagen før infeksjonen, vasker Vero-celler fra en sammenflytende eller sub-konfluente cellekultur-kolbe med 10 ml PBS.
  3. Løsne Vero-celler ved å tilsette 1 ml av trypsin-EDTA-løsning til cellekulturflaske og inkuberes i 3 til 5 minutter ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO2.
  4. Resuspender cellene i 10 ml av komplett RPMI-medium. Cellene telles og fremstille en cellesuspensjon av 10 5 celler pr ml.
  5. Fordeles 100 ul av cellesuspensjonen i hver brønn av en sort 96-brønners plate med flat gjennomsiktig bunn.
  6. Sentrifuger i 5 minutter ved 400 xg ved romtemperatur for å lette celleadhesjon i bunnen av brønnene og inkuber over natten ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO2.
  7. Tine 96-brønners plater inneholdende Coxiella mutanter ved RT og fortynnet 150 pl av bakteriesuspensjonen i 300 ul av RPMI uten fenol rød, og FBS i en dyp brønn 96-brønns plate.
  8. Fjern media fra mikro inneholder Vero-celler og fordeles 100 ul / brønn utvannet Coxiella mutanter (MOI av 100). Bruk godt A1 som negative (ikke-infiserte celler) kontroll og brønn A2 og A3 som positive kontroller (celler infisert med wt Coxiella uttrykker GFP 14 ved multiplisiteter av infeksjoner (MOI) på 100 og 200).
  9. Sentrifuger plate i 10 minutter ved 400 x g ved romtemperatur ved hjelp av en aerosol tett sentrifuge plateholderen.
  10. Inkuber ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO2 i 2 timer, deretter erstatte bakterieholdig medium med 100 ul / brønn av friskt, komplett RPMI-medium.
  11. Mål GFP fluorescens hverdagen for 7 dager ved hjelp av en fluorescens mikroplateleser og filtre for standard fluoresceinfamilien bølgelengder (eksitasjon ~ 480 nm, emisjon ~ 520 nm). Å unngåforstyrrelser på grunn av kondensasjon og signal-dispersjon i kulturmediet ved å bruke bunn eksitasjon og emisjon opptak på mikroplateleser.

4. Utarbeidelse av Prøver for Automated Image Acquisition

Merk: Fremgangsmåten er for en 96-brønns plate, skalere opp volumer tilsvarende. Trinn fra 4.2 kan dra nytte av en platevasker.

  1. På den 7. dag etter infeksjon, fjernes mediet fra platen og erstatte den med 50 ul / brønn av friskt, komplett medium inneholdende en celle-gjennomtrengelig fluorescerende fargestoff ved passende fortynning (som regel 1: 1 000, for å bli optimalisert i henhold til den anvendte cellelinjen ). Inkuber cellene i 30 - 60 min ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO2.
  2. Skift medium med 50 ul / brønn av 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS, inkuberes i 30 minutter ved romtemperatur (RT) og fjern deretter PFA-inneholdende buffer og vask tre ganger med PBS.
  3. Fjern PBS og dispensE 50 ul / brønn blokkeringsløsning (0,5% bovint serumalbumin, 50 mM NH4CI i PBS, pH 7,4) supplert med 0,05% saponin. Inkuber ved romtemperatur i 30 min.
  4. Erstatt blokkeringsløsning med 40 pl / brønn av friskt blokkeringsløsning supplert med saponin (som ovenfor) og med en anti-LAMP1 antistoff ved en 1: 500 fortynning. Inkuber platen i 30 minutter ved RT.
  5. Fjern blokkeringsløsning og vask den 96-brønns plate fem ganger med 100 ul / brønn PBS.
  6. Dispenser 40 ul / brønn blokkeringsløsning supplert med saponin (som ovenfor), det passende fluorescensmerket sekundært antistoff (ved en fortynning på 1: 1000) for å vise anti-LAMP1 antistoff anvendt i trinn 4.4, og med Hoechst 33258 på 5 ug / ml. Inkuber platen i 30 minutter ved RT.
  7. Fjern blokkeringsløsning og vask den 96-brønns plate fem ganger med 100 ul / brønn PBS. La volumet av PBS som svarer til den siste vask i 96-brønns plate, som de fikserte celler ikke skal tørke ut.
  8. Bilde platen umiddelbart eller butikk platen ved 4 ° C, beskyttet fra lys, for etterfølgende analyse.

5. Image Acquisition

  1. Hente bilder i GFP (488 nm, bakterier), Hoechst 33258 (350 nm, vertscellekjerner), rød (~ 555 nm, cellemembranen markør) og langt rødt (~ 615 nm, LAMP1) kanaler som bruker en epifluorescence automatisert mikroskop utstyrt med en 20X objektiv. Erverve 21 selvstendige felt per brønn for å avbilde et minimum på 5000 celler per prøve. Påfør autofokusering ved hjelp av vertscellen kjerner kanal som referanse. Når det arbeides med bakterielle patogener infisere en lav prosentandel av vertscellene, kan brukeren justere antall uavhengige felter avbildes per brønn, for å oppnå et minimum av 500 infiserte celler for å analysere.

6. Bildebehandling

MERK: Følgende trinn er spesifikke for bruk av bildeanalyse programvare CellProfiler. I alle tilfeller, den optimale algorithm for segmentering må defineres eksperimentelt og objektene berører kanten av bildet skal bli eliminert sammen med den aktuelle funksjonen.

  1. Last alle bilder i CellProfiler.
  2. Bruk modulen "ImageMath" for å trekke GFP kanalen fra Hoechst kanal, for å unngå å bli oppdaget av Coxiella kolonier (også merket med Hoechst) som vertscellekjerner i følgende trinn.
  3. Bruk modulen "IdentifyPrimaryObjects" til segment vertscellekjerner fra den resulterende bildet av trinn 6.2. Nevn de segmenterte objekter "kjerner".
  4. Bruk modulen "IdentifySecondaryObjects" til segment vertsceller fra 555 nm bilder med kjerner som oppdages ved trinn 6.3 som frø. Nevn de segmenterte objekter "celler".
  5. (Valgfritt) Bruk modulen "IdentifyTertiaryObjects" for å trekke kjerner identifiserte i trinn 6.3 fra celler som er identifisert i trinn 6.4. Nevn de segmenterte objekter "Cytoplasm221 ;.
  6. Bruk modulen "EnhanceOrSuppressFeatures" på 615 nm bildene for å fjerne bakgrunnen og legge til rette for følgende identifikasjon av LAMP1-positive avdelinger.
  7. Bruk modulen "IdentifyPrimaryObjects" på bildet oppnådd i trinn 6.6 til å identifisere LAMP1-positive avdelinger. Nevn de segmenterte objekter "lysosomer".
  8. Bruk modulen "IdentifyPrimaryObjects" på 488 nm bildet for å identifisere Coxiella kolonier. Nevn de segmenterte objekter "Colonies".
  9. Bruk modulen "IdentifySecondaryObjects" på 615 nm bilder for å identifisere Coxiella holdig vakuoler hjelp av Coxiella koloniene oppdaget ved trinn 6.8 som frø. Nevn de segmenterte objekter "CCVs".
  10. Bruk modulen "MaskObjects" for å velge CCVs oppdaget på celler (som celler berører grensen av bildet er eliminert, kan enkelte CCVs bli oppdaget "utenfor" celler). Nevn de resulting objekter "Filtrert CCVs".
  11. Bruk modulen "MaskObjects" for å velge Colonies oppdaget på celler (som celler berører grensen av bildet er eliminert, kan enkelte Colonies bli oppdaget "utenfor" celler). Nevn de resulterende objekter "Filtrert Colonies".
  12. Bruk modulen "MaskObjects" for å knytte lysosomer til celler. Nevn de resulterende objekter "filtrert lysosomer".
  13. Bruk modulen "MaskObjects" for å velge celler som inneholder Coxiella kolonier. Nevn de resulterende objekter "infiserte celler".
  14. Bruk modulen "Relate Objects" for å sette objektene "Filtrert CCVs" som barn av den overordnede objekter "celler". Dette gjør det mulig å telle antallet CCVs / celle.
  15. Bruk modulen "Relate Objects" for å sette objektene "Filtrert Colonies" som barn av den overordnede objekter "celler". Dette viltillate telling av antall kolonier / celle.
  16. Bruk modulen "Relate Objects" for å sette objektene "filtrert lysosomer" som barn av den overordnede objekter "celler". Dette gjør det mulig å telle antallet lysosomer / celle.
  17. Bruk modulen "MeasureObjectSizeShape" for å få en morfologisk analyse av kjerner, celler, filtrert CCVs, filtrert Colonies og filtrert lysosomer
  18. Bruk modulen "MeasureObjectIntensity" for å kvantifisere GFP fluorescens forbundet med filtrert CCVs og beregne effektivitet Coxiella replikering innen CCVs.
  19. Bruke moduler "OverlayOutlines" og "SaveImages" overlapper segmentering resultater og originalbildet for kvalitetskontroll.
  20. Bruk modulen "ExportToSpreadsheet" å eksportere alle eller et utvalg av bildeanalyseresultater.
  21. (Valgfritt) Bruk modulen "ExportToDatabase" for å analysere resultatenebruke programvaren CellProfiler Analyst.

7. Data Analysis

  1. For hver parameter innhentet, identifisere og eliminere uteliggere (på grunn av feil i bildesegmentering) deretter beregne gjennomsnittsverdiene per mutant.
  2. Bruk Z-score for å identifisere viktige fenotyper. Vurdere fenotyper med en Z-score> -2 som ikke-signifikant, fenotyper med en Z-score mellom -2 og -4 som mild og fenotyper med en Z-score ≤ -4 så sterk.
  3. Plot kombinasjoner av parametere i henhold til eksperimentelle behov.

Representative Results

Ved isolering av transposon mutanter, er singel primer koloni PCR en robust, high-throughput metode for å identifisere stedet av transposoninsersjon for hver mutant. Denne tilnærmingen stammer fra en typisk nestet PCR-protokollen, men her en enkelt primer hybridiserer spesifikt og / eller ikke-spesifikt til templat-DNA, avhengig av stringensen av glødetemperaturen (figur 1A). Den typiske PCR-produkter består av flere DNA-fragmenter, hvorav de fleste er bestemt (figur 1B). Bruken av en annen sekvense primer som hybridiserer rett oppstrøms av transposonet ITR, og nedstrøms av sekvensen gjenkjent av amplifikasjonsprimer gir spesifisitet for sekvensering trinn (figur 1C). Automatisert programvare for sekvensanalyse justerer innhentet sekvenser til Coxiella genomet gir nøyaktig åsted for transposon innsett (figur 1C). Alle transposon innsett kan være så annotated på Coxiella genomet (figur 1D).

Hver Coxiella mutant er isolert og amplifisert axenically i ACCM-2 medium enten før lagring eller screening. Figur 2 illustrerer et eksempel på 38 transposon-mutanter i 16 punkter / ICM Coxiella gener (figur 2A). For å vurdere levedyktigheten til Coxiella mutanter, er axenic vekstkurver oppnådd ved prøvetaking bakteriekulturer i 7 dager etter inokulering, og påføring av bakteriekonsentrasjon analysen beskrevet i 1.5 (Figurie 2B). Amplifiserte mutanter blir deretter inkubert med epitelceller, i triplikate 96-brønners plater i 7 dager. Alle Coxiella mutanter som genereres blir GFP-merket, blir intracellulære vekstkurver oppnådd ved å måle GFP fluorescensintensiteten til hver brønn, hver 24. time, og plotte de målte verdiene som en funksjon av tid (figur 2C).

Intracellulære vekstkurver gi kvantitativ analyse av fenotypene assosiert med hvert transposon innsetting i Coxiella genomet. For å legge til kvalitativ informasjon om de samme transposon mutanter, vi har valgt for automatisert bilde oppkjøpet og analyse. Syv dager etter infeksjon, platene er løst, behandlet for immunfluorescens som beskrevet i fire og analysert ved hjelp av en automatisert, epifluorescence mikroskop som beskrevet i 5. Automatisert bildeanalyse programvare som CellProfiler (Broad Institute, www.cellprofiler.com ) behandler de oppkjøpte kanaler selvstendig og segmentene identifiseres objekter for komparativ analyse (figur 3). Dette gjør at identifisering og morfologiske karakterisering av vertscellekjerner, celle konturer, lysosomer og Coxiella kolonier (figur 3 øverste panelene). Korrelere Coxiella kolonier med celler og lysosomene tillater identifikasjonpå og bestemt morfologisk analyse av Coxiella holdige vakuoler (som er LAMP1 positive, Figur 3 nedre venstre panel). Korrelere Coxiella kolonier med vertscelle konturer gjør identifisering og spesifikk morfologisk analyse av infiserte celler (figur 3 nederst i midten panel). Til slutt blir de fire kanalene slått sammen for illustrasjon og kvalitetskontroll (figur 3 nederst til høyre panel).

Data innhentet fra automatisert bildeanalyse kan plottes mot hverandre for å oppnå "multi-fenotypiske spredningsplott". Som et eksempel er på figur 4A gjennomsnittlig areal (i mikrometer 2) av Coxiella kolonier plottet mot antall kolonier per celle (figur 4A), for å identifisere mutasjoner som påvirker intracellulær replikasjon av Coxiella (replikasjon fenotype) og / eller kapasiteten av bakterier for å invadere vertsceller (internalization fenotype). Statistisk analyse ble brukt for å definere områder i den resulterende punktplott tilsvarende milde (-4 <Z-score ≤ -2) og alvorlig (Z-score ≤ -4) fenotyper. Mutantene ble observert i tre hoved klynger: mutasjoner som resulterte i en defekt intracellulær vekst av Coxiella ble gruppert i venstre meste av tomten (Figur 4A, rosa og røde prikker); mutasjoner som påvirket Coxiella intern i celler ble gruppert i den nederste delen av tomten (Figur 4A, lys og mørk blå prikker) og til slutt, grønne prikker i lengst til høyre region av tomten tilsvarer mutasjoner som resulterer i ikke-signifikante fenotyper ( Z-score> -2). Viktigere, mutanter som ikke klarer å gjenskape, men er fortsatt i stand til å invadere vertsceller, blir oppdaget etter 7 dager på infeksjon som enkelt bakterier, eller små kolonier, som grenser til å være vert cellekjerner (Figur 4C, andre panel). Derfor er størrelsen av Coxiella "Coloskapene "vil bli vesentlig påvirket, men antallet infiserte celler vil ikke variere sammenlignet med WT Coxiella -infected celler. Tvert imot, mutasjoner som påvirker kapasiteten Coxiella å invadere vertsceller resulterer i en reduksjon i antall kolonier / celle. Når denne verdien er betydelig under en, indikerer det at det i gjennomsnitt er en reduksjon i det totale antall infiserte celler. Alternativt kan den gjennomsnittlige området (i mikrometer 2) av Coxiella kolonier bli plottet mot antall vertsceller overlever infeksjon (figur 4B), for å identifisere mutasjoner som cytotoksisitet til Coxiella (cytotoksisk fenotype). Som ovenfor, ble statistisk analyse brukes for å definere områder i den resulterende punktplott tilsvarende milde (-4 <Z-score ≤ -2) og alvorlig (Z-score ≤ -4) fenotyper. Mest skjermet mutasjoner hadde ingen betydelig innvirkning celle overlevelse, uavhengig av bakteriell replikasjon i vertsceller (Figur 3B grønne prikker). 37 mutasjoner lett affisert vertscelleoverlevelse (Figur 3B, lyse røde prikker), og 7 mutasjoner var spesielt skadelig å være vert for celle overlevelse (figur 3B, mørke røde prikker). Vær oppmerksom på at flere parametere som oppnås ved den automatiserte bildeanalyseprosedyre kan benyttes til å utlede andre diagrammer, i henhold til eksperimentelle behov.

Figur 1
Figur 1:. Sequencing og annotering av Coxiella transposon mutanter (A) Enkelt primer koloni PCR brukes til å forsterke DNA-fragmenter som inneholder stedet transposoninsersjon. En amplifikasjonsprimer (Amp) brukes både som en spesifikk og ikke-spesifikk primer avhengig av stringensen av glødetemperatur. (B) Typisk resultat av enkelt primer koloni PCR. Hver Reactipå produserer en rekke fragmenter av variabel størrelse, hvorav noen inneholder transposonet innføringsstedet; noen andre er tilfeldig forsterket som biprodukter av lav stringens PCR-syklus. (C) Bruk av en sekvense primer (Seq) som hybridiserer til transposonet sekvensen tillater sekvensering av fragmentene av interesse. (D) Sekvens analyse programvare tillater automatisk annotering av transposon innsett på bakteriegenomet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Fig. 2: Axenic og intracellulær vekst av Coxiella transposon-mutanter (A) I pilotskjermen, har vi isolert, sekvensert og vist 38 transposon-mutanter i 16 kjerne gEnes av Coxiella punkter / ICM sekresjon system (angitt i rødt). (B) For å vurdere levedyktigheten til hvert transposon mutant, veksten av hvert isolat i axenic kulturmediet overvåkes i løpet av 8 dager ved hjelp av et fluorescens-merket DNA-interkalerende middel. (C) hver mutant blir deretter anvendt for å infisere epitelceller. Som transposonet besitter en GFP kassett, er intracellulær bakterievekst overvåkes over 7 dager etter smitte ved å følge varianter av GFP fluorescens forbundet med Coxiella replikering, ved hjelp av en mikroplateleser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Automatisert bildeanalyse av Coxiella infeksjoner An auto.parret epifluorescens mikroskop brukes til å avbilde posisjonene 21 per brønn i triplikat 96-brønners plater. De bildeanalyse programvare segmenter objekter i hver kjøpt kanaler for kvantifisering og analyse. I alle tilfeller, blir objektene berører kanten av bildene utelukket. (A) Hoechst-kanalen brukes til å identifisere vertscellekjerner (markert med grønt). (B) Disse brukes som frø for å identifisere vertscelle konturer i Cy3 kanal (posisjon kjerner er sirkel i blått, celle konturer er i grønt). (C) Den Cy5 kanalen brukes til å identifisere LAMP1-positive avdelinger (innringet i grønt); bare de objektene som inngår i de tidligere identifiserte celle konturer (i rødt) blir beholdt til bildeanalyse. (D) Den GFP-kanalen brukes til å identifisere Coxiella kolonier (markert med grønt). (E) Korrelere Coxiella kolonier med LAMP1-positive avdelinger tillater identifisering av Coxiella (F) Korrelere Coxiella kolonier med celle konturer gjør identifisering av infiserte celler (pseudocolored). (G) Bilder ervervet i de 4 fluorescens kanaler (tilsvarende Coxiella kolonier (grønn), vertscellekjerner (blå), vertscellen plasmamembran (grå), LAMP1-positive avdelinger (rød)) er slått sammen og brukes til illustrasjon og kvalitet kontroll. Skala barer 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Storskala identifisering av Coxiella faktorer involvert i vert / patogen samhandler-ioner. (A) Den gjennomsnittlige området (i mikrometer 2) av Coxiella kolonier er plottet mot den relative antall kolonier per celle, for å identifisere replikering og internalisering fenotyper av interesse. Grønne prikker representerer fenotyper som avviker fra WT Coxiella av en Z-score> -2 (ikke signifikant). Rosa og lyseblå prikker representerer replikering og internalise fenotyper henholdsvis med en Z-score mellom -2 og -4 (mild fenotyper). Røde og mørke blå prikkene representerer fenotyper med Z-score ≤ -4 (sterke fenotyper). (B) Den gjennomsnittlige området (i mikrometer 2) av Coxiella kolonier ble plottet mot det totale antall celler (infiserte og ikke infiserte) som overlevde 7 dager etter infeksjon for å estimere den cytotoksiske virkning som følge av transposon innsettinger. Grønne prikker representerer fenotyper som avviker fra WT Coxiella av en Z-score> -2 (ikke signifikant). Rosa prikker representerer cytotoksiske phenotypes med en Z-score mellom -2 og -4 (mild fenotyper). Røde prikker representerer cytotoksiske fenotyper med Z-score ≤ -4 (sterke fenotyper). Pilene viser mutanter illustrert av den tilsvarende liten bokstav i C. (C) Representative bilder av replikering, intern og cytotoksiske fenotyper. I alle tilfeller, vertscellekjerner er i rødt, Coxiella koloniene er i grønt. Skala barer 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Studiet av vert / patogen interaksjoner har vist seg å være en bemerkelsesverdig måte å forstå bakterielle infeksjoner og utvikle alternative strategier for å motvirke smittsomme sykdommer. Men på grunn av mangfoldet av strategier utarbeidet av forskjellige bakterielle patogener, identifisering og karakterisering av bakteriell virulens faktorer og av verten signalveier som er rettet ved infeksjoner, representerer en virkelig utfordring. Dette krever utvikling av nye metoder for storskala identifisering av viktige vert / patogen interaksjon huber. Den siste utviklingen av innovative, høy gjennomstrømming og høy innholdsscreeningteknikker representerer en uvurderlig ressurs som kan tilpasses til studiet av intracellulære bakterielle patogener 15. Her har vi brukt den zoonotisk bakterie patogen Coxiella burnetii som modell for å utvikle screening tilnærminger som kombinerer transposon mutagenese og fluorescens-basert analyser. Importantly, gjør dette screening metoden samtidig overvåking av flere trinn av Coxiella intracellulære syklus, og gir en global oversikt over de strategier utviklet av denne bakterien å invadere, replikere og vedvare i infiserte celler.

Den metode som er beskrevet her, er basert på to veletablerte teknikker, transposon-mutagenese og fluorescens-baserte analyser, noe som har blitt brukt til studiet av bakterielle patogener. Ved å kombinere disse teknikkene i sammenheng med høy gjennomstrømming / høyt innhold av skjermer gjør det mulig å evaluere effektene av et høyt antall av bakterielle mutasjoner ved å analysere et meget høyt antall hendelser (typisk 15 000 infiserte celler per bakterie mutasjoner blir avbildet og analysert). Dette gir et viktig statistisk analyse av hendelser som bakteriell invasjon av vertsceller og intracellulær replikering, som er, av natur, utsatt for høy variabilitet. Det er viktig å merke seg at andre cellelinjer enn epithelial kan anvendes for denne type screening. Imidlertid flate og store epitelceller er optimale for bildeanalyse som vertscelleorganeller, er lettere å oppdage. Fordi flertallet av automatiserte mikroskoper kan automatisk håndtere et stort antall plater, det er nesten ingen grenser for antall mutanter som kan bli vist samtidig. Avhengig av patogen, kan brukeren rettighet bruk av en epifluorescens eller et konfokalt mikroskop. Tidspunktet for bildeopptak vil for det meste avhenge av følsomheten av mikroskopet kameraet på antall felter ervervet per brønn, og på antall kanaler ervervet pr synsfelt. Brukeren kan bestemme hvordan du vil justere disse faktorene for å optimalisere screening-protokollen. Som et eksempel, avbildes vi en 96-brønns plate / time ved hjelp av de betingelser som er angitt i punkt 5.1. Bildeanalyse stor grad avhenger av maskinen (eller klynge av maskiner) benyttes. Vi bruker en 12-core (2 x 3.06 GHz 6-Core), 48 GB RAM arbeidsstasjon. Denne maskinen krever approxilag 40 min å analysere bilder ervervet fra en plate.

Et viktig aspekt som må tas i betraktning ved utvikling av disse analyser er det satt opp av ny (eller optimaliseringen av eksisterende) protokoller for å tillate manipulering og behandling av et stort antall prøver. Et typisk eksempel er utviklingen av en enkelt koloni PCR primer tilnærming, som tillot oss å forsterke og hurtig rekkefølge Coxiella DNA-fragmenter som inneholder stedet for innsetting av hvert transposon, fra meget små prøver. Basert på vår erfaring, har high-fidelity polymerase å være nøye utvalgt og testet for å oppnå reproduserbare resultater. Den eneste begrensning av denne tilnærmingen kan gjemme seg i den observasjon at, i de fleste tilfeller omtrent 30% av de behandlede prøvene er ikke utnyttes, enten på grunn av PCR eller sekvenseringsfremgangsmåten. Men tatt i betraktning at isoleringen av nye Coxiella transposon-mutanter er ikke et hastighetsbegrensende trinn, er dette ikke represendte et stort problem. Likeledes er utviklingen av en pålitelig analyse for å kvantifisere bakteriekonsentrasjon av mutante varelageret nøkkel for denne tilnærmingen. På grunn av tendensen til å aggregere Coxiella når i suspensjon, er bruken av optiske tetthetsavlesninger ikke anvendelig for å beregne konsentrasjonen av Coxiella kulturer og den eneste eksisterende alternativ var kvantitativ PCR (qPCR). Her, ved bruk av en fluorescerende merket DNA-interkalerende middel betydelig fremskyndet bakterier kvantifisering.

Denne fremgangsmåten kan også dra nytte av anvendelse av stabile cellelinjer som uttrykker fluorescerende markører for flere intracellulære avhengig av patogenet som brukes. Et annet viktig aspekt er anvendelse av cellekulturmedier blottet for fenolrødt. Vi observerte at denne pH-indikator har en naturlig fluorescens spenner den røde og grønne spekteret som metter signal registreres på den automatiserte fluorescens leseren.

THan strategi presenteres her er avhengig av tilfeldig transposon mutagenese. For mutantene av interesse, anbefaler vi å validere unike trans (og klonalitet) ved hjelp av Southern blot og PCR presiseringer av transposoninsersjon nettstedet.

Foruten utstyret som er beskrevet i protokollen delen, lag interessert i å bruke screening tilnærmingen presenteres her, vil ta stor fordel i oppsettet av en relasjonsdatabase for datainnsamling, en server for datalagring og en arbeidsstasjon for rask bildeanalyse.

Viktigere er fremgangsmåten som her er beskrevet er egnet for studier av andre intracellulære bakterielle patogener gitt et tilfeldig mutagenese metode finnes for patogenet, kan cellelinjer bli smittet av organismen, og dette viser en bestemt fenotype ved infeksjon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Citric acid Sigma C0759-500G ACCM-2 medium component
Sodium citrate Sigma S4641-500G ACCM-2 medium component
Potassium phosphate Sigma 60218-100G ACCM-2 medium component
Magnesium chloride Sigma M2670-100G ACCM-2 medium component
Calcium chloride Sigma C5080-500G ACCM-2 medium component
Iron sulfate Sigma F8633-250G ACCM-2 medium component
Sodium chloride Sigma S9625-500G ACCM-2 medium component
L-cysteine Sigma C6852-25G ACCM-2 medium component
Bacto Neopeptone BD (Beckton-Dickinson) 211681 ACCM-2 medium component
Casamino acids BD (Beckton-Dickinson) 223050 ACCM-2 medium component
Methyl-B-cyclodextrin Sigma C4555-10G ACCM-2 medium component
RPMI w/glutamax Gibco 61870-010 ACCM-2 medium component
RPMI w/glutamax, without phenol red Gibco 32404-014 For cell culture and infection
Fetal bovine serum GE healthcare SH30071 For cell culture
Trypsin EDTA (0.25%) Life Technologies 25200-056 For cell culture
Saponin Sigma 47036 For immunofluorescence staining
Ammonium chloride Sigma A9434 For immunofluorescence staining
Bovine serum albumin Sigma A2153 For immunofluorescence staining
Electroporation cuvette 0.1 cm Eurogentec ce0001-50 For Coxiella transformation
Trackmates screw top tubes with caps Thermo Scientific 3741 2D barcoded screwcap
96-well microplate with black walls and bottom Greiner 655076 Flat dark bottom, for dsDNA quantitation
96-well PCR microplate Biorad 2239441 DNAse/RNAse free
96-well plate, deepwell Labcon 949481 For Coxiella mutants infections
PicoGreen Life Technologies P7581 For dsDNA quantitation
Triton X-100 Sigma T9284-500ML For dsDNA quantitation
Phusion high fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0530L For single primer colony PCR
Celltracker Red CMTPX Life Technologies C34552 For imaging
Anti-LAMP1 antibody Sigma 94403-1ML For immunofluorescence staining
Hoechst 33258 Sigma L1418 For imaging
Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro Tecan
Epifluorescence automated microscope Cellomics Thermo Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maurin, M., Raoult, D. Q fever. Clinical microbiology reviews. 12, (4), 518-553 (1999).
  2. Kim, S. G., Kim, E. H., Lafferty, C. J., Dubovi, E. Coxiella burnetii. in bulk tank milk samples, United States. Emerging infectious diseases. 11, 619-621 (2005).
  3. Kazar, J. Coxiella burnetii. infection. Annals of the New York Academy of Sciences. 1063, 105-114 (2005).
  4. Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. Q fever: a biological weapon in your backyard. The Lancet infectious diseases. 3, 709-721 (2003).
  5. Der Hoek, W. V. an, et al. Epidemic Q fever in humans in the Netherlands. Advances in Experimental Medicine and Biology. 984, 329-364 (2012).
  6. Capo, C., et al. Subversion of monocyte functions by Coxiella burnetii.: impairment of the cross-talk between alphavbeta3 integrin and CR3. Journal of immunology. 163, (11), Baltimore, Md. 6078-6085 (1999).
  7. Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. Identification of OmpA, a Coxiella burnetii. protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening. PLoS pathogens. 10, (3), e1004013 (2014).
  8. Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Berón, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii. to efficiently replicate in the host cell. Cellular microbiology. 9, (4), 891-909 (2007).
  9. Newton, H. J., Mcdonough, J. a, Roy, C. R. Effector protein translocation by the Coxiella burnetii. Dot/Icm type IV secretion system requires endocytic maturation of the pathogen-occupied vacuole. PloS one. 8, (1), e54566 (2013).
  10. Vogel, J. P. Turning a tiger into a house cat: using Legionella pneumophila. to study Coxiella burnetii. Trends in microbiology. 12, (3), 103-105 (2004).
  11. Van Schaik, E. J., Chen, C., Mertens, K., Weber, M. M., Samuel, J. E. Molecular pathogenesis of the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii. Nature reviews. Microbiology. 11, 561-573 (2013).
  12. Beare, P. A., et al. Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages. mBio. 2, (2011).
  13. Omsland, A., et al. Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii. are facilitated by an improved axenic growth medium. Applied and environmental microbiology. 77, (11), 3720-3725 (2011).
  14. Beare, P. a, Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. a Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens. Frontiers in microbiology. 2, (May), 97 (2011).
  15. Brodin, P., Christophe, T. High-content screening in infectious diseases. Current opinion in chemical biology. 15, (4), 534-539 (2011).
Generasjon og Multi-fenotypiske Høy innhold Screening av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martinez, E., Cantet, F., Bonazzi, M. Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants. J. Vis. Exp. (99), e52851, doi:10.3791/52851 (2015).More

Martinez, E., Cantet, F., Bonazzi, M. Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants. J. Vis. Exp. (99), e52851, doi:10.3791/52851 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter