Abstract
Текущие расследования фага принимающих взаимодействий зависят от экстраполяции знания из (мета) геномов. Интересно, что 60 - 95% всех последовательностей фага не имеют ни гомологию с текущим аннотированных белков. В результате, большая часть генов фага выделяются, как гипотетический. Эта реальность в значительной степени влияет на аннотацию структурных и метаболических генов вспомогательных. Здесь мы представляем Phenomic методы, направленные на захват физиологическую реакцию (ы) выбранного хоста во выражению одного из этих неизвестных генов фага. Мульти-фенотип Планшеты (карты) используются для мониторинга разнообразия использования хост подложки и последующим образованием биомассы, в то время как метаболомика обеспечивает анализ би-продукта путем мониторинга метаболит обилие и разнообразие. Оба инструмента используются одновременно, чтобы обеспечить фенотипический профиль, связанный с выражением одного предполагаемого фага открытой рамки считывания (ORF). Представитель результаты обоих методов сравниваются, highlighting фенотипические различия профиль хозяина балансовой либо предполагаемые структурные или метаболических генов фага. Кроме того, методы визуализации и высокой пропускной способности вычислительные трубопроводы, которые способствовали экспериментальный анализ представлены.
Introduction
Вирусы, заражающие бактерий (ака бактериофага или фага), по оценкам, существует более чем в 10 31 вируса частицы (ВПЧ) в мире и превосходят все другие организмы в среде 1,2. Первый метагеномных исследование исследования вирусных сообществ, связанных с морской среде сосредоточена на количественной разнообразие видел в вирусной фракции 3. Кроме того, Брейтбарт и его коллеги обнаружили, что более 65% из последовательностей вирусных сообщество не разделяет не гомологию с любой последовательности, имеющихся в публичных базах данных. Последующие исследования показали, метагеномных подобное свидетельство: метагеномов из морских отложений в Сан-Диего, Калифорния содержать 75% неизвестных вирусных последовательностей 4; метагеномов из гиперсоленых озер Солтон-Си содержать 98% неизвестных вирусных последовательностей 5; и коралловые связанный метагеномов содержать 95 - 98% неизвестных вирусных последовательностей 6. Это накопление информации Неаннотированный привелоГенетический материал фага быть "темная материя биологического вселенной" 7.
Геномная характеристика фага опирается на выявление сходства, путем сравнения с существующими базами данных нуклеиновых кислот и белков. Потому что фаги генетическая информация кодируется преимущественно неизвестно, гомологии основе методы неэффективны. В своем геноме, фаги, как правило, кодируют три основные типы генных: транскрипции и репликации генов, метаболические гены, и структурные гены. Транскрипции и репликации генов (класс I / II гены 8) включают в себя полимеразы, primases, эндо / экзо-нуклеазы и киназы. Эти гены являются высоко консервативными из-за их важности в фаговой инфекции, расшифровки и репликации фага генетический материал. Фаг-полимеразы легко идентифицировать с помощью традиционных методов гомологической последовательности из-за их глобального сохранения 9 и было показано, что в качестве эффективных филогенетические маркеры 10.В отличие, фага метаболических и структурных генов (класс II / III гены 8) все чаще расходится и часто аннотированный гипотетических генов, как.
Фаговые метаболические гены влияют на метаболические способности хозяина и не обязательно требуется для репликации вируса. Эти гены, которые часто называют в качестве вспомогательных метаболических генов (11) AMGs, по всей видимости, модулируют хоста метаболизм и обеспечивают оптимальную прогрессирование инфекции и успеха вириона созревания. AMGs были связаны с использованием и поглощения питательных веществ предельных или в производстве энергии путей. Некоторые примеры включают в себя гены фотосистемы найдены в геномах различных cyanophage 12-16, гены, связанные с и регулируются фосфатного метаболизма 17,18 и утилизации пентозофосфатного пути для фага дНТФ биосинтеза 18,19. Для сравнения, структурные гены являются одними из середины до поздних генов, полученных во время инфекции и различаются по различным фага-хоул систем. Производство структурных белков зависит от наличия вирусной дНТФ и бассейнов энергии для их транскрипции, трансляции и сборки 8. Капсида и хвост волокна структурных белков, считаются наиболее расходящиеся из всех вирусных генов белков-кодирования и необходимы для успешного производства вириона. Их расхождение обычно связано с активной ролью, которую они играют в формировании вирус-хозяин коэволюции 20. Различные белки, независимо от класса генов, которые легко упускать из виду при использовании традиционных гомологии и выравнивание последовательности методов. Усилия для коррекции ограничений видно со строгими сравнения последовательностей привело к биоинформатики инструментов, способных использовать характеристики последовательности, чтобы определить ассоциацию, например, искусственных нейронных сетей 21. Искусственные нейронные сети (ИНС) позволяют для прогнозирования структурных и метаболических генов, однако, требует экспериментальной проверки потоку непосредственно характеризуютФункция гена.
Целью этой рукописи является предоставление Phenomic протоколов, способных мониторинга катаболические как анаболический и метаболизм в бактерию-хозяина при экспрессии нового гена фага, функционально предсказано через ИНС. Поле phenomics, биологии, связанные с клеточными фенотипами, хорошо известна в системной биологии, чтобы помочь в расследовании белков с неизвестной или плейотропного функции. Phenomic инструменты используются, чтобы связать фенотипические информацию генотипической информации. Мы предполагаем, для предполагаемых генов фага, что их функция (ы) может быть определена с помощью наблюдений принимающих физиологических эффектов во время экспрессии генов фага. Чтобы исследовать эту гипотезу, два количественные методы были выбраны. Мульти-фенотип Планшеты (карты) были использованы для мониторинга использование ресурсов субстрата и последующее образование биомассы, а метаболомика измеряется хозяин метаболит разнообразие и относительное изобилие во время роста удельного ENVIRONпсихические состояния. Предполагаемые структурные и метаболические белки сверхэкспрессируется в кишечной палочки и представительные результаты обоих экспериментов по сравнению. Многочисленные визуальные методы и обработки трубопроводов высокой пропускной представлены для облегчения экспериментальной репликации. Наконец, воспроизводимость и точность представленных методов обсуждаются в контексте ожидаемых физиологических эффектов для аннотированный белка капсида и фага метаболического белка, тиоредоксина, плюс два предполагаемых AMGs.
Protocol
1. Подготовка нескольких фенотипа планшету (КАРТА) Субстраты, базальной СМИ, предварительно роста медиа, и буфера
- Сделайте 50 мл 1,0 - 1,25% акций подложки.
- Растворяют 1,0 - 1,25% (вес / объем) твердого субстрата в стерильной воде (тепла, если это необходимо). Фильтры стерилизовать решения с блоком фильтра 0,22 мкм и запасов магазина при комнатной температуре. Примеры подложек, используемых в этих экспериментах представлены в таблице 2.
- Сделать 250 мл 3x основных сред для всех классов субстрата (углерода, азота, серы и фосфора). Швабры (3-morpholinopropane-1-сульфонат), основанные базальные СМИ 22 содержит следующие: 1x MOPS (40 мм МОПС + 10 мМ трицин), 0,4% глицерина *, 9,5 мм NH 4 Cl *, 0,25 мМ NaSO 4 *, 1.0 мМ MgSO 4 *, 1,32 мМ K 2 HPO 4 *, 10 мМ КСl, 0,5 мкМ CaCl 2, 5 мМ NaCl, 6 мкМ FeCl 3, и 0,1% (вес / объем) L-арабинозы ** (таблицы 1 и 2) ,
Примечание: * Эти соединения не включены в зависимости от основных сред. Например, 0,4% глицерина не используется в базальных углерода информации и в основных сред серы 1,0 мМ MgSO 4 заменен на 1,0 мМ MgCl 2. ** L-арабиноза является специфичным для индукции pBAD промоутер вектор, pEMB11, который был преобразован в ара - Е. палочка К-12 штамм (BW 27784) 23.- Добавить каждый компонент основных сред в стерильную колбу и довести раствор до нужного объема. Хорошо перемешать. С блоком 0,22 мкм фильтр, фильтр стерилизации каждый базальные СМИ в стерильные бутылки.
- Сделать 500 мл МОПС предварительно роста СМИ. МОПС основе информации предварительно рост 22 содержит следующее: 1x MOPS (40 мм МОПС + 10 мМ трицин), 0,4% глицерина, 9,5 мМ NH 4 Cl, 0,25 мМ NaSO 4, 1,0 мМ MgSO 4, 1,32 мМ К 2 НРО 4, 10 мМ KCl, 0,5 мкМ CaCl 2, 5 мМ NaCl и 6 мкМ FeCl 3.
- Добавить другкомпонент предварительно роста СМИ в стерильную колбу и довести до объема. Фильтр стерилизовать с фильтром блока 0,22 мкм, а затем добавить ампициллин в конечной концентрации 100 мкг / мл. Магазин раствор при 4 ° С.
- Сделать 500 мл 0,5 × Лурии-Бертани (LB) пластин агара. Для стерильной колбе, добавьте компоненты LB, чтобы концентрация 0.5x (1,25 г дрожжевого экстракта, 2,5 г NaCl, 2,5 г триптонового, 7,5 г агара). Все хорошо перемешать и автоклав для стерилизации.
- Холодный агар, затем добавить 100 мкг / мл ампициллина антибиотика при перемешивании. Налейте ~ 25 мл агара в чашки Петри, позволяют установить, и хранят при температуре 4 ° С до использования.
- Сделать 250 мл 10 мМ Трис (рН 7,4) плюс 10 мМ MgSO 4 буферный раствор. Фильтр стерилизовать с блоком фильтр 0,22 мкм, и магазин решения при комнатной температуре.
2. Подготовка бактериальной клетки-подвески
- Подготовьте свежие колонии. Из 12,5% глицерина замороженных складе, плиты свежий Е. палочка КлонES на 0.5x LB агаре, содержащем 100 мкг / мл ампициллина. Инкубируют при 37 ° С в течение 24 ч.
- Подготовка жидких культур:
- Пипетка 3 мл предварительно питательной среды, содержащей 100 мкг / мл ампициллина в пробирках с культурой. Для каждого клона, использовать биологические утраивает.
- Привить независимых колоний из раздела 2.1 в подготовленные культуры труб. Инкубируют при 37 ° С при встряхивании в течение 22 ч.
- Гранул и промыть клетки бактерий:
- Передача o / n культуры в 1,7 мл микроцентрифужные труб. Пелле клеток путем центрифугирования при максимальной скорости (16,900 XG) в течение 2 мин в микроцентрифуге. Декантировать супернатант и промыть клетки путем повторного суспендирования в 500 мкл 10 мМ Трис / 10 мМ MgSO 4 буфера. Повторите.
- Re-грануляторов клеток, декантации супернатанта и вновь приостановить клеток в 1 мл 10 мМ Трис / 10 мм MgSO 4 буфера.
- Измерение плотности клеток и сконцентрировать клетки (при необходимости):
- Развести клетки из раздела 2.3.3 10 раз в10 мМ Трис / 10 мМ MgSO 4 и буфер передачи этого раствора в кювету. Измерьте оптическую плотность (OD 600 нм) этого разведения и записи.
- Концентрат клеток для достижения конечной концентрации 0,07 (OD 600 нм) на картах (клетки будут разбавлены в 15 раз, когда они добавляются к картам, поэтому клетки должны быть на начальной концентрации ОД 600 нм = 1,05). Перевести концентрированной суспензии клеток в резервуар и не спасти (при комнатной температуре) до шага 3.5 подготовке карт.
3. Подготовка нескольких фенотипа Планшеты (ПДЧ)
- Добавьте карт. Этикетка стерильные 96-луночные планшеты микро-титр с Е. палочка идентификация клон номер и карта принципиальную типа.
- Алиготе стерильную воду в карты. Соблюдая правила асептики, передача стерильную воду в резервуар жидкости. Внесите 60 мкл в каждую лунку микро-титр пластине с помощью пипетки многоканальный.
- Алиготе базальной СМИ INTO карт. Перевод Консерванта 3x базальных СМИ в резервуар жидкости. Внесите 50 мкл в каждую лунку микро-титр пластине с помощью пипетки многоканальный. Повторите шаги 3.2 и 3.3 для каждого базальных сред, используемых в схеме MAP.
- Алиготе субстраты в карты. Трансфер 30 мкл каждого субстрата в соответствующем лунку карт.
- Добавить бактериальной суспензии на картах. Передача 10 мкл бактериальных клеток из раздела 2.4.2 в каждую лунку карте с помощью пипетки многоканальный. Изменить советами повторного введения пипетки обратно в культуральной складе.
- Обложка карты с клейкой пленкой. Обложка каждой пластины с одной клейкой пластины фильма. Плотно нажмите пленку на вершине лунки планшета и вдоль краев, чтобы создать равномерное и герметичное уплотнение. Удалить излишки пленки с краев микро-титр пластины с стерильной бритвой.
- Измерьте оптическую плотность карт:
- Поместите подготовленные карты в "Input" рукав многодисковой спектрометра вфотометр ридер. Открыть ридер программное обеспечение и создать протокол, который измеряет оптическую плотность (OD 600 нм) каждые 30 мин, в общей сложности 32 часов, с 60 сек встряхивания между чтениями.
- Заданная температура в аппарате до 37 ° С. Начните протокол сразу ПДЧ уже доведены до заданной температуры.
- После 32 часов, удалить карты из "Output" рукав ридере. На каждом текстовых данных файл включают в себя: Е. палочка идентификация клон номер, дата КАРТА побежал, и МАП принципиальная типа.
4. Мульти-фенотип Планшеты (карты) Обработка и параметризации
- Оценить кривые роста, используя автоматизированный процесс обеспечения качества, например, PMAnalyzer 24.
- Убедитесь, что кривые роста есть OD 600 нм <0,20 в первые 2 часа. Не используйте поглощения в начальной точке времени (T 0) в фильтре из-за артефактов конденсации, которые, как правило, решить вT 1 (30 мин).
- Удалить кривые роста, которые нарушают QA фильтр. Сохранить информацию кривой (имя образца, а количество и значения OD 600 нм) в отдельный выходной файл для дальнейшего использования. Продолжайте анализа, если кривая роста проходит QA фильтр.
- Рассчитать средние кривые роста. Использование репликации данных, на лунку, рассчитать средний кривую роста, принимая средний оптической плотности (OD 600 нм) значение в каждый момент времени. Запись результате средние кривые роста в отдельный выходной файл для использования в будущем.
- Рассчитать наиболее подходящую модель логистической кривой для каждого роста, используя адаптацию уравнения, предложенного Zwietering 25. Логистическое уравнение включает в себя три параметра, описывающие рост бактерий: время задержки, λ (ч), максимальная скорость роста, μ макс (ОД 600 нм 100 -1), и конечный выход биомассы, α (ОД 600 нм). Использование данных в момент времени = 30 мин (у 1) в качестве начальное значение из-за артефактов конденсации.
[1] - Рассчитать максимальную скорость роста, используя прямой поиск. Запишите наибольший темп изменения над интервалом 90 мин в данных.
[2] - Расчетный конечный выход биомассы путем поиска в верхней асимптотической стоимости крупнейшего скользящей средней за окном 90 мин. В частности, определить, как асимптоты кривой роста.
[3] - Использование μ макс и А значения за 4.3.1 и 4.3.2, найти значение λ по пытаются все ценности λ:
[4] - Используйте каждое значение λ для расчета суммы квадратов ошибок (SSE). Используйте низкий SSE является SSE (λS):
/files/ftp_upload/52854/52854eq5.jpg "/> [5]
- Используйте каждое значение λ для расчета суммы квадратов ошибок (SSE). Используйте низкий SSE является SSE (λS):
- Рассчитать максимальную скорость роста, используя прямой поиск. Запишите наибольший темп изменения над интервалом 90 мин в данных.
[1] 
[2] 
[3] 
[4] 5. Фенотип Анализ карт
- Рассчитать уровень роста (GL) для каждой кривой роста для оценки общего роста за клона за подложке. Определить GL как гармонического среднего сдвинутых значений логистических оборудованная:
[6] - Назначьте фенотип каждой кривой роста, основанной на ценностях GL. Здесь четыре фенотипы используются: ожидаемый рост, отсутствие роста, усиление функции, и потеря функции.
- Определите фенотипы путем сравнения роста во всех клонов на определенный субстрат в терминах стандартных отклонений от среднего. Использование этой статистики и минимальный порог для обозначения роста фенотип, представленный кривой роста (фиг.1А, Б). Рисунок 1C представлены примеры назначения фенотипа.
- Определить рост, GL ≥ 0,4 (фигуре 1а, б). Определить коэффициент усиления функции (рис 1С, зеленый), как имеющие GL> два стандартных отклонения выше среднего и среднего> порога роста. Потеря функции (рис 1С, красный) определяется как имеющий GL <два стандартных отклонения ниже среднего и средний> порог роста.
- Создать визуальные представления набора данных на основе фенотипа и кривых роста.
- Динамика роста Посмотреть изображающие значения OD 600 нм, как цвет, чтобы быстро сравнить кривые роста между несколькими клонами (рисунок 2).
- Просмотр фенотипические распределения среди всех клонов, основанных на условиях роста (рис 3).
[6] 6. Построение непрерывной культуре Аппарат
- Конструкция реактора порт (4А, В). Дрель три 1/4. Отверстия, расположенные 3/4. Друг от друга, в крышке реактора непрерывного культивирования.
- Фог портовые α: винтовые женщина Луер нить стиль для крепления на панель 1/16 в шип из нижней части крышки с колючей направлен вверх, из крышки.. Безопасный колючка с 1/4 в. Панели крепление контргайку.
- Для порта β: винтовые женщина Луер нить стиль для крепления на панель 1/16 в шип с колючей направлен вверх, из крышки.. Безопасный колючка с 1/4 в. Панели крепление контргайку.
- Для порта γ: винтовые женщина Луер нить стиль для крепления на панель 1/16 в колючка от нижней части крышки, так Барб направлен вверх, из крышки.. Безопасный колючка 1/4 в. Для крепления на панель контргайку. Винт мужской Луер со встроенным стопорным кольцом 1/8 в. С широким отверстием шланг штуцера на внутренней части крышки.
- Для выходного канала: просверлить отверстие 5/16 в на 75 мл отметки реактора непрерывного культивирования.. Вырезать 3/4 в. От конца гайку 1/4 в. Зазубренный фитинг перегородка. Винт в 1/4 в. Из колючей перегородка фитинг (прокладка находится на внешней стороне бутылки и гайка на внутренней, Figure 4B).
- Кормление строительство бутылка порт (рис 4C). Просверлите два 1/4. Отверстия расположены в 1. Друг от друга в крышке бутылки кормления.
- Для порта δ: винтовые женщина Луер нить стиль для крепления на панель 1/8 в шип с колючей направлен вверх, из крышки.. Безопасный колючка с 1/4 в. Панели крепление контргайку.
- Для порта ε: винтовые женщина Луер нить стиль для крепления на панель 1/16 в шип с колючей направлен вверх, из крышки.. Безопасный колючка с 1/4 в. Панели крепление контргайку.
- Винт мужской Луер со встроенным стопорным кольцом 1/8 в. С широким отверстием шланг штуцера, на внутренней стороне крышки.
- Кормление трубы и трубки расширения:
- Вырежьте два 1 в. Штук труб (1/8 в. Наружный диаметр (OD) х 1/16 дюйма. Внутренний диаметр (ID)). Fit штук на портах α и γ реактора непрерывного культивирования сделаны в разделе 5.2.
- Вырезать один 1 в. Часть тubing (1/4 в. О. х 1/8. ID). Установить кусок на порт Β реактора непрерывного культивирования.
- Вырезать один 3,5 в. Кусок трубы (1/8 в. OD х 1/16 дюйма. ID). Установите этот кусок к внутренней портовых γ, на мужской Луер со встроенным стопорным кольцом на 1/8 в. Широким отверстием шланга. Порт γ является отбор порт реактора непрерывного культивирования.
- Вырезать один 1 в. Кусок трубы (1/4 дюйма. OD х 1/8 в.) ID. Установите этот кусок на δ порту рожка.
- Вырезать один 11 в. Кусок трубы (1/16 в. OD х 1/8 в.) ID. Установите этот кусок к внутренней части порта ε бутылки кормления, на мужской Луер со встроенным стопорным кольцом на 1/8 в. Широким отверстием шланга.
- Вырежьте два 18 в. Штук труб (1/8 в. OD х 1/16 дюйма. ID). Установите один кусок к порту ε бутылки кормления. Сохранить другую часть для раздела 7.
7. Запуск непрерывной культуры для метаболомики
- Стерилизовать материалы:
- Autoclaве сухих материалов в течение 30 мин. Убедитесь, чтобы обернуть крышку бутылки кормления, сделанные в разделе 5 в алюминиевую фольгу. Держите прикрепленный прямо труб.
- Оберните крышку реактора непрерывного культивирования, достигнутый в разделе 5, в алюминиевой фольге. Держите прикрепленный прямо труб. Оберните 18 в. Разрез труб в разделе 6.3.5 и наименьшее адаптер труб перистальтический насос в алюминиевую фольгу. Держите прямо труб. Автоклав в течение 30 мин.
- Сделайте 2 л 0.5x LB бульоне. В рожка, сделать 0.5x LB бульон. Обложка бутылочку для кормления с фольгой. Автоклав в течение 1 часа.
- Сделайте 70 мл LB бульоне 0.5x. Налейте бульон в реактор непрерывного культивирования. Поставьте мешалки в реакторе непрерывного культивирования. Крышка реактора с фольгой и автоклаве в течение 30 мин.
- Autoclaве сухих материалов в течение 30 мин. Убедитесь, чтобы обернуть крышку бутылки кормления, сделанные в разделе 5 в алюминиевую фольгу. Держите прикрепленный прямо труб.
- Непрерывная культура настройки:
- Бактериальная клетка-подвеска.
- Из 12,5% глицерина замороженных складе, плиты свежий Е. палочки клонов на 0.5x LB агаре, содержащем 100 мкг / мл ампициллина. Высиживатьпри 37 ° С в течение 24 ч.
- Посев одну колонию в 3 мл 0.5x LB бульоне, содержащем 100 мкг / мл ампициллина. Для каждого клона использовать биологические утраивает. Инкубируют при 37 ° С при встряхивании в течение 22 ч.
- Подключите части вместе.
- Поместите все автоклавного материалов в кабинете биологической безопасности и превратить ультрафиолетовый свет на то время средства массовой информации охлаждается. После охлаждения носитель, добавьте 0,1% L-арабинозы и 100 мкг / мл ампициллина, чтобы все 0.5x LB бульоне.
- Разверните реактор непрерывного культура крышку и винт на реакторе. Старайтесь не прикасаться трубку отбора проб. Разверните кормление из бутылочки крышку и винт на бутылке кормления. Старайтесь не прикасаться трубку отбора проб.
- Держите 18 в. Трубки, подключенный к порту ε стерильными. Ун-18 обернуть в. Трубки и перистальтический насос адаптер труб.
- Установить свободный конец 18 в. Трубки на одном конце трубки перистальтический насос адаптера. Установите другой конец адаптера перистальтический насос для18 в. трубки подключается к порту ε из бутылочки крышкой.
- Винт 0,22 мкм фильтр единиц на порты β и δ реактора непрерывного культивирования. Винт блок 0,22 мкм фильтр на адаптере порта α. На фильтр блока 0,22 мкм, подходит к свободный конец 18 в. Трубки.
- Запуск непрерывного культуры.
- В капюшоне биобезопасности, привить реактор непрерывного культивирования с 100 мкл O / N культуры, сделанных в разделе 7.2.1.1.
- Закрыть система, прежде чем перейти непрерывный культуры в 37 ° C инкубатора. В инкубаторе есть магнитное магнитной мешалки и мини перистальтический насос настроен.
- Установите перистальтический насос адаптер труб в перистальтического насоса. Трубы из рожка начинается "В" стороне и трубки приводит к реактора начинается на "Out" стороне.
- Установите перистальтический насос: "FAST". Начните перистальтический насос, переключившись на R20; ВПЕРЕД ". Убедитесь, что носитель начинает протекать через трубки.
- Поместите реактор на магнитной мешалки и начать перемешивания. Реактор непрерывного культура должна уравновешиваться в течение 24 часов до отбора проб.
- Отбор в непрерывной культуре. Винт 5 мл шприц Люэра Лок на портовых γ и подтянуть 4,5 мл культуры.
- Использование 500 мкл культуры для измерения плотности (OD 600 нм). Развести клетки, чтобы сделать 4 х 1 мл культуры на OD 600 нм = 0,35.
- Алиготе разбавляют культур в 1,7 мл микроцентрифужные труб. Повторите выборки каждые 12 ч в течение 4 дней.
- Подготовка образцов для GC-TOFMS:
- Пелле клеток путем центрифугирования на максимальной скорости (16 900 XG) в течение 2 мин. Слить супернатант. Промыть клетки с 500 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS). Повторите этот шаг.
- Декантировать надосадочной жидкости в последний раз, а затем погрузить не микроцентрифуге трубки с осажденные клетки в жидком азоте до барботажных остановки. Sразорвал образцы в -80 ° C морозильнике.
- Бактериальная клетка-подвеска.
8. Запуск серийного пассажа Batch культур для метаболомики
- Подготовка бактериальной клетки-подвески. Из 12,5% глицерина замороженных складе, плиты свежий Е. палочка клонов на 0.5x LB агар, содержащий 100 мкг / мл ампициллин. Инкубируют при 37 ° С в течение 24 ч.
- Посев отдельных колоний в 3 мл 0,5 × LB бульоне, содержащем 100 мкг / мл ампициллин. Используйте биологических утраивает для каждого клона.
- Серийный прохождение периодического культур.
- Субкультура O / N от 8.1.1 с помощью 500-кратного разведения в 3 мл LB бульоне, содержащем 50 мкг / мл ампициллина и 0,1% L-арабинозы. Субкультура должны иметь OD 600 нм <0,005. Выдержите при 37 ° С при встряхивании.
- Проверка оптической плотности (OD 600 нм) в 2 и 2,5 ч. Рост клеток для достижения OD 600 нм = 0,35.
- Субкультура через ди 500-кратноголюция в 3 мл LB бульоне, содержащем 50 мкг / мл ампициллина и 0,1% L-арабинозы. Субкультура должны иметь OD 600 нм <0,005.
- Проверка оптической плотности (OD 600 нм) в 2 и 2,5 ч. Рост клеток для достижения OD 600 нм = 0,35.
- Отбор проб серийный прохождение партии культур.
- Использование стерильного пинцета, поместить 0,22 мкм мембранный фильтр в верхней части фильтра коллектора. Алиготе 1 мл фосфатного буферного раствора (PBS) на фильтровальной бумаге и затем включите вакуумный насос.
- Повторите добавлением 1 мл PBS. Трансфер 1 мл субкультуру из раздела 8.2.3 на фильтровальной бумаге. Отсюда, двигаться быстро, чтобы получить образцы в жидком азоте немедленно. Заполните это 1 мин.
- Кратные 1 мл PBS на фильтровальную бумагу, чтобы вымыть образец. Быстро промойте, не проливая на образец стороны фильтровальной бумаги. Повторите.
- Использование стерильного пинцета место фильтр в 1,7 мл пробирке тщательно складывая Fiфильтр. Погрузитесь не пробирке в жидком азоте до пузырьков прекращается. Образец Хранить в -80 ° C морозильнике.
9. Анализ метаболитов и обработки
- Корабль 3 образца на клона на сухом льду на метаболомика основной объект для обработки образца, анализа и нормализации GC-TOFMS.
- Для каждого образца, определить среднее значение, медиана, стандартное отклонение и коэффициент вариации через метаболитов, используя репликацию данных.
- Для статистического анализа, вручную кодировать трубопровода QA с помощью условных операторов и повторяющихся казни 26 для удаления метаболитов, которые не следуют определенные условия.
- Для условия 1, удалить метаболитов, в котором более 2 образцы нулевой изобилие. Удалить внутренние стандарты из метаболомики профилей.
- Для условия 2, удалить эти метаболиты, которые не встречаются в клетках интерес. Вот, удалите следующие метаболиты: индол 3 ацетат, dihydroabiet IC кислота, нонадекановой кислота, салициловая кислота, салициловый альдегид, холестерин, фенол, 1-monostearin, октадеканол, 1-monopalmitin, додекан, додеканол, 1-гексадеканол, 5-метокситриптамин, бензойную кислоту, пентадекановую кислоту, фосфорную кислоту, пеларгоновую кислоту, пальмитиновую кислоты, каприновой кислоты, гидроксиламин, стеариновая кислота, миристиновая кислота, малеимид, левоглюкозана и 4-гидроксимасляной кислоты.
- Для условию 3 удалить эти метаболиты коэффициент вариации которого больше 1.
- Захват глобальные последствия Метаболомика, глядя на относительного содержания метаболитов.
- Создать наглядное представление о средней метаболита изобилии на клона для каждого метаболита (рис 6).
- Определить выбросы наблюдая клонов-метаболит пару частот.
- Рассчитать счет Z для каждого медианного значения каждого метаболита в клоне. Рассчитать Z баллы, используя следующее уравнение:
/52854/52854eq7.jpg "/> [7]
Примечание: Срок Х МС представляет собой уровень изобилия конкретного метаболита для конкретного клона. Срок μ С представляет собой среднюю величину всех клонов для конкретного метаболита. Срок σ С стандартное отклонение связано. - Создать визуальное представление данных, в котором выделены выбросы (данные не предоставляются).
- Рассчитать счет Z для каждого медианного значения каждого метаболита в клоне. Рассчитать Z баллы, используя следующее уравнение:
Representative Results
Все образцы, используемые для определения открытые рамки считывания (ОРС), выбранные в данном исследовании были собраны из Starbuck Island, сайт 7 (STAR7) и Кэролайн Атолл, сайт 9 (CAR9) из южных островов Лайн. По оценкам, 100 л морской воды из этих сайтов были собраны ниже коралловых пограничный слой с использованием осушительных насосов, как описано ранее 5. Содержание насосов подвергаются фракционирование через большие корпели фильтров для удаления мелких эукариот, а затем концентрировали с использованием 100 кДа фильтры с тангенциальным потоком оставив только микробы и вирусные частицы (ВЧ). Чтобы разделить VLPs, оставаясь морская вода проходит через 0,45 мкм фильтры в результате в virome. Хлороформ был введен в этой вирусной фракции, чтобы задержать рост всех оставшихся клеток и хранили при 4 ° С.
ВПЧ очищали с помощью метода хлорида цезия, в котором градиенты плотности разделения центрифугированием и создать условия для восстановления ВИРионы при ~ 1,35 г / мл до 1,5 г / мл 3. Вирусную ДНК экстрагировали с использованием СТАВ / фенол: хлороформ протокола и усиливается с помощью амплификации с использованием множественного смещения Phi29 реагентов. Секвенирование было выполнено virome с коммерчески доступной технологии Пиросеквенирование.
Биоинформатики, используемые в обработке и отбора вирусных ОРС для этого исследования являются следующие. Три шага предварительной обработки были использованы на вирусные метагеномов CAR9 и STAR7. Во-первых, общественное программное обеспечение используется для удаления тегов последовательности, которые в результате амплификации вирусной ДНК перед секвенированием 27. Во-вторых, общие артефакты, такие как секвенирование последовательностей дубликатов и количество копий низкого были отфильтрованы из набора данных с помощью дополнительной программы биоинформатики 28. Наконец, удаление загрязнения внешней последовательности 29 была выполнена для тех последовательностей, которые были ≥ 90% охвата и ≥ 94% идентичность с последовательностями в следующих базах данных: RefSeq vIrus геномы; Человек - Ссылка GRCh37; Человек - Celera Genomics; Человек - Крейг Вентер (HuRef); Человек - Сон Чжин Ким (корейский); Человек - Хромосома 7 версия 2 (TCAG); и человека - Джеймс Уотсон, Yanhuang (YH; азиатский), йоруба (NA18507; Африканский) ссылки последовательности 21. После этих процессов, последовательности из образцов CAR9 составил 591600 и последовательности STAR7 составил 939311. Эти последовательности были загружены на MGRAST и собраны с помощью программного обеспечения с использованием ассемблера настройки по умолчанию. Контигов были переведены на 6 рамок считывания и предполагаемых открытых рамок считывания (pORFs) были определены с помощью сценариев, как описано ранее 21.
Для идентификации неизвестных ОРС количество поисков подобия на основе были выполнены, чтобы удалить ОРС известной функции. Вкратце, следующие запросы были выполнены с соответствующими критериев поиска 21:
- Значительное сходство ≥ 95% идентичности над ≥40 пар оснований (п.о.) в MGRAST блат в базе данных M5NR.
- Значительное сходство (е значение ≤ 0,001) по TBLASTN против всех общественных метагеномов в Мой ресурс метагенома Database.
- Значительное сходство (е значение ≤ 0,001) по BLASTP и TBLASTN в отношении базы данных NR.
- Значительное сходство (е значение ≤ 0,001) по RPS-BLAST с базой данных консервативный домен.
- Переводы белка из избранной доли каждого набора данных по сравнению с решаемых белковых структур в Protein банка данных.
- Расчет динуклеотидных частотах с использованием динуклеотид подписей пакетов.
Полученные pORFs были разработаны для экспрессии в E. палочка с помощью публично доступной дизайн ген программного обеспечения. Back-перевод последовательностей аминокислотных занятых Таблица использования кодонов Универсальный рассчитан на экспрессии в E. палочка с минимальным использованием порога 2%. Ограничение последовательность распознавания ферментас для BamHI и HindIII были исключены из последовательностей для облегчения клонирования. За компания синтезированы инженерии генных последовательностей 30, а затем ORF, были клонированы в среднесрочной копирования число pBAD промоутер вектор, pEMB11, с помощью стандартной рестриктазы клонирования. Все клоны были преобразованы в E. палочка К-12 штамм BW 27784 23.
Мульти-фенотип Планшеты (ПДЧ)
Высокая пропускная способность и надежное программное обеспечение трубопровода было привлечено для анализа карты, в PMAnalyzer 24. Трубопровод был разработан в среде сервера Linux и выполняет различные действия, включая: разбор файлов оптической плотности, форматирование данных в текстовые файлы, предварительной обработки кривых роста для обеспечения качества (QA), и выполняющих методы математического моделирования для анализа кривых роста , Сценарии первичные моделирования были разработаны в Python версии 2.7.5, чтобы использовать модуль PyLab.
(рис 2А). Сырье кривые роста сравнивались с логистических кривых роста, чтобы определить, является ли программа PMAnalyzer точно параметризованных и смоделированы рост клона во экспериментов (данные не показаны). Для получения дополнительной информации о точности и достоверности карты и PMAnalyzer см Куэвас др. 24
После проверки метода, карты данные были проанализированы с помощью нескольких параметров, таких как максимальная скорость роста (μ) и макс уровня роста (GL), предусмотренные в конвейере обработки. Сравнительный визуализации кривых роста часто используется для интерпретации данных роста; Однако, число кривых, которые могут быть визуализированы в то время, для сравнения имеет ограничения. Для анализа многочисленных кривые роста одновременно, тепловая карта, полученные участки были умолял, чтобы сравнить десятки клонов, выращенных на одной substratе против среднего ответ, что условия "(рис 2B). Влияние размещены сверхэкспрессию нового белка фага наблюдается через изменения параметров кривой, а именно: отставание фазы, экспоненциальной фазе и максимальный выход биомассы (асимптоту). В качестве примера, крутой подъем от задержки фазы в экспоненциальной фазе моделируется в кривой роста для капсидного белка (фиг.2А), воспроизводится с помощью быстрого изменения интенсивности цвета от черного до белого за же клону в динамическом участке фиг.2В ,
Чтобы получить глобальную картину распределения клона через субстратов, фенотипические классификации, полученные от GL были использованы (рисунок 3). Здесь четыре фенотипы отдельно в четырех диаграмм, где высота каждого столбца показывает количество клонов, отображающих, что фенотип для конкретного субстрата. Выбросы в данных отражаются как клоны, попадающих в "усиления фуnction "или" потеря категории функции ". Выбросы то можно искать по отдельности и исследованы более тесно экспериментально. Кроме того, глобальный анализ признает подложки предубеждения в анализе. Субстратов, таких как фенилаланин, яблочной кислоты, глицина и привело к "Нет роста" классификации. Основания, последовательно попадают в какой-либо классификации роста, во всех клонах, не сильно взвешенный в нижнем функциональной характеристики.
Метаболомика
Катаболического изделия из клонов, выражающих неизвестные гены фага были идентифицированы с помощью метаболомики. Вкратце, клоны, выращенные в любом непрерывном культуры или последовательный проход в пакетном режиме культуры перед отправкой за ГХ-TOFMS на метаболомика основной объект. Для получения подробной информации по переработке образца, анализа и нормализации для GC-TOFMS реализуемых выбранного основного объекта см Fiehn др. 31 Briefly, 1 мл холодной экстракционного растворителя добавляют к каждому образцу, после чего образцы перемешивали и обрабатывали ультразвуком в холодной бане в течение 5 мин. Образцы центрифугировали и, наконец, половина образца декантируют и сушат вниз для анализа. Экстракты очищают и шипами с внутренней индекса удерживания маркеров перед загрузкой на газовом хроматографе, а затем последовательно передаются в масс-спектрометре. Данные из каждого образца анализировали таким образом, что интенсивность сигнала для всех обнаруженных сигналов на хроматограмме сообщается. Для нормализации, обилие пиков для каждого образца суммируются и суммарные пиковые распространенность усредняются между всеми образцами в наборе. Метаболита распространенность в выборке разделены образца пик обилия, а затем умножается на среднюю пик обилия выборочной совокупности. Полученные данные используются для анализа метаболомике в исследовании обсуждается.
Проверка Метаболомика воспроизводимости требовалосьопределить подходящий размер выборки для каждого метода культивирования. Для обнаружения точности видел в образцах и изменения наблюдались по выборке размеры стандартную ошибку среднего (S M) для обоих п = 3 и п = 6 наборы данных были рассмотрены (рис 5B). Независимо от непрерывного культивирования (CC) размер выборки, менее 1% от данных было S M ≤ 1,5. Медиана S M S были 221 и 300, а значения в диапазоне от 0 до 7,55 х 10 5 и 3,74 × 10 5, для п = 3 и п = 6, соответственно. S M ы также были вычислены для каждого набора образца размножается в способе последовательной культуры (SC). Опять же, меньше, чем 1% данных было S M ≤ 1.5, средний S М 137, и диапазон от 0 до 3,51 х 10 5. Для сравнения распределений S M между каждым набором образцов (CC N = 3 против . CC N = 6, N = CC 3 против СК N = 3, и СС п = 6 против SC N = 3) была выполнена проверка перестановки. DISTRIBсоциологическое загрязнение либо непрерывного культура S M значений набора данных не было значительно отличается от распределения значений S M серийный культуры (р-значение = 0,0). Тем не менее, распределение значений S M для непрерывной культуре п = 3 данных значительно отличается от значений S M для непрерывной культуре N = 6 данных (р-значение = 1,908804 х 10 -49). Наконец, коэффициент вариации на метаболита сравнению до и после реализации контроля качества (QA) стадии (рис 5С). В общей сложности 210 метаболиты были удалены после реализации QA трубопровода (40%) данных. Менее 1% от удаленных данных была метаболит обилие нулю, ~ 2% был внутренний стандарт данных, ~ 5% не данные из метаболитов никогда ранее наблюдали в E. палочка, а остальные метаболиты (> 30%) имели коэффициент вариации больше 1.
Как с анализом карт, глобальный observatioнс при условии, первоначальное представление о глубине информации метаболомики предложений. Чтобы получить глобальную картину, клоны иерархически сгруппированы в зависимости от их относительного содержания метаболитов, обеспечивающих информацию о клонов-метаболит профилей, потенциальных клонов со связанными функциями, и клон-метаболит выбросов (рисунок 6). Чтобы выделить функции белка, метаболиты разделены и сгруппированы на основе общих метаболических путей. Используя этот анализ с предварительным итогам, было очевидно, что метаболомика способен отделять гены из разных классов (рисунок 6, подчеркнул клонов). Кроме того, идентификация выброс с данными Метаболомика была определена путем расчета стандартных баллы (баллы Z) для каждой пары клона-метаболит. Для обеспечения статистической значимости, выбросы были определены как пара клона-метаболит со значением оценка Z 2, что составляет лишь 5 процентов данных (данные не показаны).
ether.within-страницы = "всегда"> 
Рисунок 1. Определения классификаций фенотипа. () Отношения между уровнем роста (GL) и максимальной скорости роста. Точки данных обведены красным представляют кривые роста, показывающие практически нет утилизации субстрата. (Б) представление Boxplot определении порога роста на основе распределения кривых роста с минимальным темпом роста (<0,15 OD / ч). (С) Дисперсия и стандартное отклонение GL рассчитан на подложке D-галактозы. Короткие пунктирные линии представляют два стандартных отклонения от среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
highres.jpg "/>
Рисунок 2. Карты проверки с помощью точности и дифференциации. (А) Кривые роста для аннотированных структурных (капсидных) и метаболических клонов (тиоредоксин), два новые метаболические клонов (EDT2440, EDT2441), а средний ответ клонов, выращенных на сахарозу, D- галактоза и D-манноза в картах. Синие линии показывают стандартную ошибку замечено между повторными данных (N = 3). (В) Кривые роста для 47 различных клонов представлены в виде тепловых карт для сахарозы, D-галактоза и D-манноза. Аннотированный структурные (зеленый круг) и метаболические клоны (оранжевый круг), две новые метаболические клоны (темные и светлые голубые круги), и средняя ответ (красный круг) будут выделены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
pload / 52854 / 52854fig3highres.jpg "ширина =" 700 "/>
Рисунок 3. Распределение клонов для каждого фенотипа на нескольких субстратов. Фенотипом-клон рассчитывать на 47 клонов по всей 72 углеродных конкретных условий роста. Таблица содержит прямые рассчитывает для каждого фенотипа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Схема с подробным описанием конструкции аппарата непрерывной культуры. (А) Шаги, используемые для построения порта α-γ реактора непрерывного культивирования, (б) шаги используются для построения выходной порт потока в реактор непрерывного культивирования и (С ) шаги по созданию портов δ и ε непрерывной рожка культура. = "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52854/52854fig4highres.jpg" цель = "_ пустое"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Сравнение Phenomic методов, представленных. () Процедура для подготовки нескольких фенотипа Планшеты (карты), непрерывных культур и серийных культур. (B), процент стандартной ошибки среднего (S M) рассчитывает на обоих п = 3 и п = 6 размеры выборки для непрерывной культуре (CC) и серийный культура (СК) методов подготовки для метаболомике. Y-ось на логарифмической шкале. (С) Распределение коэффициентов вариации (КВ) на метаболита, до и после осуществления контроля качества трубопровода для метода непрерывной культуре (CC).g5highres.jpg "цель =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6. метаболомики профили клонов, выращенных в непрерывной культуре. Медиана метаболит распространенности для набора метаболитов нанесены в течение 84 клонов, выращенных в непрерывных культур. Метаболита профили для аннотированных структурных (капсида) и метаболических клонов (тиоредоксин), двух новых метаболических клонов (EDT2440, EDT2441), а средняя метаболической реакции, выделены красным цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Соединение | Углерод | Азота | Сера | Фосфор |
| Глицерин | - | 0,40% | 0,40% | 0,40% |
| Хлорид аммония | 9,5 мм | - | 9,5 мм | 9,5 мм |
| Сульфат натрия | 0.250 мМ | 0.250 мМ | - | 0.250 мМ |
| Сульфат магния | 1,0 мм | 1,0 мм | - | 1,0 мм |
| Фосфат калия | 1.32 мМ | 1.32 мМ | 1.32 мМ | - |
| Хлорид магния | - | - | * | - |
| Хлористый калий | 10 мм | 10 мм | 10 мм | 10 мм |
| Хлорид кальция | 0,5 мкм | 0,5 мкм | 0,5 мкм | |
| Хлористый натрий | 5 мм | 5 мм | 5 мм | 5 мм |
| Хлорид железа | 6 мкм | 6 мкм | 6 мкм | 6 мкм |
| L-арабинозы | 0,10% | 0,10% | 0,10% | 0,10% |
| МОПС рН 7,4 | 1x | 1x | 1x | 1x |
Таблица 1. Соединения и концентрации различных базальных сред, используемых в картах. * 1,0 мМ хлорида магния замещен. 1x МОПС = 40 мм МОПС, 4 мм трицин.
| Углеродные подложки | Субстраты азота | Сера субстраты | Рhosphorus субстраты | ||
| 2 дезокси-D-рибозы | 2-дезокси-D-рибозы | 1-бутан-сульфокислоты | аденозин-5-monophoshate | ||
| 4-гидрокси-фенил уксусной кислоты | ацетамид | ацетилцистеин | бета-глицерофосфат | ||
| уксусная кислота | аденин | D-цистеин | creatinephosphate | ||
| аденозин-5-монофосфата | аденозин | D-метионин | D-глюкозо-6-фосфат | ||
| адонит | аллантоин | диэтил-дитиофосфат | диэтил-дитиофосфат | ||
| альфа-D-глюкозы | бета-фенилэтиламин | DL-этионину | DL-альфа-глицерофосфат | ||
| альфа-D-лактозы | биурет | глутатион | фосфат калия | ||
| альфа-D-melebiose | цитидин | изетионовая кислоты | пирофосфат натрия | ||
| лимонная кислота | цитозин | L-цистеиновой кислоты | тиофосфат натрия | ||
| D-аланин | D-аланин | L-цистеин | |||
| D-арабинозы | D-аспарагин | L-djenkolic кислоты | |||
| Д-арабит | D-аспартат | L-метионин | |||
| D-аспарагин | D-цистеин | сульфат магния | |||
| D-аспартат | D-глюкозамина | метансульфоновая кислота | |||
| Д-cellubiose | D-глутаминовой кислоты | N-ацетил-DL-метионин | |||
| D-цистеин | DL-альфа-амино-N-масляной кислоты | N-ацетил-L-цистеина | |||
| Д-фруктозы | D-метионин | калий-тетра-thionate | D-галактозы | D-серин | гипосульфит |
| D-глюкозамина | D-валин | sulfanic кислоты | |||
| D-глюкозы | гамма-амино-N-масляной кислоты | таурин | |||
| D-глюкозо-6-фосфат | глицин | таурохолевая кислота | |||
| D-глутамата | гуанидин | тиомочевины | |||
| D-манноза | гистамин | ||||
| Д-раффиноза | инозин | ||||
| D-рибоза | L-аланина | ||||
| Д-салицином | L-аргинин | ||||
| D-серин | L-аспарагин | ||||
| Д-трегалозо | L-цитруллин | ||||
| Д-ксилозы | L-цистеин | ||||
| дульцит | L-глутаминовой кислоты | ||||
| глицерин | L-глютамин | ||||
| глицин | L-глутатион | ||||
| я-эритрит | L-гистидин | ||||
| инозин | L-изолейцин | ||||
| L-аланина | L-лейцин | ||||
| L-арабинозы | L-лизина | ||||
| L-арабит | L-метионин | ||||
| L-аспарагин | L-орнитин | ||||
| L-аспартат | L-фенил-аланин | ||||
| L-цистеиновой кислоты | L-пролина | ||||
| L-цистеин | L-пиро-глутаминовой кислоты | ||||
| L-фукозы | L-серин; L-треонин | ||||
| L-глутаминовой кислоты | L-триптофан | ||||
| L-глютамин | L-валин | ||||
| L-изолейцин | N-ацетил-D-глюкозамина | ||||
| L-лейцин | путресцин | тиомочевины | |||
| L-метионин | тимидина | ||||
| L-фенилаланин | тимин | ||||
| L-пиро-глутаминовой кислоты | тирамин | ||||
| L-рамнозы | тирозин | ||||
| L-серин | уридин | ||||
| L-сорбоза | |||||
| L-треонин | |||||
| L-триптофан | |||||
| L-валин | |||||
| L-ксилозы | |||||
| лактат | |||||
| лактулоза | |||||
| малат | |||||
| мио-инозита | |||||
| Щавелевая кислота | |||||
| сорбат калия | |||||
| пропионовая кислота | |||||
| путресцин | |||||
| хинная кислота | |||||
| пирувата натрия | |||||
| сукцинат натрия | |||||
| сахарозы | |||||
| тимидина | |||||
| ксилит |
Таблица 2. Список используемых субстратов на карте экспериментов.
Discussion
Здесь мы представляем Phenomic подходы к функциональной характеристике предполагаемых генов фага. Методы включают развитую анализа, способного принимающей мониторинг анаболического обмена веществ, Multi-фенотип Планшеты (карты), в дополнение к установленному методу метаболомике, способного измерять воздействие катаболических метаболизма. Мы предоставили дополнительные инструменты для управления большими наборами данных, связанные с этими технологиями, что позволяет за большой обработки и анализа пропускной 24. Наконец, путем сравнения аннотированный фага белка капсида фага, тиоредоксина, двух предполагаемых метаболических генов фага, и в среднем экспериментальной ответ мы предлагаем различные стратегии для интерпретации как наборы данных и классы генов, с акцентом на выявление тенденций и фенотипических идентификации выбросов.
Как уже упоминалось, оба подхода количественно измерять только половину принимающей метаболизма. Для интерпретации относительной функции любого изновые белки под следствием, данные обоих методов требуется представить доказательства функции. В то время как это не фокус нашего текущего рукописи, выходы данных от каждого Phenomic метода положить через комбинаторных анализов, которые сосредотачиваются на методы кластеризации, таких как случайного леса и анализа главных компонент. Кроме того, гипотезы, вытекающие из совместного анализа должны быть впоследствии подтверждено традиционных генетических методик.
Наконец, методы представлены в значительной степени под влиянием бактериальной физиологии и, следовательно, выполните те же стандарты. При проведении любой метод, соображения должны быть сделаны, чтобы гарантировать независимые клоновых групп экспериментировали с; загрязнение предотвратить; одной переменной испытывается; и соответствующие элементы управления в настоящее время побежал одновременно. Отсутствие учета этих точек приводит к непонятным результатам, аналогичных любой физиологической анализа.
Мульти-фенотип Планшеты(ПДЧ)
Развитие карт обеспечивает высокую пропускную способность и адаптируемой анализа по сравнению с имеющихся в настоящее время технологий (рис 5А и таблицы 1,2). Анализ использует материалы, оборудование и основные методы, доступные во всех микробиологических лабораторий. Включение вычислительного конвейера, PMAnalyzer 24, для последующей обработки и анализа данных обеспечивает быстрое интерпретации данных. Кроме того, обе экспериментальные и аналитические аспекты подхода можно легко регулировать или настроен для индивидуальных целей. Например, если большая часть данных не проходит фильтрацию, описанную в разделе 4, можно вручную просеять через кривые роста для выявления проблем. Если проблема возникает из-за строгих параметров фильтра, корректировка сценария могут быть сделаны. В качестве альтернативы, если проблемы, связанные с экспериментальной процесса (т.е. длительное конденсации; неадекватное передачи бактериального CELLs, и т.д.), то дополнительные повторов может быть легко повторен.
Как описано в Куэвас и др. 24, PMAnalyzer это единая программа Баш написано как сценарий оболочки, который выполняет разбор и анализ сценариев как единое, автоматизированное трубопровода. Все скрипты находятся в свободном доступе из репозитория Git в 25, принимая среднее значение для каждого момента времени через трех экземплярах данных, а затем параметризует логистическую кривую, чтобы получить время задержки, максимальная скорость роста, асимптоты, и новый термин, уровень роста. Среднее значение было выбрано на среднем в нашем исследовании, чтобы уменьшить эффект больших выбросов, однако, этот сценарий может быть легко адаптированы для расчета среднего значения повторных данных. Из-за уменьшения вариации (SE) видно по репликации данных (фиг.2А) мы поддерживали использование медианы в PMAnalyzer для подгонки логарифмической кривой. Кроме того, отрезать для роста в данном исследовании (GL ≥ 0,4) был Determined путем сравнения, как данные разделены по уровня роста и максимальная скорость роста (рис 1а, б). В зависимости от модели и инструменты системы, используемой этот срок может варьироваться, требуя переопределения этого отрезать значение.
Основным преимуществом нашей анализа является возможность сравнить фенотипы с помощью одного параметра, характеризующего общее микробного роста, который мы определяем как уровень роста (GL). GL является средним гармоническим, и, следовательно, уменьшает эффекты больших выбросов в данных. Использование гармонического среднего со сдвинутыми значениями логистических оборудованная обеспечить обзор роста была рассчитана путем проб и ошибок. Другие методы пытались дифференцировать рост включены: время, которое потребовалось для достижения конкретных параметров кривой (половина μ макс, μ макс и грузоподъемностью), коэффициент детерминации (R 2), и в комбинации с R 2, умноженное на конкретных параметров кривой. Использование среднего гармонического со сдвинутымиЗначения логистической подходят для GL условии большой диапазон в оценке роста, таким образом, он стал методом выбора. Одним из факторов, следует отметить, что динамические модели кривой роста имеют потенциал теряется при использовании одного параметра или оборудованная модель. Например, отдельные параметры кривой логистической кривой и GL не способны представлять двухфазный рост. В среде с одним углерода, этот эффект на рост предполагает посредничество вирусного белка по обе конверсии субстрата или сдвига в утилизации субстрата. Дополнительные эффекты потенциально потерянных при не рассматривает несколько параметров роста включают в себя: длительное время задержки, предлагая повышенную нагрузку вирусной техники или продуктов; быстро ускорение экспоненциальной фазе, предполагая, вирусные белки, соединенные с принимающей производства энергии путей; или более высокие уровни образования биомассы, подразумевая, вирусный поддержку в поглощение питательных веществ хозяина и анаболизма (данные не показаны). Таким образом, построение зарождающиеся кривые роста ( При рассмотрении различных ответов предоставлены структурных и метаболических генов в картах, следует отметить, что различные классы субстратов в вопросе обеспечить наибольшую доказательства функции белка. Например, метаболические белки часто связаны с приобретением, ограничивающих питательных веществ, которые неспецифическая пройдет центрального метаболизма 16,32. Предварительные эксперименты показали, что КАРТА клоны, несущие предполагаемые обменные гены фага имеют повышенный лаг-фазу, когда выросли на центральных источников метаболизм углерода (рис 2А). Наоборот, клоны, несущие предполагаемых структурных генов, которые требуют больших пропорций хозяин энергии и дНТФ бассейнов, в результате ложного положительного ответа на рост для процентаRAL и аминокислотные метаболизм углерода субстраты. Это, вероятно, связано с накоплением нерастворимых белков, в результате принимающей филаментацию и / или телец включения, как это наблюдалось с помощью микроскопии (фиг.2А и данные не показаны). В то время как требуется дальнейший анализ, чтобы проверить эти предварительные результаты, карты способны извлечения фенотипические ответов, которые коррелируют с предположили функции определенных классов генов фага. В дополнение к выяснению неизвестных вирусных белков, Карты роман ресурс, чтобы исследовать функциональную и метаболическую разнообразие индивидуального бактерии или сообщества бактерий. Эти компоненты предназначены для легкого изменения для поддержки роста в диапазоне бактерий; в том числе морских, ауксотрофных и анаэробных микробов. Для облегчения этих усилий определяется базальной и предварительно рост СМИ требуют дополнительных или скорректированных химические вещества, прежде чем отличается бактериальных рода может поддерживаться на картах.Одно замечание в этой использования карт является поддержание определенных СМИ, запрет на использование таких ингредиентов, как триптона, дрожжевой экстракт и пептон. Метаболомика Поле метаболомике зависит от метаболитов баз данных, которые включают выделенные метаболиты, определенные методом масс-спектрометрии. Основной комплекс выбрали здесь есть одна из крупнейших баз данных метаболомики. Интересно, что более половины из метаболитов в результате наших экспериментов были идентифицированы (~ 65%), в то время как другие никогда раньше не были записаны в нашем хозяине, кишечная палочка (примеры включают в себя: Индол 3 уксусной кислоты 33, салициловую кислоту 34 и dihydroabietic кислоты 35). Этот факт можно отнести либо к сильным уклоном в базе данных к метаболитов растений, или конкретных белков, находящихся под следствием. Несмотря на это, результат ограниченное число известных метаболитов, доступных для представления и анализа данных. В фуры, несколько методов метаболомики использованием различных баз данных позволит более широкий охват метаболита. В настоящее время известные и неизвестные метаболиты использовать при сравнении и контрастные наши новые вирусные белки. Используя этот подход, мы предполагаем, что клоны, несущие функционально подобные белки поделятся повышенный сходство в их полной метаболомики профиль. Предварительный анализ показал, что метаболомика время как структурные и метаболические гены не ясно отделены друг от друга, эти гены выставке аналогичное воздействие на хозяина, когда избыточно экспрессируется коррелируют (рисунок 6). Например, аннотированные генные кластеры капсида тесно с предполагаемыми метаболических генов выделены в этом исследовании, EDT2440 и EDT2441. Исследования с помощью общедоступного трансмембранный топологии и сигнальный пептид программу предсказателя показали доказательства того, что оба предполагаемых метаболических генов питать один трансмембранный домен. Интересно 5 из йE 9 клонов в первом кластерной группе (самая левая часть дендрограмме) предсказали трансмембранных доменов, используя ту же программу топологии. Необходимы дальнейшие исследования, однако, вполне вероятно, что метаболиты, присутствующие во время избыточной экспрессии этих клонов, связанные с ответ клеточный стресс в результате мембраны или структурных нагрузок. Это данные подтверждают, что в то время как данные метаболомика обладает повышенной количество шума, метод способен выделения сигналов, которые отличают общие эффекты генов, как внутри, так и между класса генов. Чтобы определить, является ли метод способен извлекать конкретную информацию из функции гена, метаболиты были сгруппированы в конкретных метаболических путей. Гипотезе, если клон влияет метаболиты, относящиеся к одной пути, то суперэкспрессированный ген активен в этом пути. До создания нашей трубопровода обеспечения качества метаболомика, предварительные данные показали, что болееD недостаточно представленных метаболиты были, как правило, "неизвестно", обеспечивая мало информации о путях они связаны с (данные не показаны). Препроцессированные данные метаболомики, однако, показывает, что большинство из профилей метаболитов похожи, и только определенное число неизвестных и известных метаболитов распространенности варьироваться в зависимости от клонов, например путресцин и урацил (рис 6). Для обеспечения более высокое разрешение усилий функциональных белковых к тому, чтобы экспериментально сравнить новые гены фага против известных генов фага, которые могут быть использованы для заполнения "дыр" в метаболита на основе функциональной характеристики. Используя эту технику, назначенный функцией известных вирусных генов содержит ссылку на функцию неизвестных генов. Тем не менее, сдерживающим фактором метаболомики анализа размера и актуальность базы данных. Чтобы исправить эти ограничения, метаболомики базы данных Relatable данного исследования должны быть разработаны; такиев базе данных метаболитов и их распространенности в конкретной коллекции АСКА Е. палочки клоны, в которых один ORF избыточно экспрессируется 36. Доказательства необходимости таких баз данных была представлена в 2013 году, когда исследователи в Национальной лаборатории Беркли Lawerence составлен первый всеобъемлющий базы данных метаболитов, характерных для целых мутантов библиотек типовых бактерий 37. Это исследование при условии, новый понимание генов, необходимых для использования конкретных метаболитов, открывая четкую связь между фенотипом и генотипом. При рассмотрении метаболомики в качестве инструмента, важно определить режим обработки с последующим в основной объект. Артефакт большинстве экспериментальных процедур дисперсия день-в-день связан с инструментами использования. На сегодняшний день весь анализ ГХ-МС реализует использование внутренних стандартов, включенных в каждую аналитической перспективе; Однако, добавление специфических внутренних образцов проекта </ EM> побежал каждый день экспериментов удаляет дополнительную дисперсию. Эти соображения должны быть решены заранее, чтобы избежать проблем нормализации и предубеждения. Другим решением является, чтобы обработать все образцы на основной объект на той же машине, и в одной партии, опция доступна в любое основной объект. Различные инструменты и введены и повторно исследованы в этой рукописи предоставить новые средства для выявления и описания функционально неизвестные гены фага. Простота и технологичность экспериментальных методов с обтекаемой использованием вычислительной трубопроводов обеспечивает эти методы применимы к широкому кругу исследовательских усилий и полей. Наша цель в том, что Phenomic подходы, представленные здесь, помогут дальнейшие исследования новых белков фага в дополнение к системам, которые в равной степени функционально не определено.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Sterivex Filter | Fisher Scientific | SVGP01050 | Millipore |
| 0.22 µm Millex Filters | Fisher Scientific | SLGV033RS | Millipore |
| 0.22 µm SteriCap Filter | Fisher Scientific | SCGPS02RE | Millipore |
| 0.22 µm Omnipore membrane filters | Millipore | JHWP02500 | Millipore |
| 96-well micro-titer plates | VWR | 82050-764 | Standard F-Bottom 96 well Microplates |
| 2 ml 96-well plate | Fisher Scientific | ||
| Adhesive seal plate film | Sigma-Aldrich | Z369667 | |
| 2 L Nalgene square bottles | Cole Parmer | T-06040-70 | |
| 125 ml Nalgene square bottles | Cole Parmer | T-06040-50 | |
| 1/4 in. Panel mount lock nut, black nylon | Cole Parmer | EW-45509-04 | |
| Female Luer thread style panel mount to 200 Series Barb, 1/16 in. | Cole Parmer | EW-45500-30 | |
| Female Luer thread style panel mount to 200 series barb, 1/8 in. | Cole Parmer | EW-45500-34 | |
| Male Luer integral lock ring to 500 series barb, 1/16 in. ID tubing | Cole Parmer | EW-45505-31 | |
| Male Luer with lock ring x female Luer coupler | Cole Parmer | T-45508-80 | |
| Barbed bulkhead fittings, 1/4 in. OD | Fisher Scientific | 6149-0002 | |
| Sanipure tubing, 1/16 in. ID x 1/8 in. OD | SaniPure | AR400002 | |
| Sanipure tubing, 1/4 in. OD x 1/8 in. ID | SaniPure | AR400007 | |
| Variable flow mini pump (peristaltic pump) | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
| Magnetic stirrer | Velp Scientifica | F203A0160 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 14-512-141 | Millipore* Filter Forceps |
| Multi-plate spectrophotometer plate reader | Molecular Devices Analyst GT | ||
| Filter manifold | Fisher Scientific | XX10 025 02 | |
| Software: | |||
| Python version 2.7.5 | http://www.python.org/ | ||
| PyLab module | http://wiki.scipy.org/PyLab | ||
| R version 3.0.1 | http://www.r-project.org/ | ||
| reshape2 library | http://had.co.nz/reshape | ||
| ggplot2 library | http://ggplot2.org/ | ||
| Gene Composer | PSI Tech Portal | http://www.genecomposer.net | |
| Services: | |||
| West Coast Metabolomics Center | UC Davis | http://metabolomics.ucdavis.edu | |
| DNA 2.0 | https://www.dna20.com | ||
References
- Wommack, K. E., Colwell, R. R. Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 69-114 (2000).
- Hendrix, R. W. Recoding in Bacteriophages. Recoding: Expansion of decoding rules enriches gene expression. 24, 249-258 (2010).
- Breitbart, M., et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (22), 14250-14255 (2002).
- Breitbart, M., et al. Diversity and population structure of a near-shore marine-sediment viral community. Proceedings. Biological sciences / The Royal Society. 271 (1539), 565-574 (2004).
- Dinsdale, E. A., et al. Functional metagenomic profiling of nine biomes. Nature. 452 (7187), 629-632 (2008).
- Vega Thurber, R. L., et al. Metagenomic analysis indicates that stressors induce production of herpes-like viruses in the coral Porites compressa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18413-18418 (2008).
- Pedulla, M. L., et al. Origins of highly mosaic mycobacteriophage genomes. Cell. 113 (2), 171-182 (2003).
- Calendar, R., Abedon, S. T. The bacteriophages. , Oxford Univeresity Press. (2006).
- Breitbart, M., Miyake, J. H., Rohwer, F. Global distribution of nearly identical phage-encoded DNA sequences. FEMS microbiology letters. 236 (2), 249-256 (2004).
- Klenk, H. -P., Palm, P., Zillig, W. DNA-Dependent RNA Polymerases as Phylogenetic Marker Molecules. Systematic and Applied Microbiology. 16 (4), 638-647 (1993).
- Breitbart, M., Thompson, L., Suttle, C., Sullivan, M. Exploring the Vast Diversity of Marine Viruses. Oceanography. 20 (2), 135-139 (2007).
- Mann, N. H., Cook, A., Millard, A., Bailey, S., Clokie, M. Marine ecosystems: bacterial photosynthesis genes in a virus. Nature. 424 (6950), 741 (2003).
- Mann, N. H., et al. The genome of S-PM2, a “photosynthetic” T4-type bacteriophage that infects marine Synechococcus strains. Journal of bacteriology. 187 (9), 3188-3200 (2005).
- Lindell, D., et al. Transfer of photosynthesis genes to and from Prochlorococcus viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11013-11018 (2004).
- Millard, A., Clokie, M. R. J., Shub, D. A., Mann, N. H. Genetic organization of the psbAD region in phages infecting marine Synechococcus strains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11007-11012 (2004).
- Sullivan, M. B., Coleman, M. L., Weigele, P., Rohwer, F., Chisholm, S. W. Three Prochlorococcus cyanophage genomes: signature features and ecological interpretations. PLoS biology. 3 (5), e144 (2005).
- Rohwer, F., et al. The complete genomic sequence of the marine phage Roseophage SIOI shares homology with nonmarine phages. Limnology and Oceanography. 45 (2), 408-418 (2000).
- Miller, E. S., et al. Complete genome sequence of the broad-host-range vibriophage KVP40: comparative genomics of a T4-related bacteriophage. Journal of bacteriology. 185 (17), 5220-5233 (2003).
- Thompson, L. R., et al. Phage auxiliary metabolic genes and the redirection of cyanobacterial host carbon metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), E757-E764 (2011).
- Paterson, S., et al. Antagonistic coevolution accelerates molecular evolution. Nature. 464 (7286), 275-278 (2010).
- Seguritan, V., et al. Artificial neural networks trained to detect viral and phage structural proteins. PLoS computational biology. 8 (8), e1002657 (2012).
- Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture Medium for Enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
- Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. Homogeneous expression of the P(BAD) promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter. Microbiology (Reading, England). 147 (Pt 2), 3241-3247 (2001).
- Cuevas, D. A., et al. Elucidating genomic gaps using phenotypic profiles. F1000Research. , (2014).
- Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van’t Riet, K. Modeling of the bacterial growth curve. Applied and environmental microbiology. 56 (6), 1875-1881 (1990).
- Venables, W. N., Smith, D. M. An introduction to R. , Available from: http://cran.r-project.org/doc/manuals/R-intro.pdf (2014).
- Schmieder, R., Lim, Y. W., Rohwer, F., Edwards, R. TagCleaner: Identification and removal of tag sequences from genomic and metagenomic datasets. BMC bioinformatics. 11, 341 (2010).
- Schmieder, R., Edwards, R. Quality control and preprocessing of metagenomic datasets. Bioinformatics (Oxford, England). 27 (6), 863-864 (2011).
- Schmieder, R., Edwards, R. Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets. PloS One. 6 (3), e17288 (2011).
- Welch, M., et al. Design parameters to control synthetic gene expression in Escherichia coli. PloS One. 4 (9), e7002 (2009).
- Fiehn, O., et al. Quality control for plant metabolomics: reporting MSI-compliant studies. The Plant journal: for cell and molecular biology. 53 (4), 691-704 (2008).
- Zeng, Q., Chisholm, S. W. Marine viruses exploit their host’s two-component regulatory system in response to resource limitation. Current biology: CB. 22 (2), 124-128 (2012).
- Shindy, W. W., Smith, O. E. Identification of plant hormones from cotton ovules. Plant physiology. 55 (3), 550-554 (1975).
- Lee, H. I., Leon, J., Raskin, I. Biosynthesis and metabolism of salicylic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (10), 4076-4079 (1995).
- Chappell, J. The Biochemistry and Molecular Biology of Isoprenoid Metabolism. Plant Physiology. 107 (1), 1-6 (1995).
- Kitagawa, M., et al. Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (a complete set of E. coli K-12 ORF archive): unique resources for biological research. DNA research: an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 12 (5), 291-299 (2005).
- Baran, R., et al. Metabolic footprinting of mutant libraries to map metabolite utilization to genotype. ACS chemical biology. 8 (1), 189-199 (2013).
