Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

דנבר גבשושיות פרוטוקול לניתוח אובייקטיבי של Fungiform גבשושיות

Published: June 8, 2015 doi: 10.3791/52860
Automatic Translation
1, 1, 1, 2
1Health Sciences Department, Denver Museum of Nature & Science, 2Department of Mathematical and Statistical Sciences, University of Colorado Denver

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול למדידת צפיפות papilla fungiform מתמונות דיגיטליות. שיטה זו בונה תעדוף ומדדים אובייקטיביים אופייניים לעבודת תיאורים המקורית על גבשושיות fungiform ידי מילר & רידי (1990).

Abstract

המטרה של דנבר גבשושיות הפרוטוקול היא להשתמש במפתח דיכוטומית להגדיר ולקבוע סדר עדיפויות המאפיינים של גבשושיות fungiform (FP) כדי להבטיח ניקוד עקבי בין ציונים. פרוטוקול זה בונה את של צורך שנוצר משני העשורים האחרונים של מחקר טעם באמצעות FP כמדד לצפיפות נקבובית טעם. צפיפות FP מבחינה היסטורית נותחה באמצעות האפיונים של מילר ורידי 1990 המורפולוגיה שלהם: עגול, מוכתם קל, גדול, וגבוה. בעבודה זו, המחברים הוזהרו שהגדרות מחמירות של מורפולוגיה FP צריכה להיות מתוארים. למרות קריאה זו לפעולה, ספרות מעקב הייתה נדירה, עם רוב המחקרים ממשיכים לצטט העבודה המקורית של מילר ורידי. כתוצאה מכך, דיווחי צפיפות FP היו משתנים מאוד ו, בשילוב עם גודל מדגם קטן, עשוי לתרום למסקנות סותרות על התפקיד של FP ברגישות טעם. הגנטיקה של מעבדה טעם חקרה incon לכאורה זהsistency בספירה ומצא כי ציונים היו בנפרד עדיפות החשיבות של מאפיינים אלה באופן שונה ולא היה לי הדרכה לכאשר papilla הייתה כמה, אבל לא כולם, של האיכויות המדווחות של FP. התוצאה של זה היא הסובייקטיביות ספירת FP משתנה מאוד של אותה תמונת לשון. דנבר גבשושיות הפרוטוקול פותח כדי לתקן תוצאה זו באמצעות שימוש במפתח דיכוטומית שמגדיר ועוד עדיפות החשיבות של המאפיינים שהציגו מילר & רידי. השיטה המוצעת יכולה לסייע ביצירת דרך סטנדרטית לכמת FP לחוקרים בתחום הטעם ומחקרים תזונתיים.

Introduction

גבשושיות הן הבליטות הגלויות על פני השטח של הלשון. ישנם ארבעה סוגים של גבשושיות: fungiform (FP), foliate, circumvallate, וfiliform. בעוד גבשושיות filiform פרושות על פני השטח של הלשון, circumvallate הם מקומיים בלבד בחלק האחורי של הלשון, וfoliate נמצא בצדדים. לעומת זאת, FP ממוקם לכיוון חזית הלשון. FP, foliate, וגבשושיות circumvallate נחשבים התעורר אצלם כי יש להם את הפוטנציאל להכיל את בלוטות טעם ואילו filiform לא. בלוטות טעם הן אשכולות של תאים אחראים לאיתור tastants הכימי וtransducing הגירויים לאות התעורר אצלם במוח. מולקולות רוק ומזון להיכנס לבלוטות הטעם דרך פתחים הנקראים נקבוביות טעם שבו מולקולות טעם אז יש פוטנציאל של הפעלת תאי טעם.

מעניין לציין, שיש הבדלים אישיים גדולים בצפיפות ניצן טעם, כפי שנצפו לראשונה במחקר היסטולוגית של לשונותמ -18 גופות (מילר, 1988) 1. בלוטות טעם של עצמם אינם גלויים על פני השטח של הלשון, לעומת זאת, נקבוביות טעם גלויות בעת שימוש בטכניקות הגדלה, תאורה, וצביעה נכונה שהובילו מילר & רידי (1990) לפתח שיטה לזיהוי נקבוביות טעם וגבשושיות fungiform באמצעות videomicroscopy בחיים 2 בני אדם. מספר המעבדות שינה טכניקת videomicroscopy המקורית שלהם, באמצעות צילום ועדיין מעט או ללא הגדלה. עם זאת, מאז גבשושיות fungiform הן הרבה יותר קלים לדמיין מאשר נקבוביות באמצעות טכניקות אלה האחרונים, מעבדות פנו לספירת גבשושיות fungiform במקום נקבוביות טעם. בכך, ההנחה היא כי צפיפות papilla fungiform היא מדד ה- Proxy סביר לצפיפות נקבובית טעם, למרות שגבשושיות רבות fungiform אינן מכילות נקבוביות טעם או בלוטות טעם 3; לא רק הם FP יותר גלוי ונגיש יותר מcircumvallate וגבשושיות foliate, אבל לכידת התמונה שלהם היא פחות tiשלי רב יותר מאשר ניתוח נקבובית טעם באמצעות השיטה החלופית של videomicroscopy 2,4. בשנת 1990, מילר ורידי השתמש בטכניקה זו כדי למצוא טעם שצפיפות נקבובית מתואמת עם צפיפויות FP 3 שאומתו נוסף בet al Bartoshuk. 5 בנוסף ליחסים אנטומיים זה, מילר ורידי גם מצא כי 8 אנשים בעליונים מחצית מהפצת הצפיפות נקבובית הטעם גם מדורגת סוכרוז, NaCl, וpropylthiouracil (PROP) כמשמעותי יותר אינטנסיבי מאשר 8 אנשים האחרים 3. עבודה לאחר מכן על ידי Bartoshuk et al. (1994) נצפתה מתאם בין עוצמת טעם PROP suprathreshold וצפיפות papilla fungiform, כמו גם צפיפות נקבובית טעם, ב -42 מקצועות 5. שיטה זו נוחה הובילה למחקרים משפיעים דיווחו כי נושאים לשונות שיש הרבה גבשושיות לעורר תגובה חזקה יותר לtastants רב, כולל phenylthiocarbamide tastants המר (PTC) וPROP 6,7.

PTC וPROP הם tastants חקר היטב לעתים קרובות בשימוש בשל הקשר ברור בין פנוטיפ רגישות טעמו של אדם וגנוטיפ. מחקרי אוכלוסייה הראו כי אנשים שיש להם diplotype רצסיבי הומוזיגוטים של הגן, TAS2R38, יש רגישות נמוכה יותר באופן משמעותי כדי לתמוך יותר מדיסקים של הגרסה הדומיננטית או הטרוזיגוטיים של הגן 8-10. תופעה תורשתית זה דווחה לראשונה בשנת 1932 כאשר ארתור ל 'פוקס הודיע ​​גילוי "עיוורון טעם" שלו ל -11 PTC. בין אנשים יוכלו לטעום תרכובות המרות הללו, עוצמת הטעם דיווחה יכולה להשתנות בכל מקום ממעט לא נעימות, 6 עד כאב המר. כדי להסביר את שונות שלא יכול להיות מוסברת על ידי TAS2R38, התאוריה שהציגה שזה יכול להיות מיוחס לצפיפות של FP על הלשון 4.

כמו מחקר טעם התקדם, fielד היה מחולק לשתי אסכולות סביב תאוריה זו הנוגעות לתפקידו של FP ורגישות טעם מר. למרות שמחקרים רבים מאששים את הטענה המקורית שצפיפות FP היא גורם בPROP רגישויות 4,6,12,13, חל מגירה קטנה, אבל חשובה שמצאה ראיות כדי להפריך את זה, שדיווח על חוסר יכולת לשכפל את התפקיד 10, 14,15,16. Delwiche et al. (2001) הזהיר כי המגמה היא משתנה מאוד; צפיפות FP עושה חשבון לא אחיד להבדלים ברגישות מרירות על פני נושאים, והייתה רק הדגמה לנושאים עם לפחות רגישות מתונה כדי לתמוך 7. בנוסף לשימוש בשיטת מילר & רידי פחות קפדנות מוגדרת על איך לכמת FP, חשוב לשים לב כי עם יוצא מן הכלל של צאצאי Beaver Dam 15 המחקר שנערכו על ידי פישר, רוב המחקרים היה מעל et al. מדגם קטן גדלים אשר עשוי גם לתרום לממצאים עולים בקנה אחד בהתפקיד של FP בטעם.

בקצרה, במאמרו של מילר ורידי מתודולוגיה זרע (1990), המחברים מוכתמים לשונות כחולות לכמת FP כי FP יישאר ורוד בעוד גבשושיות filiform לספוג את הצבע ולהכחיל. הם מסווגים כFP "מבנים מעוגלים הוורודים על 0.5 מ"מ בקוטר" 2. בעוד שהכותבים מומלץ כי לפני השימוש בשיטה זו לעבודה אנליטית נוספת, מאפייני FP צריכים להיות מוגדרים יותר בקפדנות והגיעו למסקנה שהשינוי כבר ציין בספרות "יכול להיות מיוחס לאוכלוסיות שונות נושא, בשיטות שונות, וחוקרים שונים" 2, מחקר הוביל למאפיינים המקובלים שFP עגול 17,18, גדול 2, ורוד או מוכתם קל 2, ומוגבה 4. צולם בערך הנקוב, מאפיינים אלה מופיעים מאוד ישר קדימה. בגנטיקה של מעבדה טעם (לי מעבדה או מעבדה), השימוש בנפגשהוד היה מסובך בניסיונות הבודדים של הציונים במוקדמות ומתן עדיפות לחשיבות של המאפיינים הנ"ל כאשר חלק, אך לא כולם, של המאפיינים נכחו. סיבוכים אלה כללו גבשושיות קטנות שהופיעו ורוד בעיצומה של גבשושיות גדולות בהרבה; כל הלשון סופגת את הצבע הכחול ובכך לחסל סיווג המבוסס על וריאציה צבע; גבשושיות מלבניות במקום עגול; ולשונות שאין שינוי בגובה, כולם תרם לציוני דיווח ספירת FP נרחב מגוונת של אותה תמונה.

וריאציות אלה בניתוח הובילו אותנו לסקור את הספרות כדי לאתר את הסובייקטיביות, לזהות בחריגים למאפייני FP המקובלים וסופו של דבר לגבש פרוטוקול להגדיר בצורה מדויקת ואובייקטיבי ולהבקיע FP.

ראשית, צורת FP מתוארת בספרות כ17,18 מבנה מעוגל, כמו פטריות. עם זאת, ראוי לציון מלבדיונים גם הוזכרו. מילר הדגיש כי "fungiform" המונח מטעה ושFP רב אינם פטרייה בצורת אבל יכול להשתנות במידה רבה בגודל ומורפולוגיה 18. מליס et al. (2013) תאר גם כמה גבשושיות שנחשבו "מעוות", שבו קוטר FP בכיוון אחד היה לפחות שתי סטיות תקן יותר בכיוון אחר 19. יתר על כן, נג ורובינסון מצא כי כאשר מצביעים FP על ידי צביעה, הם נע בין שטוח עקף למוארכים בהופעה 20. בשים לב לחריגים לעיל, האפיון של FP להיות עגול ומופיע בצורת הפטרייה גם לצמצם הגדרה.

שנית, צבע FP הוא כפי שתואר "חוגים הוורודים על רקע כחול" 7 לאחר מכתים את הלשון עם צבע כחול. למרות שמכתים קל היה הקריטריון של FP העקבי ביותר בכל הספרות שהיא עדיין לא הייתה במוקדמות אחידות. נג & ; רובינסון ציין כי FP לא תמיד מוכתם קל, מה שהופך את זיהוי קשה ולא בטוח 20. נראה כי אז לשונות לספוג צבע שונה ותוך הניגוד ניכר בלשונות רבות, חלק הפך כחול לגמרי ללא הבחנה, בעוד שאחרים מאבדים כל שמץ של צבע הכחול 21 באופן מיידי.

המאפיין השלישי, גודל FP, היה עקבי למדי בין ניירות, הנע בין 0.5 מ"מ ל0.97 מ"מ 6,18. בספרות מילר ציין כי היו שני טווחי גודל של גבשושיות על הגבית הקדמי של הלשון. גבשושיות בקטרים ​​גדולים יותר היו בעיקר fungiform וגבשושיות חרוטי, בעוד גבשושיות בקוטר קטן יותר היו בעיקר filiform 18. עם זאת, למעט Offspring Beaver Dam מחקר 21, גודל לא הופיע כדי לקבוע אם מבנה הוא FP בספרות, אבל סופק לגבשושיות כבר סווגו כ" fungiform ".

_content "> לבסוף, ההעלאה מופיעה בתור FP הרביעי מאפיין 4 למרות שמילר ציין כי הבחנה בין filiform וגבשושיות fungiform היא קשה בעת השימוש בקריטריון זה ליד השוליים של הלשון. הוא נתן שתי דוגמאות של FP שהשתנו באופן משמעותי בגובה, להיות 0.8 מ"מ הגובה בזמן אחר היה פחות מ -0.1 מ"מ גובה, אבל עדיין היו שני נקבוביות טעם שנצפו בבירור 18 אחד. תצפית זו הייתה גם במעקב ואושרה על ידי et al Shahbake. 4

הגדרות אלה וחריגים דיווחו להראות ששדה הטעם הכיר עוד את חוסר העקביות באפיון FP והחסרונות של הפרוטוקול הנפוץ בשימוש ממילר ורידי. ואכן, מילר ורידי האיץ השדה להגדיר נוסף התכונות של FP 2. חוקרים שערנו כי ציונים היו נותנים משקל שונה למאפיינים ולתעדוף חשיבותם באופן שונה כאשר פאפillae לא הצליח לעמוד בכל קריטריון, כגון כאשר papilla הייתה גדולה ובפטריות בצורה, אבל מוכתם כחול. זה היה מנומק כי חוקרים של המחקרים שפורסמו בעבר סביר עשו את אותו הדבר ש, בשילוב עם גודל מדגם קטן, עשוי להסביר את התוצאות המגוונות המגיעות מהשימוש בשיטה זו.

מעבדת לי התייחסה הפער הזה במתודולוגיה FP-ידי פיתוח קו מנחה שמגדיר כל מאפיין באמצעות מדידות אובייקטיביות ועדיפים מאפיינים כדי לציין שמקבלת קדימות בניתוח. שיטה זו היא דנבר גבשושיות הפרוטוקול (DPP), מפתח דיכוטומית עם מאפיינים ברורים ומובחנים של FP על מנת להבטיח ספירה מדויקת ודיר מתצלומים דיגיטליים של הלשון. DPP הוא שיטה מוצעת כדי לתקנן את שיטת מילר & רידי השתמש בעבר, ובכך להסיר את פרשנות אישית ולהבטיח תוצאות עקביות יותר בעת ניתוח צפיפות FP. בעשותם כך, DPP יכול לשמש ליותר ביטחון דetermine התפקיד של FP בטעם.

התמונות שצולמו הלשון של הנושאים נותחו על ידי מדעני האזרח (ציונים) של מעבדת שהנושאים האמיתיים של מחקר זה. הליבה של המעבדה של מדעני אזרח מורכבת מחברים מהקהילה החל בגיל (שנים) מ -16 ועד אמצע שנות ה -80. דו"ח הערכה מסכם שהוזמן על ידי המוזיאון בשנת 2012 מתאר מדעני אזרח כבעל עניין חזק במדע ובשני שלישים שהרוויחו תואר אקדמי בדיסציפלינה מדעית 22. מדעני אזרח מועמד כרגע גויסו באמצעות מילה של פה, חייב להשלים בהצלחה תהליך ראיון עם מתנדב ותיק במוזיאון, ולעבור תקופת ניסיון בתערוכה של המוזיאון הקבועה בריאות, משלחת הבריאות, לפני שהם צריכים את ההזדמנות להגיש בקשה למעמד ב המעבדה. ברגע שהתקבל למעבדה, מדעני אזרח לעבור הכשרת 12 שבועות כדי להיות מוסמך לרשום נושא אנושיים. בעקבות אישור זה, הם יכולים לקחת מודולים הכשרה בטכניקות שונות במעבדה (ספירה למשל גבשושיות, מיצוי DNA) והבאים אישורים נוספים ואמצעי בקרת איכות רגילה, יש לי מדעני אזרח אלה את ההזדמנות להשתתף באופן פעיל בניתוח הנתונים. מדעני אזרח מתנדבים מהזמן ואינם מתוגמלים על תרומתם למוזיאון.

Protocol

תמונות הבקיע במחקר זה נאספו כחלק ממחקר גדול יותר שנערך בטעם הגנטיקה של מעבדה טעם בדנבר מוזיאון הטבע והמדע (המוזיאון) 10. נושאים של המחקר הגדול יותר היו מבקרים מוזיאון (n = 1,195) בטווח גילי 18-93. בעוד נושאים הגיעו משישה משבע היבשות, משתתפים היו בעיקר ממוצא אירופאי. נתונים של כל נושא נאספו בפגישה מעבדה 30 דקות אחד. המערבי Institutional Review Board אישר את הפרוטוקול, הודיעה הסכמה בכתב ניתנה, ונושאים התנדבו זמנם ולא פיצו על השתתפותם במחקר.

1. איסוף נתונים

  1. לכידת תמונה
    1. הצג נושאי תצלום של איך לדגמן בעצמם (איור 1) ומה התמונה שצולמה תיראה.
      איור 1 איור 1: לכידת תמונת תנוחה.
    2. נושאים ישירים לייבוש לשונם ביד נייר מגבת ולהשאיר את הלשון בולטת מפיהם.
    3. החל כ 3 מיליליטר של צבע הכחול מזון בריכוז 01:36 לשיא של הלשון באמצעות מוליך סטרילי, זהורית עם טיפ 1 אינץ '. יש נושאים לחזור לשון לפה שלהם ולבלוע כדי להסיר עודפי צבע.
    4. יש נושאים להוות את עצמם כפי שמוצגים באיור 1, עם הסנטר שלהם על הידיים והמרפקים על שולחן ליציבותם. נושאים ישירים להארכת לשונם מרחק נוח ולאבטח אותו בעדינות בין שיניהם.
    5. לדבוק פיסת 2.5 סנטימטר של נייר סינון בקוטר 10 מ"מ מגזרת עגולה אגרופו לקצה הקדמי של הצד השמאלי של הלשון ליד קו האמצע (ראה איור 1).
    6. קח לפחות שלוש תמונות תקריב של הלשון, CApturing כל חוזר מגזרת 10 מ"מ על מנת להבטיח להדמיה של כל FP בתוך אזור זה. השתמש בהגדרת המאקרו של מצלמה נקודה ולירות דיגיטלית באיכות גבוהה שמחוברת לחצובה ליציבות.
      1. התקרבתי כדי שכל מגזרת מצולמת ועדיין בתוך טווח הזום של המצלמה המומלצת במידה. ודא שהמטוס של עדשת המצלמה הוא מקביל למישור של הלשון ושניתק מופיע עגול בתמונה במקום מלבני. סקור תמונות כדי לוודא שהם באיכות גבוהה ושימושית לספירה.
  2. תמונת בחירה והכנה
    1. העלה את התמונות למחשב.
    2. של התמונות שצולמו בלשון זהה של הנושא, לבחור רק אחד לניתוח נוסף המבוססת על הגדרה ברורה בין מבנים על הלשון בזום הגבוה ביותר ואת הזווית מעוותת לפחות כך הלשון היא רחבה ושטוחה לכיוון המצלמה.
    3. פתח את תמונת הגלם שנבחרה בקוד הפתוח כךftware, ImageJ. לחץ על "תוספים" ובגלילת התפריט הנפתח כדי "לנתח" ולחץ על "דלפק תא." כשדלפק התא נפתח, לחץ על "אתחול" לקשר את התמונה לדלפק התא.
      שים לב: כאן, להשתמש ImageJ 1.45 שניות עם 32 סיביות גרסת Java 1.6.0_10.
      1. השתמש הגדלה סטנדרטית של 50% לעקביות בין ציונים ולשימוש בשלבים הבאים כדי לצבור FP. הזז את התמונה בצד השמאל של המסך ליד דלפק התא. תמונה זו מכונות העתקה (ראה איור 2 צד, שמאל של מסך).
  3. פתח עותק שני של תמונת הגלם (עותק B) למדידת הקטרים ​​של גבשושיות שלכמת. זום פנימה והחוצה לפי צורך להעדפה של מלך השערים הבודדים לאורך כל תהליך הניקוד. העבר עותק זה לצד ימין של המסך, כך שני העותקים אינם מבולבלים בטעות. (ראה איור 2, צד ימני שלמסך)
  4. לחץ על כלי הקו. שימוש בעותק B, זום בכל מה שנחוץ לצייר במדויק קוטר 10 מ"מ רוחב המעגל הפנימי של נייר הסינון בכל זווית ולחץ על "נתח" ו" קבע קנה מידה. "מלא את" המרחק ידוע "להיות" 10 . "ודא בקנה מידה נכונה על ידי מדידת זווית חלופית ולהבטיח טווח הקוטר הוא בין 9.8-10.2 מ"מ. אם זה לא, חזור על שלב זה.

איור 2
איור 2: העתקה והעתקה ב העתקה (משמאל) צמוד לחלון דלפק תא ונשאר בהגדלה של 50% לעקביות מהמלך שערי מלך השערים ולאילו עותק B (מימין) ניתן המוגדל להעדפתו של הפרט.

2. הניקוד FP שימוש בדנבר גבשושיות הפרוטוקול דיכוטומית מפתח

  1. לכל מועמד papilלה, להשתמש במפתח הבא דיכוטומית (שלב 2.2-2.5) המפרט את הקריטריונים כדי לקבוע אם זה FP. עיין באיור 3 עבור חזותי של גבשושיות המסווגים כFP ולאלה שדחו בכל שלב בתהליך.
    איור 3 איור 3: לעומת FP נדחה גבשושיות. איור 3 א הוא לשון עם כמה מוקדמות FP תוך 3 ב-3E שהקיף אזורים המפרים כל כלל. (3 ב) האזור הוא אמורפי; גבשושיות (3C) הם קטנות מדי; papilla 3D) היא כחולה בהשוואה לאלו הסובבים אותו, (papilla 3E) היא שקוע בהשוואה לסובבים אותו.
  2. צורה
    1. לקבוע אם המועמד היא papilla אמורפי (חסר צורה). בזום 50% לראות אם יש צורה מוכרת בכינוי גיאומטרי (סגלגל, cuboidal, עגול).
    2. אם יש צורה גיאומטרית (ראה איור 3 א), עבור לשלב 2.3.
    3. אם יסדואר הוא לא צורה גיאומטרית (ראה איור 3), ללכת לחלון דלפק תא ולחץ על "סוג 1." בעותק (זום 50%), לחץ על papilla המועמד כדי לסמן אותו כאמורפי ולא FP. לחיצה על סוגים 1-4 בזה ושלבים הבאים מאפשרת ציונים לדעת שהם התייחסו לכל גבשושיות המועמד לקטגוריות ששלטון הופר בעת דחיית מבנה אשר יסייע בדיון בשלב 2.7.2.
  3. צבע
    1. עיין להעתיק ב 50% זום ולקבוע אם יש בידול צבע על פני השטח של הלשון. אם כן, תמשיך 2.3.2 הבא. אם לא, אינו משתמש בצבע כגורם מכריע; עבור לשלב 2.4.
    2. לקבוע אם papilla המועמד היא קלה יותר מאשר הרקמה או גבשושיות המקיפות אותו (ראה איור 3 א). אם חלק כלשהו של papilla המועמד נשאר ורוד או מוכתם קל, עבור לשלב 2.4.
    3. אם papilla המועמד היא כחולה והגבשושיות סביבםקל יותר (ראה איור 3 ג), ללכת לחלון דלפק תא ולחץ על "סוג 2" על דלפק התא. על עותק, לחץ על המועמד לסמן ככחול מדי ולא FP.
  4. גודל
    1. השימוש בעותק B, להתקרב למרחק שבו בנוחות אחד יכול לראות את קווי המתאר של papilla המועמד.
    2. לחץ על כלי הקו ולמדוד על פני הממד הארוך ביותר של papilla המועמד. לחץ על "נתח" ולאחר מכן "מידה". אם האורך הנמדד הוא 0.5 מ"מ או יותר (ראה איור 3 א), עבור לשלב 2.5.
    3. אם האורך נמדד הוא .499 מ"מ או פחות, למדוד פעם נוספת כדי להבטיח דיוק. אם זה עדיין .499 מ"מ או פחות (ראה 3D F igure), לחץ על "סוג 3" על חלון דלפק תא ועל עותק, לחץ papilla המועמד כדי לסמן אותו כקטן מדי ולא FP.
  5. מיתון
    1. שימוש בעותק, להעריך אם papilla המועמד הוא גם מדיוight עם שאר הלשון או גבוהה. אם papilla היא בנקיק, לקבוע את הגובה שלה בהשוואה למבנים האחרים בנקיק, לא על פני השטח של הלשון. אם papilla נמוכה מהגבשושיות המקיפות אותו (ראה איור 3E), להשתמש "סוג 4" ועל עותק, לחץ papilla המועמד כדי לסמן אותו כהפסקה ולא FP.
    2. אם papilla המועמד היא אחת מגובה אחיד עם שאר הלשון או גבוהה (ראה איור 3 א), להשתמש "סוג 5" ללחוץ עליו ולסמן שזה FP. סך הכל סוג 5 זה ציון FP גלם. אל תסגרו את העותקים בשלב זה כImageJ אינו שומר את הציונים על דלפק התא ולא הסימנים הצבעוניים מסוגים 1-5 על עותק א
  6. חיסכון העתקה
    1. רשום בציון FP גלם מחברת.
    2. על חלון דלפק תא, לחץ על "תמונת יצוא." שמור עם מערכת השמות הרצויה של המעבדה. זה יאפשר הפתיחה של שוטרy בעתיד כדי לשמר את הסימנים הצבעוניים מסוגים 1-5. זה לא יציל את ציון FP גלם.
  7. בקרת איכות
    1. ציון כל תמונה על ידי שני ציונים בודדים ולהשוות 7.
    2. אם ציון גלם FP הגבוה הוא תוך 10% מציון גלם FP הנמוך, בממוצע שני הציונים יחד לציון FP קונסנסוס. אם שני ציוני גלם FP שונים על ידי יותר מ -10%, למשוך את שני תמונות הבקיע על גבי המסך.
      1. השתמש בסוגי דלפק 1-4 כדי לסייע בדיון בפערים ולהעניק ציון קונסנסוס סופי. אם לא ניתן להגיע להסכמה במהלך הדיון, לקחת הפסקה מניקוד. בשלב מאוחר יותר, rescore התמונה ולדון. אם לא ניתן להגיע להסכמה עדיין, למשוך במלך שערים שלישיים. שאל אותם כדי לצבור את התמונה ודיאלוג עם השניים האחרים.

3. ציונים הדרכה לשימוש DPP

  1. רקע על הדרכה
    1. יש שני ציונים לספור מגוון רחב של תמונות,הבקיע בנפרד ומקנה באופן קבוע על מנת להבטיח שהם משתמשים באותם קריטריונים. רק כאשר ספירה בודדת היו באופן עקבי בטווח של 10% מזה בזה על כל התמונות כאשר הבקיע היה השיטה (הסופית לעיל) נחשבת מקובלת וכינתה DPP.
    2. בחר 15 תמונות רשמיות ו- 15 תמונות הכשרה (נוסף איורים 2-17) בסדר רציפים להבקיע. אם תמונה נחשבה לאינספור במהלך בחירה, לדלג על התמונה ולבחור תמונה רציפה הבאה.
      הערה: תמונות אלה משתנות באיכות ובגודל כפי שהם נבחרו ואילו המעבדה עדיין מאסטרינג טכניקת צילום הנכון. אחת התמונות שנבחרו נחשב לאינספור דרך תהליך ספירה ראשוני זה, אבל נשאר ב, כדי להבטיח שציונים היו מסוגלים לעשות את השיחה בעת הצורך. לכן יש 16 תמונות הניתנות לחניכים כי רק 15 הבקיע תמונות.
    3. באמצעות DPP, שהציונים הנ"ל לספור את 15 תמונות הדרכה וליצור קונסנסוסציון לכל אחד.
    4. תנו חניכים 15 תמונות רשמיות ולבקש להבקיע באמצעות מילר ורידי ליצור בסיס. שיא ניקוד. לנהל אימוני קבוצה שבאו בעקבות צעד 3.2. ברגע שהשלב 3.2 הושלם, יש הציונים ציון 15 התמונות רשמיות שוב ולהקליט את ציוניהם.
  2. אימון כובשים לאחר בDPP
    1. תן ציונים הכשרת תמונת האימון הראשונה ולהפגין DPP לכמה גבשושיות על תמונה זו. לדון הנמקה לבחירה או לדחות כל papilla כFP. לאפשר חניכים להמשיך להתאמן ניקוד עבור שאר צילום ושלהתייעץ עם מספר הקונצנזוס (למספר הקונצנזוס של מעבדת לי והקלידו 1-5 סמנים, ראו איור משלים 1). לתמונה זו לדון בכל פערים ללא קשר ל-10% כדי להבטיח הבנה של DPP.
    2. תן ציונים הבאים תמונת אימון השנייה ויש להם להבקיע באמצעות DPP.
    3. אם ציון FP גלם המתאמן הוא בתוך עשראחוזים מהקונצנזוס הוקם לספור מסעיף 3.1.3., לאפשר חניך לעבור על התמונה הבאה וחזור על שלבים.
    4. אם התוצאה היא מחוץ לטווח של עשרה אחוזים, להשתמש בסימנים הצבעוניים של המתאמן מייצגים סוגים 1-5 להבין ולזהות את חוסר העקביות ולאחר מכן לטפל בהבנה סותרת של DPP.
    5. תן למתאמן הזדמנות rescore התמונה ולאמת את הציון החדש פעם נוספת. אם יצליח, חניך עובר על התמונה הבאה עד שכל התמונות הושלמו.

Representative Results

הנה תצלום נציג הבקיע ידי שני ציונים בודדים בעת שימוש במתודולוגיה מילר & רידי הנפוץ בשימוש לזיהוי FP מבוסס על הסטנדרטים תחום עגול גדול, ורוד, או מוכתם קל, וגבוה, ולאחר מכן אותו התצלום הובקע על ידי שני ציונים באמצעות DPP. הספירה המוצגת היא נציג של השונות גבוהות שנצפו בשיטה המקורית בהשוואה לשונות נמוכות יותר באמצעות DPP.

איור 4

איור 4:. מילר ורידי כימות לעומת DPP כימות התמונה מהשמאל היא נציג של הספירה 'שני ציונים בשיטת מילר & רידי. התמונה מימין מייצגת שני סעיפים "ציונים באמצעות DPP. האדום הוא מלך השערים 1, צהוב הוא מלך השערים 2, גרין הוא בעלים ציונים 1 & 2.

אמינות סטטיסטי של DPP נחקר בעבר תוך שימוש במודל ליניארי מעורב להעריך השתנות 10. בקצרה, כדי להפיק נתונים על מנת להעריך את התפקיד DPP משחק בעקביות של ציונים, תמונות חמש עשרה היו קלע פעמיים. במנה הראשונה של ציונים, ציונים נאיביים DPP השתמשו בשיטת מילר & רידי 2. הציונים אז הוכשרו להשתמש DPP והתמונות היו rescored בנפרד ללא צעד הקונצנזוס הסופי המתואר בסעיף 2.7 מפרט בקרת איכות (איור 5). ערכת נתוני ציון FP הייתה אז בשימוש במודל המעורב על מנת להעריך את ההבדלים בשילוב עקב פרוטוקול (איור 6), שונות בתוך-מלך השערים ואת האינטראקציה בין שתיים. מודל זה הראה הבדל משמעותי בשערו בעת השימוש בשיטת מילר & רידי לעומת DPP (p-value <1 x 10 -6) עם DPP המוביל לספירה גבוהה יותר על ידי 6.99 (SE = 0.99); 5.2% מההשתנות בציון היה כתוצאה מאימון, 25.9% בשל מלך השערים, ונותרו עקבלשונות מסוימות לתמונה 10. בשלב הבא, כדי להפיק נתונים כדי לקבוע שונות בתוך-מלך השערים, סדרה של שלושים תמונות בסדר אקראיים הובקעה על ידי 11 אנשים. ללא ידיעה בעלי ציונים, זה סדרה של תמונות כללה שלוש תמונות שחוזרות על עוצמה. אנו נצפו הבדל דרסטי בשונות ציון השוואת תמונות ברורות versusrepeated תמונות.

איור 5
איור 5:. DPP-נאיבי לעומת ההודעה DPP הדרכת פנלים לספק boxplots של עשרות סוקר במשך 15 תמונות מראש ואימון דנבר גבשושיות פרוטוקול הודעה. לכל boxplot, מילא במעגל מציין את הממוצע ואילו מעגל פתוח מצביע חריג.

איור 6
איור 6:. שינוי במלך שערי שונות האפור מייצג tהוא שונה עבור ציונים בודדים לפני אימון DPP. השחור הוא הכשרת DPP אותו פוסט מלך השערים.

Discussion

באמצעות DPP, את השונות בתוך תמונה סופרת על פני ציונים עצמאיים וספירה של מלך השערים ב- ירדה באופן משמעותי. למרות ששיטה זו הופכת את ניתוח צפיפות FP חזותי ללא videomicroscopy פחות סובייקטיבית, יש לציין כי בשיטה זו רק FP ציונים. לא יכול להבטיח שיש לי DPP מבנים מסווגים כFP נקבוביות טעם ולכן התעוררו אצלם ולא גבשושיות שמקובעת הם רעיוני של צפיפות ניצן טעם אמיתי 20,23 טבעם של שיטה זו הוא שהיא קובעת אמינות באמצעות עקביות ודיוק; עם זאת, הוא עשוי להיות הטיית תוצאות בכיוון עקבי. כדי לבדוק את הדיוק יחסי לשיטות אחרות באמצעות מדד אמיתי של צפיפות טעם ניצן (לדוגמא, videomicroscopy) תרחיב מעבר להיקף של study.However זה, על ידי המאפיין את המורפולוגיה של FP יותר מחמיר ויצירת מפתח דיכוטומית, שיטה זו מטפלת מילר ו הפריצה של רידי לשדה שיותר אפיון של FPצריך לעשות כדי שיהיה לי קונסנסוס על המורפולוגיה והכימות 2. בנוסף, הם ציינו כי אפיון זה עשוי "להבהיר חלק מההבדלים בין נבדקים ולהסביר חלק מהתוצאות השונות בין חוקרים 2." על ידי מתן שיטה אחידה של כימות, רב של אי-ההתאמות בתפקיד של FP בטעם וnutrition- מחקר הקשורים ניתן לתקן.

המפתח דיכוטומית עשוי להיות מותאם לטכניקות לכידת תמונה השונות. המרחק הידוע בקנה המידה ניתן להגדיר בקלות לקוטר שימוש בכל מעבדה ומיתון ניתן לשלול אם ניילון נצמד או זכוכית הונחו על הלשון ללכידת תמונה. במעבדה קיבל, נמצא כי הלשון הניטרלית סיפקה את ההגדרה הטובה ביותר של גבשושיות. זה יכול להיות בגלל כמות האור במעבדה שגרמה לעטוף או זכוכית נצמדה כדי לשקף את האור בחזרה אל המצלמה יצירת בוהק שגרמו ישבניםsment קשה. מעבדות חלקם אמרו שהם ימצאו את הצבע יותר מאתגר לספור, אבל המעבדה לי מצאה צבע כחול מזון מדולל בריכוז של 1:36 סיפק את הניגוד בין אידאל fungiform וגבשושיות filiform ברוב הלשונות.

יצירת מפתח דיכוטומית לאפיון FP תאפשר לחוקרים במעבדות שונות, תוך שימוש במגוון של שיטות לכידה תמונה, כדי לנתח באופן עקבי מבנים על הלשון ויש לי אמון בדיווח של התוצאות שלהם. לבסוף, שימוש במפתח דיכוטומית עשוי להיות מטרות בתחומים אחרים של מתודולוגיה המדעית שבו איכויות של מבנים או חפצים מספקות מספרים עקביים ממחקר למחקר.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה בחלק מדע חינוך שותפות פרס (SEPA) R25 RR025066 ידי בין 2,008-2,012 מהמכון הלאומי לבריאות והמרכז הלאומי למשאבי מחקר. תודה לעמיתים בתחום הטעם לדיון מתחשב בספרות, התוצאות שלנו ומשוב על השימוש בDPP בתרחישים שונים במעבדה: ג'ון הייז, סו Coldwell, פול ברסלין, קרלה שוברט. תודה גם להנהגה בדנבר מוזיאון הטבע ומדע ואת צוות בתמיכה של מדע אזרח בגנטיקה של מעבדה טעם בתוך משלחת בריאות. לבסוף, תודה לכולם של מדעני האזרח מתנדב שלנו לזמן שלהם ומסירותו לפיתוח ושימוש בפרוטוקול זה, וביניהם: דוב אראגון, מייק ארצ'ר, סו אטאמן, מייקל באגלים, A'nette ברטרנד, דיאנה וילס, וונדי סמוי, סשה דולי , פטי Drever, ג'סיקה ארן, לורה Harmacek, שון Hibbard, ג'ויס Hutchens, מאט Joo, Leta קין, וילם Leenhouts, סטפניה Lukjan, אשלי מתיוס, מייק מאוזר, סטפני מילר, האלי מורגן-רודריגז, גריפין Scherma, אליסה Schickedanz, טרי סיימון, דילן תומס, רודי טורס, טיילר וילסון, דיאן Woltkamp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Image J National Institutes of Health http://rsb.info.nih.gov/ij
Food dye, Deep Blue Shade Esco http://escofoods.com/blue-food-coloring.html
Sterile Rayon Tipped OB/GYN Applicators Puritan 25-808 1PR
Grade 1 Filter Paper Whatman Whatman No.: 1001-325
Coolpix P100 (10.3 megapixels) and P500 (12.1 megapixels) Nikon http://imaging.nikon.com/lineup/coolpix/ neither model appears to be available on the website any longer
Paper Hand Towels Kleenex https://www.kleenex.com/HandTowelsDetail.aspx

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, I. J. Human taste bud density across adult age groups. J Gerontol. 43 (1), B26-B30 (1988).
  2. Miller, I. J. Jr, Reedy, F. E. Jr Quantification of fungiform papillae and taste pores in living human subjects. Chem Senses. 15 (3), 281-294 (1990).
  3. Miller, I. J. Jr, Reedy, F. E. Jr Variations in Human Taste Bud Density and Taste Intensity Perception. Physiol Behav. 47 (6), 1213-1219 (1990).
  4. Shahbake, M., Hutchinson, I., Laing, D. G., Jinks, A. L. Rapid quantitative assessment of fungiform papillae density in the human tongue. Brain Res. 1052 (2), 196-201 (2005).
  5. Bartoshuk, L. M., Duffy, V. B., Miller, I. J. PTC/PROP tasting: anatomy, psychophysics, and sex effects. Physiol Behav. 56 (6), 1165-1171 (1994).
  6. Essick, G. K., Chopra, A., Guest, S., McGlone, F. Lingual tactile acuity, taste perception, and the density and diameter of fungiform papillae in female subjects. Physiol Behav. 80 (2-3), 289-302 (2003).
  7. Delwiche, J. F., Buletic, Z., Breslin, P. A. Relationship of papillae number to bitter intensity of quinine and PROP within and between individuals. Physiol Behav. 74 (3), 329-337 (2001).
  8. Kim, U. K., Jorgenson, E., Coon, H., Leppert, M., Risch, N., Drayna, D. Positional cloning of the human quantitative trait locus underlying taste sensitivity to phenylthiocarbamide. Science. 299 (5610), 1221-1225 (2003).
  9. Hayes, J. E., Bartoshuk, L. M., Kidd, J. R., Duffy, V. B. Supertasting and PROP bitterness depends on more than the TAS2R38 gene. Chem Senses. 33 (3), 255-265 (2008).
  10. Garneau, N. L., et al. Crowdsourcing taste research: genetic and phenotypic predictors of bitter taste perception as a model. Front Integr Neurosci. 8 (33), (2014).
  11. Fox, A. L. The relationship between chemical constitution and taste. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 18 (1), 115-120 (1932).
  12. Tepper, B. J., Nurse, R. J. Fat Perception is related to PROP taster status. Physiol Behav. 61 (6), 949-954 (1997).
  13. Duffy, V. B., et al. Bitter receptor gene (TAS2R38.), 6-n.-Propylthiouracil (PROP) bitterness and alcohol intake. Alcohol Clin Exp Res. 28 (11), 1629-1637 (2004).
  14. Yackinous, C., Guinard, J. X. Relation between PROP taster status and fat perception, touch, and olfaction. Physiol Behav. 72 (3), 427-437 (2001).
  15. Fischer, M. E., et al. Factors related to fungiform papillae density: The Beaver Dam Offspring Study. Chem Senses. 38 (8), 669-677 (2013).
  16. Feeney, E. L., Hayes, J. E. Regional differences in suprathreshold intensity for bitter and umami stimuli. Chemosens Percept. 7 (3-4), 147-157 (2014).
  17. Saito, T., Narita, N., Yamada, T., Manabe, Y., Ito, T. Morphology of human fungiform papillae after severing chorda tympani nerve. Ann Otol Rhinol Laryngol. 120 (5), 300-306 (2011).
  18. Miller, I. J. Anatomy of the peripheral taste system. Handbook of Olfaction and Gustation. Doty, R. L. , Marcel Dekker. New York. 521-547 (1995).
  19. Cheng, L. H. H., Robinson, P. P. The distribution of fungiform papillae and taste buds on the human tongue). Arch Oral Biol. 36 (8), 583-539 (1991).
  20. Cruickshanks, K. J., et al. Measuring taste impairment in epidemiologic studies-The Beaver Dam Offspring Study. Ann N Y Acad Sci. 1170, 543-552 (2009).
  21. McNamara, P. A. Genetics of Taste summative evaluation report prepared for Denver Museum of Nature & Science. Independent Evaluator. , Chicago IL. (2012).
  22. Arvidson, K., Friberg, U. Human taste: Response and taste bud number in fungiform papillae. Science. 209 (4458), 807-808 (1980).

Tags

Neuroscience גיליון 100 Fungiform גבשושיות טעם התעורר אצלם כימות לשון FP דיכוטומית מפתח תזונה שיטה
דנבר גבשושיות פרוטוקול לניתוח אובייקטיבי של Fungiform גבשושיות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nuessle, T. M., Garneau, N. L.,… More

Nuessle, T. M., Garneau, N. L., Sloan, M. M., Santorico, S. A. Denver Papillae Protocol for Objective Analysis of Fungiform Papillae. J. Vis. Exp. (100), e52860, doi:10.3791/52860 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter