Summary
試料オリエンテーションタグ（スポット）の目的は、マルチ組織のパラフィンブロック内の個々の組織の識別を支援するためのオリエンテーションツールとして機能することです。これらのプロトコルは、それが一般的な、低コストの組織学物質から容易に構築し、パラフィンブロックとセクションの信頼性の高い視覚的なマーカーとして機能する方法を示しています。
Abstract
マルチ組織のパラフィンブロックは、効率の向上、実験的均一性、および減少した時間とコストで高スループット分析を提供しています。組織マイクロアレイは、マルチ組織のパラフィンブロックの大部分を占めるが、ますます、研究者は、計画や設備の大幅な投資なし組織マイクロアレイの多くの利点を提供することができる複数の個人から大きな組織を含む非アレイブロックを使用しています。任意の多組織分析の重要な要素は、個々の組織を識別するために使用される配向法です。方法が適切な方向およびマルチ組織ブロック内の組織の識別を維持するために存在するが、大部分は、アレイ内の貴重なスペースを消費する可能性があり、非アレイブロックに適していない、および/または標準的な組織学の研究室で製造することが困難です。試料オリエンテーションタグ（スポット）は、パラフィンブロックとfoのすべての組織切片ではっきりと見ることが簡単で低コスト指向のツールです。配列と非アレイレイアウトでR信頼性の高い検体識別。スポットは、組織への直接の変更を必要としないように非アレイブロックのための既存の配向方法を上回る利点を提供し、組織片の配置の自由度を可能にします。
Introduction
単一のパラフィンブロックに複数の個人から組織サンプルを埋め込む機能は、トリートメントや個人間で簡単に並べて比較を可能にするスライド間のばらつきを排除し、標本を切片と染色のコストと作業負荷を軽減します。これらの多組織ブロックは、典型的には、組織マイクロアレイ（TMA）または非アレイレイアウトにおける複数の個体からの組織を含むパラフィンブロックのいずれかとして製造されます。サンプルのアイデンティティの維持は任意の多組織解析の成功に不可欠です。研究者は、分析の効率を向上させるスライド間のばらつきを低減し、貴重な組織のリソースを節約し、実験1の時間とコストを削減するために、それらの開発以来のTMAを使用しています。のTMAの正しい姿勢は、組織コア2-4との間の空白、行や列、コアグループ3,5の非対称の配置（ 例えば、制御を含め、様々な方法を用いて達成することができます治療対 L）、「ビーコン」コア6、およびTMAマトリックス3の外側に配置された指定の向きコア。これらの方法はのTMAのためにうまく機能しているが、ほとんどは組織コアが時間をかけて排出されるように識別子が混乱になるかもしれとして隙間やスペースで貴重なTMAコア空間とのTMAを消費します。彼らは識別子として均一なマイクロアレイコアの緊密注文パターンの異常に依存しているためさらに、これらの方法は、アレイ形式なく、マルチ組織ブロックでの使用には適していません。ほとんどの非アレイマルチ組織ブロック不均一な組織に対応しなければならないと、定義により、これらの収差は、ランドマークとして目立つ構造のアレイグリッドを表示しません。
TMA、最大の欠点のいずれかを使用することには多くの利点があるが、常に大部分は不均一な組織1の代表ではないコアのサイズが小さいです。非アレイマルチ組織ブロックは、tの多くを提供します彼はTMAの利点が、より大きな組織サンプル、または動物試験から全体の臓器が含まれています。単一コアを使用して、組織マイクロアレイは、目的のタンパク質に基づいて全組織切片と一致しており、多くの変化が大きく一致7-11ための複数のコアを必要とします。による複雑さといくつかのバイオマーカー表現型の不均一性のために、コアのさえ大量に使用してのTMA（> 10）はまだ不十分であることができ、分析の8のためのマイクロアレイ以外の方法が必要な場合があります。さらに、TMAの構築は、技術的に厳しい時間がかかり、初期コストと投資にまたは組織アレイヤーにアクセスする必要があります。非アレイマルチ組織ブロックが大幅に少ない時間と労力で任意の基本的な実験室で行われ、アレイが許可またはコストを削減し、分析を単純化する手段として、より多くの組織を必要とする研究のための有効な代替手段であることができます。
非アレイマルチ組織ブロックは、同様に信頼性を必要としますか、ientationマーカーがサンプル識別を追跡するために、しかし、これらのマーカーの開発が制限されています。組織の向きを説明する文献の多くは、このようなインク12で組織を刺青のような個々の組織片を、埋め込 むための正しい生理向きに焦点を当てて、前処理13に寒天ゼラチンで組織を事前に埋め込 み、およびノッチ14または縫合糸15で特定の組織をマーキング。機能が、これらの方法は、それらの制限によるマルチ組織ブロック内のマーカーとして理想的ではありません。縫合糸はすぐに通って区分され、各セクションに表示されない場合があります。寒天、ゼラチンを使用して事前に埋め込む技術は、加工及び埋め込み中に適切な方向に組織を維持することができるが、パラフィンブロック、スライドに複数のサンプルを区別するための視覚的な手掛かりを提供していません。組織のノッチまたは色素が分析を複雑にしたり、重要な形態学的な詳細を閉塞することができます。あるいは、組織アイデンティティ非アレイマルチ組織ブロックに非対称な配置で組織片の埋め込みによって維持が、これは3つ以上の組織片を必要とし、分析のための組織の最適な配置を可能にしない場合がありますすることができます。
試料オリエンテーションタグ（スポット）は、明らかに、マルチ組織ブロック内の組織を同定するための簡単で安価な方法として開発され、既存の配向方法に比べて多くの利点を提供していますされています。スポットは、ヒドロキシエチルアガロース処理ゲルおよび組織マーキング染料、から構成され、パラフィン（ 図2C）を浸透させ、小さな、カラフル、コアです。スポットコアは、マルチ組織のパラフィンブロック内の単一の組織の横端部に埋め込 まれ、ブロック内の、すべてのセクション（ 図1A - D）で鮮やかな色のドットとして表示され、明らかにブロックとセクションの正しい方向を示します簡単に組織識別のため。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
スポットの1建設
- 1分間または完全に溶解するまで15ミリリットルコニカルチューブまたは2ミリリットルマイクロチューブ、ボルテックスで1ミリリットルの組織マーキング色素にウシ血清アルブミン（BSA）50mgを追加します。
注：このプロトコルでは、生化学グレードBSAを使用しています。他のグレードと純度がテストされていないが、それはグレードと純度がスポットの成功に大きな影響を与えないことが予想されます。 - ゲルが完全に融解するまで10秒刻みで30％の電力で電子レンジで15ミリリットルコニカルチューブ内の熱9ミリリットルヒドロキシエチルアガロース処理ゲル。
- シングル15ミリリットルコニカルチューブで溶融処理ゲルと色素BSA溶液を組み合わせて、ピペットで十分に混合します。溶液をボルテックス。
- 数時間または固体まで冷蔵庫にコニカルチューブを置きます。
- 静かに円錐管から着色されたゲルプラグを解放するために長く、薄い、金属へらまたはプローブを使用してください。
- 銅にメスやカミソリの刃を使用してくださいゲルトン厚さ5mmの部分に横方向に差し込みます。丸みを帯びた端部を削除し、（ 図2A）廃棄物として処分します。
- 組織学カセットに平らなゲルプラグ部を配置し、1時間70％エタノールで開催しています。 70％エタノール溶液に24時間の期間にわたって少なくとも3変更ごとに2〜4時間を変更します。
- （1時間毎（ 例えば、脂肪族炭化水素を溶液3回クリアで、クリア、70％エタノール、80％エタノール、95％エタノール、100％エタノール（3回の変更）：手動エタノール系列（1時間各貫通ゲル切片を処理しますキシレン代替））は、このプロトコルで使用された、キシレン）も許容され、手動または組織プロセサに、溶融パラフィン（1時間ごとに、3回）で潜入。
注：100％エタノールで完全な脱水の前に、染料が自動化組織プロセッサで他の組織および液体試薬に影響を与える可能性ゲルプラグから漏れることがあります。このような、手動の再水和が強く推奨されているように、しかし、自動処理はEQUです味方に有効。 - 標準のパラフィン包埋の方法論（ 図2B）を使用して埋め込 み、複数の処理されたゲル切片。ブロックを冷却し、硬化した後、室温に戻します。
- ブロックは（ 図2C）に排出されるまで埋め込 みゲル切片からのスポットコアを除去するために、所望の大きさの皮膚パンチ針を使用してください。単一のブロックは、20×2 mm 2のコアまで提供することができます。涼しい場所にコアを保管してください。このプロトコルで皮膚パンチを使用している図1.5ミリメートル（ 図1Dおよび2D）または2ミリメートル（ 図1B、1C、および2C）を参照してください。
2.オリエント非アレイブロックにスポットを使用して
- 所望の位置と一緒に埋め込まれる個々の組織片の全ての識別、およびスポットの位置を示すために、組織の方向図を作成します。
注：組織配向ダイアグラムは、pを含む図示したマップであります識別子とスポットの位置で標識されたすべての組織片のhysical場所。これは、電子的に作成することができるか、手で引くことができます。図は、最高の最終製品を使用して、技術者や研究者に適した任意の方法を使用して作成する必要があります。サンプルは簡単に顕微鏡分析中に識別できるように、このマップは、研究者のためのガイドとして機能します。このプロトコルで使用されるマップは、手描きしました。それは、組織の各部分と実際の組織ブロックとスライドと同じ位置に描画され、標識されたスポットで組織ブロックとガラス顕微鏡スライドを示しています。 - それらが適切にグロスや処理工程を通じて同定されたままことを確認して、正常組織片を処理します。 70％エタノール、80％エタノール、95％エタノール、100％エタノール（×3の変化）、脂肪族炭化水素（キシレン代替物）（X3の変化）、溶融組織浸潤パラフィンでこのプロトコルでは、1時間毎でのために組織を処理します60°C（X3の変更）。
注意：LL組織は、標準的な組織学の研究室の手順に従って処理されるべきです。これは、個々の研究室の手順、組織のサイズと種類に可変であってもよいが、これはオリエンテーションツールとしてスポットを使用する能力には影響しません。 - 組織の向き図に従って正しい割り当てられた場所に埋め込みステーション上の組織片を配置します。ブロックごとにスポットし、組織片を配置する方法についての技術者を案内するための基準として、組織の方向図を使用してください。
注：このプロトコルでは、埋め込み技術者は埋め込み駅に隣接手描きの方位マップを入れて、図に描かれたとまったく同じ配置で埋め込みステーション上の組織片を配置しました。これは、すべての組織片は、最終製品に正確に識別しておくことができます。これは、マルチ組織ブロックの使用の成功に絶対的に重要です。 - スポットコアがブロックに埋め込まれるすべての組織片よりも背が高いであることを確認してください。
- 標準的な埋め込み方法論を用いて組織の向き図に従って適切な位置で、次に組織片と終了（横）にスポットを埋め込みます。必要に応じて、パラフィン、スポット（s）は（1〜2分）を転倒しないことを十分に凝固するまで、ピンセットで直立スポット（複数可）を開催しています。
- 標準的な方法論を用いて、スポットのセクションと染色パラフィン切片。
- セクションでは、正に帯電したスライドガラスに40℃の水浴上に浮遊して付着することを可能にする（非荷電スライドがテストされていません）。少なくとも20分間、60℃の乾燥オーブン中でスライドを乾燥させます。
- 自動染色でスライドを配置し、以下の試薬を介して処理：キシレン（キシレン1-5分、キシレン2、3-2分、それぞれ）、100％エタノール（2分）、95％エタノール（1分）、80 ％エタノール（30秒）、70％エタノール（30秒）、水道水（2分）、ヘマトキシリン（1.5分）、水道水（3分）、酸アルコール（1分）、水道水（2分）、BLuing試薬（1分間）、流水（2分）、80％エタノール（30秒）、エオシン（1分間）、流水（10秒）、80％エタノール（1分）、100％エタノール（3回交換、 2分ごと）、キシレン（3変更、30秒ごと）。
- マウンティング培地でマウントカバーガラスとスライドをカバーしています。
注：このプロトコルでは、組織学技師は、5μmの切片でミクロトームでパラフィンブロックを切断しました。我々は、自動染色を使用し、このプロトコルのために、しかし同等の結果が手動染色を介して得ることができます。
のTMA 3.スポット（手動TMAキット）
- 2.1で説明したように、組織の方向図を作成し、スポットの所望の位置（複数可）を割り当てます。
- 埋め込み駅で溶融パラフィンでTMAの金型を入力します。金型が冷却されると、組織の配向図で示される所望の位置でのTMAの鋳型の縁端上のスポット（複数可）を埋め込みます。必要に応じて、パラフィンヘクタールまで鉗子で直立スポット（複数可）を保持Sは、スポット（複数可）（1-2分）倒れないことを十分に固化しました。
- メーカーの指示およびアレイマージン（ 図2D）のスポット（複数可）の位置に関して記載のTMAコアを組み立てて、標準切片と染色プロトコルに従ってください。
注：このプロトコルで使用される切片および染色方法を参照するために、ステップ2.6を参照してください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
スポットは、すべてのパラフィン切片でパラフィンブロック（ 図1Aおよび2D）でのラウンド、鮮やかな色のドットとして表示され、H＆EまたはIHC染色手順を介してスライドガラス（ 図1B - 1Dおよび2D）に残ります。この明らかな視覚的な手がかり助剤は、それぞれの個々の組織片を識別し、組織学技師が顕微鏡でスライドからデータを収集する研究者に組織片の配置を示すために、この視覚的なキューを使用できるように通信を簡素化で組織学技師や研究者の両方。組織の方向図は研究者に提供し、スライドに含まれており、顕微鏡分析の間に混乱は存在しませんので、詳細に説明されるべきである。 図2（a）は固化し、着色されたアガロースゲルプラグを区画した結果を示す。 図2Bは、埋め込 みの結果を示しています区分アガロースゲルプラグパラフィンブロック中のS。 図2Cは、スポットコアを製造するために皮膚パンチを使用した結果を示しています。
図1：スポットコアは、組織ブロックとスライドで簡単に作成し、容易に視認されている（A）のスポットが埋め込 まれたブロック内にはっきりと見えます。 （B）スポットは簡単に向きと異なる個体/治療群から類似登場する組織を含む多組織ブロックのための組織の識別を可能にします。 （C）スポットが組織マイクロアレイのすべてのコアは、貴重な組織試料のために利用されることを可能にします。 （D）TMAコアに隣接するスポットの顕微鏡図です。矢印はスポットを示す。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 
図2：スポットコアの調製（A）凝固ヒドロキシアガロースプラグをエッペンドルフ管から放出され、5mmのスライスに横方向に切断されます。 （B）複数のスライスは、単一のパラフィンブロック中に埋め込 まれており、（C）皮膚パンチスポットコアを除去するために使用されます。 （D）のスポットが組織マイクロアレイの余白に埋め込 まれている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
スポットの調製に成功したと活用は、いくつかの技術的な手順に慎重に遵守する必要があります。ヒドロキシエチルアガロースの溶融がゆっくりと弱火で行われるべきです。高熱で迅速に溶融して最適な結果よりも少ないため、アガロースのいくつかの破壊をもたらすことができます。処理のための片に色素を含んだプラグを切断すると、それぞれの作品の厚さが4.5ミリメートルより大きく、7ミリメートルを超えないようにしてください。丸みを帯びた端部は、それらが厚さ5mm均一でないとして廃棄物として除去されます。 5ミリメートル未満の作品は、隣接する組織材料の枯渇する前に切片によって排出される危険が短いスポットの作成になります。スポットは、ブロック全体を通して存在していることを確認するために、ピースは、少なくとも4.5〜5ミリメートルにする必要があります。ワックスの適切な浸透を確実にするために、しかし、作品は7ミリメートルを超えてはなりません。ワックス浸透のための色素片を脱水すると、染料はロウに作品のうち、わずかに浸出しますエタノールの濃度R。浸出は、最終製品に影響を与えない、スポットは依然として激しく染め、はっきりと見えるようになります。作品は100％エタノールに達するまで組織切片を染料片と同じ浴で処理されるべきではないので、浸出は、しかし、他の組織に影響を与える可能性があります。
配列されたブロックにスポットを配置する場合、他のすべての組織の配置は前のスポットを追加することに完全であることを確認してください。スポットはパラフィンワックスを浸透させているので、それがあまりにも長い間放置されている場合、レシピエントブロックの溶融ワックスは、スポットコアを溶融し始めることができます。 、最初にすべての組織片を配置し、スポットコアを追加し、直ちにスポットの任意の溶融を防止するために、コールドプレートにブロックを転送します。
スポットは、ほとんどの組織学ラボのワークフローに適合するように修正することができます。染料の色は、各アプリケーションにおける最適なコントラストのために変更することができます。赤や黒の染料はwが、IHC染色したスライド上の明確な高いコントラストを生み出しますhile赤斑は目が配列された腎臓切片のH＆E染色スライドで引くようではありません。 H＆Eスライドには、緑や黄色の斑点は、より高いコントラストを提供する傾向があります。また、このような免疫組織化学のための熱誘導された抗原回復のようなプロセスの間に高熱下で、ヒドロキシエチルアガロースが溶け。 BSAも高熱検索方法の後にスライド上の明るい色のスポットを維持するために、スポット準備中に染料に追加されます。スライドは、高熱にさらされない場合、BSAは速いスポット生産のために省略することができます。
スポットを配置するとき、スポットの使用の最も重要な側面は、明確かつ簡潔な方位マップとマップに忠実な遵守の作成と維持にあります。適切に使用すると、埋め込み技術者は、単にスポットの位置とTISSUの関係を示すことができるように、スポットは、組織構成の混乱を軽減し、技術者や研究者との間の通信を簡素化地図上のそれへのES。スポットは簡単に、下流の分析のためにスライドに取り付け、高一貫のセクションを可能にするスライドの準備のすべての段階ではっきりと見えます。生理的マーカーとは対照的に、スポットはすべてのセクションにはっきりと表示され、成果物または形態の閉塞の導入を防止する、どのような方法で組織を変更しません。非対称組織を埋め込む方法とは異なり、スポットを顕微鏡下で視覚分析を最適化するために、組織の配置の技術者や研究者の柔軟性を可能にします。のTMAでは、スポットは、アレイ全体が貴重な組織切片で構成することができるように、空白、非対称アセンブリ、またはビーコンコアの必要性を排除し、メインアレイの外部に配置することができます。スポットはまた、組織サンプル（ 例えば、遠位または近位の）解剖学的方向を示すために使用することができます。スポットは、建設とAの間に組織サンプルを簡単かつ一貫した姿勢ためのシンプルで低コストのソリューションです。マルチ組織ブロックとのTMAのnalysis。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者は、原稿の重要なレビューを提供するための博士ブレントハリスに感謝したいと思います。これらの研究は、NIH / NCI助成金P30-CA051008によって部分的にサポートされているロンバルディ総合がんセンター病理組織学および組織の共有リソースで行われました。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立がん研究所や国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histogel Specimen Processing Gel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html |
| Tissue Marking Dye | Triangle Biomedical Sciences, Inc. | TMD-5 | Any tissue marking dye would most likely be sufficient. |
| Arraymold Kit A 2 mm (60 core) | Arraymold | 20015A | Any manual tissue arrayer would work similarly. |
References
- Jawhar, N. Tissue microarray: a rapidly evolving diagnostic and research tool. Ann. Saudi. Med. 29 (2), 123-127 (2009).
- Dhir, R.
- Parsons, M., Grabsch, H. How to make tissue microarrays. Diagn. Histopath. 15 (3), 142-150 (2009).
- Saxena, R., Bade, S. Ch. 7 Tissue Microarray – Construction and Quality Assurance. Immunohistochemical Staining Methods 6th ed. , Available from: http://www.dako.com/08002_ihc_staining_methods_5ed.pdf (2013).
- Nocito, A., Kononen, J., Kallioniemi, O., Sauter, G. Tissue microarrays (TMAs) for high-throughput molecular pathology research. Int. J. Cancer. 94, 1-5 (2001).
- Rangel, C. The tissue microarray: helpful hints. J.Histotech. 25 (2), 93-100 (2002).
- Hammer, A., Williams, B., Dietz, H., Hamilton-Dutoit, S. High-throughput immunophenotyping of 43 ferret lymphomas using tissue microarray technology. Vet. Path. 44, 196-203 (2007).
- Eckel-Passow, J., Lohse, C., Sheinin, Y., Crispen, P., Krco, C., Kwon, E. Tissue microarrays: one size does not fit all. Diagn Pathol. 5, 48-57 (2010).
- Lin, Y., Hatem, J., Wang, J., Quinn, A., Hicks, D., Tang, P. Tissue microarray-based immunohistochemical study can significantly underestimate the expression of HER2 and progesterone receptor in ductal carcinoma in situ of the breast. Biotech. Histochem. 86 (5), 345-350 (2011).
- Wampfler, J., et al. Determining the optimal numbers of cores based on tissue microarray antibody assessment in non-small cell lung cancer. J Cancer Sci. Ther. 3, 120-124 (2011).
- Quagliata, L., Schlageter, M., Quintavalle, C., Tornillo, L., Terracciano, L. M. Identification of new players in hepatocarcinogenesis: Limits and opportunities of using tissue microarray (TMA). Microarray. 3, 91-102 (2014).
- Miettinen, M. A simple method for generating multitissue blocks without special equipment. Immunohistochem. Mol. Morphol. 20 (4), 410-412 (2012).
- Jones, M., Calabresdi, P. Agar-gelatin for embedding tissues prior to paraffin processing. BioTechniques. 42, 569-570 (2007).
- Carson, F., Hladik, C. Histotechnology: A Self-Instructional Text. , 3rd ed, American Society for Clinical Pathology Press. Chicago, IL. (2009).
- Suvarna, S., Layton, C., Bancroft, J. Bancroft’s Theory and Practice of Histological Techniques. 7th ed. , 7th ed, Churchill Livingstone Elsevier Ltd. London, UK. (2013).
