Summary
Lo scopo della Orientamento Tag Specimen (spot) è la funzione di strumento di orientamento per aiutare nella identificazione dei tessuti dell'individuo in blocchi di paraffina multi-tessuto. Questi protocolli dimostrano come è costruito facilmente da, a basso costo materiali comuni istologia e funge da indicatore visivo affidabile in blocchi di paraffina e sezioni.
Abstract
Blocchetti di paraffina Multi-tessuti garantiscono elevata analisi produttività con una maggiore efficienza, l'uniformità sperimentale, e riduzione dei tempi e dei costi. Microarrays tessuti costituiscono la maggior parte dei blocchi di paraffina multi-tessuto, ma sempre di più, i ricercatori stanno utilizzando blocchi non schierati contenenti grandi tessuti provenienti da più persone che possono fornire molti dei vantaggi di microarray di tessuti senza sostanziali investimenti nella progettazione e attrezzature. Un componente critico di qualsiasi analisi multi-tessuto è il metodo di orientamento utilizzato per identificare ciascun tessuto. Anche se i metodi esistono per mantenere il corretto orientamento e identificazione dei tessuti in blocchi più tessuti, la maggior parte non sono particolarmente adatti per i blocchi non schierati, può consumare spazio prezioso all'interno di un array e / o sono difficili da produrre in laboratorio di istologia normale. L'orientamento Tag Specimen (SPOT) è uno strumento semplice, a basso costo che l'orientamento è chiaramente visibile in blocchi di paraffina e di tutte le sezioni di tessuto for identificazione del campione affidabile nei layout schierati e non schierati. Lo spot fornisce vantaggi rispetto ai metodi di orientamento esistenti per blocchi non disposte in quanto non richiede alcuna modifica diretta al tessuto e consente flessibilità nella disposizione dei pezzi di tessuto.
Introduction
La capacità di incorporare campioni di tessuto provenienti da più persone in un unico blocco di paraffina permette facile confronto side-by-side tra i trattamenti e gli individui, eliminando la variabilità tra le diapositive, e riduce i costi e il carico di lavoro di sezionamento e colorazione campioni. Questi blocchi multi-tessuti sono tipicamente prodotte sia come microarrays tissutali (TMA) o blocchi di paraffina contenenti tessuto da più individui in un layout non array. Manutenzione di identità del campione è fondamentale per il successo di qualsiasi analisi multi-tessuto. I ricercatori hanno utilizzato TMAs dal loro sviluppo per migliorare l'efficienza di analisi, ridurre le variazioni tra le diapositive, conservare le risorse tessuti pregiati, e di ridurre i tempi ei costi di esperimenti 1. Il corretto orientamento della TMA può essere realizzato utilizzando una varietà di metodi, inclusi gli spazi, righe o colonne tra nuclei di tessuto 2-4, disposizione asimmetrica dei gruppi principali 3, 5 (per esempio, Control vs trattamento), "beacon" core 6, e core orientamento designati situati al di fuori della matrice TMA 3. Anche se questi metodi funzionano bene per TMA, più consumano spazio prezioso nucleo TMA e TMA con lacune e spazi come identificatori possono diventare fonte di confusione come nuclei di tessuto sono esauriti nel corso del tempo. Inoltre, questi metodi non sono appropriati per l'uso in blocchi multi-tessuto senza un formato array perché si basano su anomalie del modello ben ordinato di core microarray uniformi come identificatori. La maggior parte dei blocchi non schierati multi-tessuto devono ospitare i tessuti non uniformi e, per definizione, non visualizzare la griglia matrice strutturata che rende queste aberrazioni spiccano come punti di riferimento.
Anche se ci sono molti vantaggi di utilizzare un TMA, uno dei maggiori svantaggi è la piccola dimensione delle anime che non è sempre rappresentativa del tessuto ampiamente eterogenea 1. Blocchi multi-tessuto non schierati forniscono molte delle tegli beneficia di un TMA, ma contengono campioni di tessuto più grandi, o interi organi da studi su animali. Microarrays tessuto con singoli conduttori hanno diversi concordanza con intere sezioni di tessuto a base di proteina di interesse e molti richiedono core multipli per una maggiore concordanza 7-11. Data la complessità e la natura eterogenea di alcuni fenotipi di biomarker, TMA utilizza anche un gran numero di core (> 10) può ancora essere insufficiente e può richiedere metodi diversi da microarray per l'analisi 8. Inoltre, TMA costruzione è in termini di tempo, tecnicamente impegnativo, e richiede il costo iniziale e gli investimenti in o l'accesso a un Arrayer tessuti. Blocchi multi-tessuto non in array possono essere fatte in qualsiasi laboratorio di base con molto meno tempo e fatica ed è una valida alternativa per gli studi che richiedono più il tessuto di array consentono o come mezzo per ridurre i costi e semplificare l'analisi.
Blocchi non in array multi-tessuto simile richiedono un affidabile oientation marcatore per monitorare l'identificazione dei campioni, tuttavia, lo sviluppo di questi marcatori è stato limitato. Gran parte della documentazione che presenta orientamento tessuto concentra sul corretto orientamento fisiologico per l'incorporamento pezzi di tessuto individuale, come il tatuaggio del tessuto con inchiostro 12, pre-embedding tessuti agar-gelatina prima della trasformazione 13, e la marcatura certi tessuti con tacche di 14 o 15 punti di sutura . Anche se funzionale, questi metodi non sono ideali come marcatori in blocchi multi-tessuto a causa delle loro limitazioni. Una sutura verrà sezionato attraverso rapidamente e può non essere visibile in ogni sezione. Tecniche che utilizzano agar-gelatina può mantenere il tessuto nel giusto orientamento durante la lavorazione e incorporamento pre-embedding, ma non fornisce un segnale visivo per distinguere tra più campioni nel blocco di paraffina e diapositive. Tacche o tintura sul tessuto possono complicare l'analisi o occludere importanti dettagli morfologici. In alternativa, l'identità del tessutoin un blocchetto di non schierati multi-tessuto può essere mantenuta attraverso l'incasso di pezzi di tessuto in una disposizione asimmetrica, ma questo richiede 3 o più pezzi di tessuto e non può consentire disposizione ottimale dei tessuti per l'analisi.
L'orientamento Tag Specimen (spot) è stato sviluppato come un metodo facile ed economico per identificare chiaramente i tessuti in blocchi multi-tessuto e offre molti vantaggi rispetto ai metodi di orientamento esistenti. Lo spot è un piccolo, colorato, nucleo composto da Idrossietil agarosio gel lavorazione e tessuti tintura marcatura, e infiltrati con paraffina (Figura 2C). Il nucleo punto è incorporato su fine accanto a un singolo tessuto in un blocco di paraffina multi-tessuto e appare come un punto colorato nel blocco e in ogni sezione (Figura 1A - D), indicando chiaramente il corretto orientamento del blocco e sezioni per l'identificazione dei tessuti facile.
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Protocol
1. Costruzione di The Spot
- Aggiungere 50 mg di albumina sierica bovina (BSA) per 1 ml di tessuto tintura marcatura in un tubo da 15 ml o 2 ml provetta per microcentrifuga e vortex per 1 minuto o fino a completa dissoluzione.
Nota: per questo protocollo, utilizzare biochimico BSA Grade. Mentre gli altri gradi e purezza non sono stati testati, si prevede che grado e la purezza non avrebbe un impatto significativo sul successo della località. - Calore 9 ml idrossietil gel di agarosio trasformazione in un tubo da 15 ml in un forno a microonde a potenza 30% per 10 sec incrementi finché il gel è completamente sciolto.
- Combina la soluzione colorante-BSA gel elaborazione fuso e in un unico tubo da 15 ml e mescolare accuratamente con una pipetta. Vortex la soluzione.
- Posizionare il tubo conico in frigorifero per un paio di ore o fino a solido.
- Utilizzare una lunga, sottile, spatola metallica o sonda per rilasciare delicatamente il tappo di gel colorato dal tubo conico.
- Utilizzare una lama di bisturi o di rasoio per cut il gel spina trasversalmente in 5 millimetri sezioni spesse. Rimuovere le estremità arrotondate e smaltire come rifiuto (Figura 2A).
- Posizionare le sezioni spina gel appartamento in cassette istologia e tenere in etanolo al 70% per 1 ora. Cambiare la soluzione di etanolo al 70% ogni 2-4 ore per almeno 3 cambiamenti nel corso di un periodo di 24 ore.
- Elaborare manualmente sezioni gel attraverso una serie di etanolo (1 ora ciascuno: 70% etanolo, 80% di etanolo, etanolo al 95%, 100% di etanolo (cambiamenti 3x), poi chiaro in compensazione soluzione 3x per 1 ora ciascuno (ad esempio, idrocarburi alifatici ( xileni sostituto)) sono stati utilizzati in questo protocollo, xileni sono anche accettabili), e si infiltrano con paraffina fusa (3x per 1 ora ciascuno), manualmente o in un processer tessuti.
Nota: Prima di completa disidratazione in etanolo al 100%, il colorante può fuoriuscire dal tappo di gel che potrebbero influenzare altri tessuti ed i reagenti liquidi in un processatore automatico. In quanto tale, la reidratazione manuale è altamente raccomandato, il trattamento comunque automatizzati è equalleato efficace. - Più sezioni gel trasformati Incorpora con paraffina standard di incorporare metodologia (Figura 2B). Lasciare raffreddare i blocchi e indurire e poi a temperatura ambiente.
- Utilizzare un ago dermico pugno di dimensioni desiderate per rimuovere nuclei punto dalle sezioni gel incorporate fino a quando il blocco è esaurito (Figura 2C). Un blocco singolo può fornire fino a 20 x 2 mm 2 core. Conservare i nuclei in un luogo fresco. Utilizzare dermica pugno in questo protocollo vedono figure, da 1,5 mm (figure 1D e 2D) o 2 mm (figure 1B, 1C e 2C).
2. Utilizzando luoghi da blocchi Orient non schierati
- Creare un diagramma di orientamento tessuto per indicare le posizioni desiderate e le identità di tutti i singoli pezzi di tessuto devono essere integrate insieme, e la posizione del posto.
NOTA: Il diagramma orientamento tessuto è una mappa illustrata che include la pposizioni hysical di tutti i pezzi di tessuto etichettati con identificatori e la posizione del posto. Può essere creato elettronica o può essere disegnato a mano. Lo schema dovrebbe essere creato utilizzando qualsiasi metodo si adatta meglio il tecnico e ricercatore di utilizzare il prodotto finale. Questa mappa servirà come guida per il ricercatore così i campioni possono essere facilmente identificati durante l'analisi microscopica. La mappa utilizzata in questo protocollo è stato disegnato. Raffigura un blocco di tessuto e vetro microscopio con ogni pezzo di tessuto e del punto disegnato ed etichettati nella stessa posizione del blocco tessuto reale e scivolo. - Trattare i pezzi di tessuto normalmente, in modo che essi rimangano adeguatamente identificati durante le fasi di estrapolazione e di trasformazione. Per questo protocollo, elaborare i tessuti per 1 ora ciascuno in: 70% etanolo, 80% di etanolo, etanolo al 95%, 100% di etanolo (cambiamenti x3), idrocarburi alifatici (xileni sostitutivi) (cambiamenti x3), e fuso infiltrazione tissutale paraffina alla 60 ° C (modifiche x3).
NOTA: All tessuti devono essere trattati secondo le procedure di laboratorio di istologia standard. Ciò può essere variabile a causa procedura di laboratorio individuale, dimensioni del tessuto e tipo, ma ciò non pregiudica la possibilità di utilizzare il posto come strumento di orientamento. - Disporre pezzi di tessuto sulla stazione embedding nelle posizioni assegnate corrette secondo lo schema orientamento tessuti. Utilizzare lo schema orientamento tessuti come riferimento per guidare il tecnico su come organizzare i pezzi Spot e del tessuto in ogni blocco.
NOTA: In questo protocollo il tecnico inserisce l'incorporamento a mano mappa di orientamento vicino alla stazione di incorporamento e disposti i pezzi di tessuto sulla stazione embedding esattamente la stessa disposizione come disegnato nel diagramma. Ciò garantisce che tutti i pezzi di tessuto rimangono correttamente identificabile nel prodotto finale. Questo è assolutamente fondamentale per il successo nell'uso di blocchi multi-tessuto. - Assicurarsi che il nucleo punto è più alto di tutti i pezzi di tessuto per essere incorporati nel blocco.
- Incorpora i pezzi di tessuto e poi il punto sulla fine (trasversale) nelle posizioni corrette in base allo schema orientamento tessuto utilizzando la metodologia incorporamento standard. Se necessario, tenere il punto (s) in posizione verticale con una pinza fino a quando la paraffina si è solidificata sufficiente che il punto (s) non sarà cadere (1-2 min).
- Sezione e macchia paraffina sezioni con lo spot con metodologia standard.
- Lasciare le sezioni di galleggiare su un bagno di acqua a 40 ° C e di applicare un vetrino carica positiva (slides non caricate non sono stati testati). Essiccare i vetrini in forno a 60 ° C per almeno 20 min.
- Porre i vetrini in un coloratore automatico e trattati attraverso i seguenti reagenti: xileni (xileni 1-5 min, xileni 2 e 3-2 minuti, ciascuno), il 100% di etanolo (2 min), il 95% di etanolo (1 min), 80 % di etanolo (30 sec), il 70% di etanolo (30 sec), acqua corrente del rubinetto (2 min), ematossilina (1,5 min), acqua corrente del rubinetto (3 min), alcol acida (1 minuto), acqua corrente del rubinetto (2 min ), blReattivo uing (1 minuto), acqua corrente (2 min), l'80% di etanolo (30 sec), eosina (1 minuto), acqua corrente (10 sec), l'80% di etanolo (1 min), il 100% di etanolo (3 cambi, 2 min ciascuno), xileni (3 cambi, 30 sec ciascuno).
- Coprire i vetrini con vetrini, montati con mezzo di montaggio.
NOTA: In questo protocollo, la histotechnician sezionato i blocchi di paraffina su un microtomo in 5 sezioni micron. Per questo protocollo abbiamo utilizzato un coloratore automatico, tuttavia uguali risultati possono essere ottenuti mediante colorazione manuale.
3. posto nella TMA (Manuale Kit TMA)
- Creare un diagramma di orientamento dei tessuti, come previsto al punto 2.1 e assegnare la posizione desiderata (s) del posto.
- Riempire lo stampo TMA con paraffina fusa in una stazione di incorporamento. Poiché lo stampo si raffredda, incorporare loco (s) sull'estremità a margine dello stampo TMA nelle posizioni desiderate indicate dal diagramma orientamento tessuti. Se necessario, tenere il punto (s) in posizione verticale con una pinza fino al ettari di paraffinas solidificato sufficiente che il punto (s) non sarà cadere (1-2 min).
- Montare i nuclei TMA secondo le istruzioni del produttore e per quanto riguarda la posizione dello spot (s) a margine di matrice (Figura 2D), e seguire i protocolli di sezionamento e di colorazione standard.
NOTA: Si prega di vedere il punto 2.6 per vedere i sezionamento e colorazione metodi utilizzati in questo protocollo.
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Representative Results
Lo spot appare come un giro, puntino dai colori vivaci nel blocco di paraffina (Figura 1A e 2D), in tutte le sezioni di paraffina, e rimane sul vetrino attraverso la procedura di H & E o colorazione IHC (Figure 1B - 1D e 2D). Questo evidenti aiuti segnale visivo sia la histotechnician e ricercatore a identificare ogni pezzo di tessuto individuo e semplifica la comunicazione come il histotechnician possono utilizzare questo segnale visivo per indicare la disposizione dei pezzi di tessuto al ricercatore la raccolta di dati dal vetrino al microscopio. Lo schema di orientamento tessuto deve essere incluso con le diapositive forniti al ricercatore e spiegato in dettaglio quindi non ci sarà alcuna confusione durante l'analisi microscopica. Figura 2A mostra i risultati di sezionamento delle solidificati, colorato spine gel agarosio. Figura 2B mostra il risultato di incorporare la spina gel sezionatos in un blocco di paraffina. Figura 2C mostra i risultati con un punzone dermica per produrre i nuclei SPOT.
Figura 1: SPOT core si creano facilmente e immediatamente visibili in blocchi di tessuto e diapositive (A) punti sono ben visibili nel blocco incorporato.. (B) i punti consentono un facile orientamento e identificazione dei tessuti per i blocchi multi-tessuti contenenti tessuti che appaiono simili da diversi gruppi di individui / trattamento. (C) macchie consentono ogni nucleo di un tessuto microarray ad essere utilizzato per campioni di tessuto preziosi. (D) Vista del microscopio delle SPOT adiacente ad un nucleo TMA. Le frecce indicano il punto. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. 
Figura 2:. Preparazione di nuclei Spot (A) solidificati idrossietil spine agarosio sono liberati dalle provette Eppendorf e tagliare trasversalmente in 5 fette mm. (B) le fette multiple sono integrati in un unico blocco di paraffina e (C) un pugno cutanea viene utilizzato per rimuovere le macchie core. (D) punti sono incorporati nei margini di un tessuto microarray. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Preparazione di successo e l'utilizzo dei luoghi richiede un'attenta adesione ad alcuni passaggi tecnici. Fusione del agarosio idrossietil dovrebbe essere fatto lentamente ea fuoco basso. Melting rapidamente attraverso l'alta temperatura può provocare un certo dettaglio della agarosio per risultati non ottimali. Quando si taglia le spine colorante carichi a pezzi per la lavorazione, assicurarsi che lo spessore di ciascun pezzo è superiore a 4,5 mm e non supera 7 mm. Le estremità arrotondate vengono rimossi come rifiuti in quanto non sono uniformemente 5 mm di spessore. Pezzi meno di 5 mm comporterà la creazione di punti corti che rischiano di essere esaurito sezionando prima dell'esaurimento di materiale tessuto adiacente. Al fine di garantire il posto è presente attraverso la totalità del blocco, i pezzi devono essere di almeno 4,5-5 mm. Per garantire il corretto infiltrazione di cera, tuttavia, i pezzi non dovrebbero superare i 7 mm. Quando disidratare i pezzi di tintura per cera infiltrazione, il colorante lisciviare leggermente fuori i pezzi al lower concentrazioni di etanolo. La lisciviazione non incide il prodotto finale, i punti sarà ancora intensamente colorato e ben visibile. La lisciviazione potrebbe impatto altri tessuti, però, così sezioni di tessuto non deve essere processato negli stessi bagni, come i pezzi di tintura fino a quando i pezzi hanno raggiunto il 100% di etanolo.
Quando si posizionano i punti nei blocchi schierati, in modo che qualsiasi altro posizionamento tessuti è completo prima di aggiungere il punto. Dal momento che il punto è infiltrati di paraffina, cera fusa del blocco destinatario può cominciare a sciogliere il nucleo punto, se è consentito di sedersi per troppo tempo. Disporre tutti i pezzi di tessuto in primo luogo, aggiungere il nucleo posto e trasferire immediatamente il blocco di un piatto freddo per evitare la fusione del posto.
Lo spot può essere modificato per adattarsi alla maggior parte dei flussi di lavoro di laboratorio di istologia. Il colore del colorante può essere cambiato per contrasto ottimale in ogni applicazione. Colorante rosso o nero produce trasparente ad alto contrasto su vetrini IHC colorati, wentre Il punto rosso non è così accattivante in uno scivolo H & E macchiato di sezioni del rene schierati. Per H & E diapositive, macchie verdi o gialli tendono a fornire un contrasto maggiore. Inoltre, sotto l'alto calore durante i processi come il calore indotto recupero di un antigene per immunoistochimica, l'agarosio idrossietil scioglie. BSA viene aggiunto il colorante durante la preparazione SPOT per mantenere un posto colorata sul vetrino anche dopo metodi di recupero di alto calore. Se le diapositive non saranno esposti a calore elevato, la BSA può essere omesso per la produzione di posto più veloce.
Gli aspetti più critici dell'utilizzo di Spot sono per la creazione e il mantenimento di una chiara e concisa mappa di orientamento e la fedele adesione alla mappa quando si posiziona il punto. Se usato correttamente, il punto riduce confusione su disposizione del tessuto e semplifica la comunicazione tra tecnici e ricercatori, come il tecnico embedding può semplicemente indicare la posizione del posto e il rapporto del tissues ad esso su una mappa. SPOT è chiaramente visibile in tutte le fasi di preparazione dei vetrini consentendo il montaggio su vetrini per l'analisi a valle facilitare sezione estremamente coerente. In contrasto con marcatori fisiologici, il punto è chiaramente visibile in ogni sezione e non modifica il tessuto in qualsiasi modo, impedendo l'introduzione di artefatti o ostruzione della morfologia. A differenza del metodo di inserimento dei tessuti asimmetricamente, il spot permette tecnici e ricercatori flessibilità nella disposizione dei tessuti per ottimizzare analisi visiva al microscopio. Nel TMA, il punto può essere collocato al di fuori della matrice principale, eliminando la necessità di spazi vuoti, assemblee asimmetrici, o per anime faro, consentendo l'intero array di essere composto da sezioni di tessuto di pregio. Lo spot può anche essere usato per indicare la direzione anatomica (per esempio, distale o prossimale) di campioni di tessuto. Lo spot è una soluzione semplice ea basso costo per l'orientamento facile e costante di campioni di tessuto durante la costruzione e lanalisi di blocchi multi-tessuti e TMA.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Brent Harris per la fornitura di revisione critica del manoscritto. Questi studi sono stati condotti presso il Lombardi Comprehensive Cancer Center istopatologia e Tissue risorsa comune che è supportato in parte dal NIH / NCI sovvenzione P30-CA051008. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale della National Cancer Institute e il National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histogel Specimen Processing Gel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html |
| Tissue Marking Dye | Triangle Biomedical Sciences, Inc. | TMD-5 | Any tissue marking dye would most likely be sufficient. |
| Arraymold Kit A 2 mm (60 core) | Arraymold | 20015A | Any manual tissue arrayer would work similarly. |
References
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