Summary
Presentiamo protocolli raffinati che permettono il monitoraggio in vivo di funzione gruppo motore nel topo. Tecniche per la misura del potenziale d'azione muscolare composto (CMAP) e il numero di stima blocco motore (MUNE) nei muscoli degli arti posteriori del mouse innervati dal nervo sciatico sono descritti.
Introduction
Numero di unità del motore stima (MUNE) è stato originariamente descritto da McComas et al. oltre tre decenni fa 1. La tecnica originale era una modifica della tecnica di registrazione del potenziale d'azione muscolare composto (CMAP) che utilizzava un graduale aumento della stimolazione per ottenere incrementi submassimale. Questi incrementi sono stati sommati e media per determinare una dimensione stimata di un potenziale gruppo motore singolo (SMUP). Questa dimensione è stata divisa in risposta CMAP per stimare il numero di unità motorie innervano il muscolo in esame. In seguito la descrizione originale, numerose varianti utilizzando entrambe le risposte elettrofisiologiche e forza incrementale (meccanici) misurazioni sono stati utilizzati in entrambi gli studi umani e modelli animali 2. La tecnica MUNE è stato modificato da Shefner e colleghi di indagare modelli murini di Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) 3, 4.
Nella descrizione attuale, particolare simplifmodifiche IED delle tecniche MUNE che sono rapidi da eseguire. È importante sottolineare che, CMAP e MUNE consentono misure affidabili in entrambi i topi neonati e adulti 5-8. Individui esperti possono eseguire queste misure in 10-20 minuti per animale, e misure ripetute sono possibili che permette l'acquisizione di dati longitudinali 5. Negli studi in corso, ci avvaliamo di un sistema elettrodiagnostica clinica. Nella nostra esperienza, i sistemi electrodiagnostic clinici sono ottimizzati per l'acquisizione rapida ed efficiente dei dati elettrofisiologici in vivo, impianti di perforazione elettrofisiologiche tuttavia standard possono essere facilmente adattate per questa applicazione.
Protocol
Questo protocollo è stato approvato dal e aderisce alle linee guida per la cura degli animali e dell'etica della Ohio State University Wexner Medical Center.
1. Preparazione animali e Anestesia
- Indossare guanti durante la manipolazione di topi.
- Anestetizzare topi con isoflurano per via inalatoria e posto in posizione prona. Indurre l'anestesia utilizzando 3-5% isoflurano e 1 L per minuto O 2 portata. Dopo l'induzione dell'anestesia, mantenere l'anestesia al 2-3% e 1 L per minuto O 2 portata.
- Regolare O 2 flusso e la percentuale per l'anestesia isoflurano adeguate secondo stato di malattia, l'età, e la frequenza respiratoria dell'animale. Animali più piccoli o più deboli possono richiedere meno isoflurano per un'adeguata anestesia (ossia da 1,5 al 2,5% isoflurano).
- Confermare anestesia adeguata applicando luce degli arti posteriori pressione zampa con un oggetto come il forcipe per dimostrare una mancanza di risposta recesso.;
- Mantenere la temperatura a 37 ° C temperatura della superficie di una piastra di riscaldamento termostatico come variazione di temperatura possono influenzare dimensioni CMAP e durata.
- Applicare una pomata a base di petrolio veterinario per gli occhi per prevenire la secchezza. Monitorare il livello di anestesia osservare frequenza respiratoria e la valutazione di risposte di ritiro seguenti pressione applicata al pad piede tramite pinze.
- Rimuovere i capelli dal arti posteriori da studiare utilizzando Clippers. Dopo la rimozione dei peli dal hindlimb (s) da studiare, leggermente estendere arti posteriori al ginocchio, abdurre sui fianchi e apporre sulla superficie di lavoro con nastro adesivo (come mostrato nella Figura 1).
- Seguendo le registrazioni e la sospensione di anestesia CMAP e Mune, non lasciare incustoditi animale fino a che non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Non restituire animale alla compagnia di altri animali fino alla completa guarigione.
2. Recording Setup e Impianti
- Posizionare gli elettrodi per le registrazioni CMAP e Mune come illustrato nella figura 1.
- Utilizzare due elettrodi ad anello fini per gli elettrodi di registrazione.
- Posizionare la attiva (E1) elettrodo ad anello sulla pelle sovrastante la porzione prossimale del muscolo gastrocnemio di dell'arto posteriore, al ginocchio, e l'elettrodo di riferimento (E2) anello sulla pelle sopra porzione metà metatarsale del piede.
- Al fine di ridurre l'impedenza, rivestire la pelle sottostante gli elettrodi ad anello con il gel per saturare sufficientemente capelli residua e massimizzare il contatto elettrodo-pelle. Evitare l'eccessiva applicazione di gel per elettrodi in quanto ciò potrebbe causare un ponte elettrico tra gli elettrodi e potrebbe impedire la registrazione accurata.
- Per la stimolazione del nervo sciatico a posteriori degli arti prossimale, utilizzare due isolati 28 G aghi monopolare come il catodo e l'anodo. Inserire il catodo in corrispondenza della zona di arto posteriore prossimale e inserire l'anode più prossimale nel tessuto sottocutaneo sovrastante l'osso sacro.
- Evitare di inserire gli elettrodi stimolanti eccessivamente vicino al nervo sciatico o troppo profonde che avrebbe direttamente lesione al nervo sciatico o altra struttura. La figura 1 illustra il posizionamento degli elettrodi.
- Per l'elettrodo di terra, mettere un elettrodo di superficie disponibile sul arto posteriore controlaterale o la coda.
3. Acquisizione Dati
- CMAP sciatico
- Ottenere risposte CMAP sciatico stimolando il nervo sciatico con impulsi ad onda quadra di 0,1 ms di durata e l'intensità che vanno 1-10 mA.
- Acquisire risposte CMAP con intensità crescente fino stimolo l'ampiezza della risposta non aumenta più. Quindi, al fine di garantire la stimolazione sopramassimale, aumentare la stimolazione a ~ 120% della intensità dello stimolo utilizzato per ottenere una risposta massima ed ottenere una reazione aggiuntiva. Se non vi è aumentare ulteriormente in la dimensione CMAP, registra questa risposta come la CMAP massima.
- Registra basale-picco e picco-picco ampiezze CMAP in mV (Figura 2).
- Peso medio potenziale Motor Unit (SMUP) Dimensioni e MUNE Calcolo
- Determinare la dimensione media singola potenziale blocco motore (SMUP) con una tecnica di stimolazione incrementale 1. Per ottenere risposte incrementali, fornire stimolazione submassimale di durata 0.1 ms ad una frequenza di 1 Hz, aumentando l'intensità di 0,03 mA passi per ottenere i minimi tutto o niente risposte. Ottenere la risposta iniziale con intensità dello stimolo tra 0,21 e 0,70 mA mA.
- Se la risposta iniziale non si verifica con intensità dello stimolo tra 0,21 e 0,70 mA mA, regolare la posizione catodo stimolante sia più vicino o più lontano dalla posizione del nervo sciatico nella coscia prossimale per diminuire o aumentare l'intensità dello stimolo necessaria rispettivamente.
- Se la i inizialencremental risposta è ottenuta con una intensità dello stimolo tra 0,21 e 0,70 mA mA e soddisfa i criteri sotto riportate (3.2.2), memorizzare e registrare incrementi aggiuntivi con crescente intensità stimolo regolazione a passi di 0,03 mA per ottenere un totale di 9 incrementi aggiuntivi soddisfare i criteri stabiliti.
- Durante le misurazioni delle risposte incrementali, in modo che ogni incremento soddisfi i seguenti criteri.
- Assicurarsi che il picco negativo iniziale delle risposte incrementali è allineato temporalmente all'interno del picco negativo della risposta massima CMAP mostrato come la porzione ombreggiata dell'illustrazione CMAP in figura 2.
- Assicurarsi che ogni risposta incrementale è stabile e senza frazionamento, stabilito osservando tre risposte duplicate. Distinguere le risposte visivamente incrementali in tempo reale (sovrapposto gli incrementi registrati in precedenza).
Nota: Ogni incremento dovrebbe essere visivamente distintie più grandi rispetto alla risposta precedente (Figura 3). Analisi in tempo reale consente il riconoscimento di ampiezza maggiore (incrementali) risposte rispetto alle risposte precedenti, e piccoli cambiamenti attribuibili a rumore di fondo può essere ignorato. Una vista sovrapposta di 10 incrementi è mostrata in figura 4 (B e D) per illustrare ulteriormente questo punto. - Dopo la conferma visivamente ogni incremento, in modo che la differenza di ampiezza misurata (confermato risposta-ampiezza della risposta precedente = differenza di ampiezza) è di almeno 25 mV.
- Se l'incremento è inferiore a 25 mV, scartare e ri-misurare la risposta. Dopo aver registrato 10 risposte incrementali, valutare gli incrementi per garantire che l'ampiezza di ciascuna risposta incrementale individuo non è maggiore di 1/3 della somma di tutti i dieci incrementi (cioè l'ampiezza totale della risposta finale). Se questa condizione non è soddisfatta, ri-misurare le risposte incrementali.
- La media dei 10 valori incrementali per dare una stima del potenziale ampiezza media singola unità motoria (SMUP) (Figura 3). Nota: Figura 3 in dettaglio la base del calcolo medio SMUP, ma l'ampiezza media SMUP può essere calcolato semplicemente dividendo l'intera ampiezza della risposta incrementale finale per il numero totale di incrementi (cioè, 10).
Esempi di calcolo individuali SMUP (illustrata nella figura 3):
SMUP 1 = picco-picco di ampiezza di incremento 1
SMUP 1 = 0,050 mV
SMUP 2 = (picco-picco di ampiezza di incremento 2) - (ampiezza picco-picco di incremento 1)
SMUP 2 = 0.150 mV-0,050 mV = 0,100 mV- Calcolare ogni successivo incremento (fino a un totale di 10), ed effettuare una media dei dieci incrementi.
- Calcolare MUNE dividendo la massima ampiezza CMAP (picco-picco) dall'ampiezza media SMUP (picco-picco). (MUNE = CMAP / SMUP media). In alcuni sistemi elettrofisiologici, gli incrementi SMUP sono misurati in mV, mentre CMAP è tipicamente fornita in mV. Quando necessario, convertire CMAP e SMUP risultati di unità simili prima del calcolo MUNE.
- Determinare la dimensione media singola potenziale blocco motore (SMUP) con una tecnica di stimolazione incrementale 1. Per ottenere risposte incrementali, fornire stimolazione submassimale di durata 0.1 ms ad una frequenza di 1 Hz, aumentando l'intensità di 0,03 mA passi per ottenere i minimi tutto o niente risposte. Ottenere la risposta iniziale con intensità dello stimolo tra 0,21 e 0,70 mA mA.
Representative Results
Le tecniche di CMAP e MUNE descritti in questo rapporto consentire la registrazione della funzione neuromuscolare dei muscoli innervati sciatico degli arti posteriori che utilizzano il posizionamento degli elettrodi mini-invasiva (Figura 1). Sopramassimale CMAP dimensioni, che rappresenta l'uscita totale da un gruppo muscolare, può essere descritto utilizzando i parametri di ampiezza e la zona (figura 2), tuttavia, nei metodi attuali, usiamo ampiezza di quantificare la CMAP e le dimensioni SMUP. Dal momento che le misure di risposta CMAP sommati depolarizzazione delle fibre muscolari in un muscolo, la patologia ovunque dal motoneurone alla fibra muscolare può portare a riduzione delle dimensioni CMAP. Pertanto, CMAP fornisce un'eccellente misura dello stato funzionale totale. Come previsto, le dimensioni CMAP aumenterà durante lo sviluppo 5. A causa dei cambiamenti di compensazione che possono verificarsi a seguito denervazione (cioè garanzie germinazione), formato CMAP può essere mantenuto, nonostante i processi di neur motoreo perdita assonale motore. Pertanto, la tecnica del MUNE è necessario per determinare la motoneurone o ingresso assone al muscolo o gruppo di muscoli in fase di test. La registrazione di incrementi individuali (Figura 3) permette di stimare la produzione media di singole unità motorie (dimensioni SMUP) per dare informazioni più dettagliate sullo stato funzionale delle unità motorie.
CMAP e MUNE possono essere utilizzati per misurare la funzione neuromuscolare in vari modelli murini di malattie neuromuscolari. Nella Figura 4, i risultati in un mouse controllo di adulti e un topo adulto di 11 settimane dopo sciatico schiacciamento del nervo si contrappongono. A seguito di schiacciamento del nervo sciatico, MUNE è notevolmente ridotta a 50 unità motorie funzionali stimate rispetto ai normali risultati di 278 unità motorie funzionali nel topo di controllo. Al contrario, l'ampiezza CMAP nell'animale schiacciato (39,6 mV basale-picco, 74.9 mV picco-picco) mostra solo lieve riduzione rispetto al controllo (49,0 mV basale-to-peak, 84,2 mV picco a picco) a causa della garanzia germinazione.
Figura 1. Posizionamento degli elettrodi. Il nero (E1) elettrodo "attivo" (A) e rosso (E2) elettrodo di registrazione "di riferimento" (B) sono disposti sopra gastrocnemio in corrispondenza della porzione prossimale del gastrocnemio al ginocchio. Il catodo stimolante (nero) (C) e l'anodo (rosso) (D) sono inseriti prossimale sottocutanea agli elettrodi di registrazione per generare risposte distali. Un elettrodo a disco usa e getta (D) è posto sulla dell'arto posteriore, la coda o sacro come terreno per ridurre al minimo artefatto. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Composto Muscle potenziale d'azione. È descritto un esempio di una risposta CMAP rappresentante. (A) L'ampiezza basale-picco è misurata dalla linea di base isoelettrica al picco negativo iniziale (tensione negativa è raffigurato sopra la linea di base). ( B) L'ampiezza picco-picco è misurata dalla tensione picco negativo di tensione di picco positiva. L'area grigia ombreggiata indica l'area del picco negativo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. risposte incrementali. Due risposte incrementali rappresentativi sono mostrati sovrapposti e in isolazione. Per MUNE ampiezze calcolo di ciascun incremento sono misurati da picco a picco. Incremento # 1 è l'iniziale tutto o niente risposta registrate e rappresenta una singola potenziale gruppo motore (SMUP). Ogni successivo incremento (# 2-10) rappresenta un aumento quantica sovrapposta alla precedente risposta. Pertanto per ottenere le ampiezze SMUP per incrementi 2-10, l'ampiezza della risposta precedente viene sottratto l'ampiezza dell'incremento ottenuto. Fare click qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Esempio sciatico CMAP e MUNE. (A) del potenziale d'azione muscolare composto sciatico (CMAP) in un adulto (6 mesi di età) il controllo del mouse con base-picco di ampiezza di 49,0 mV e peak-to-ampiezza di picco 84,2 mV. Sensibilità dello schermo = 10 mV per divisione e la durata dello schermo di 10 ms. (B) Dieci corrispondenti risposte incrementali (nel topo di controllo) con un'ampiezza totale di 3.028 mV sono divisi da 10 a determinare la dimensione SMUP media (0,3028 mV). Sensibilità dello schermo = 0.5 mV e velocità di scansione di 1 ms per divisione. Calcolato MUNE = 278 (MUNE = CMAP / SMUP media (84,2 mV / 0,3028 mV)) (C) sciatico CMAP 11 settimane seguenti schiacciamento del nervo sciatico nel topo adulto (6 mesi di età) che mostrano lievemente ridotta ampiezza della linea di base-picco ( 39,6 mV) e il picco-picco di ampiezza (74,9 mV). Sensibilità dello schermo = 10 mV per divisione e velocità di scansione di 1 ms per divisione. (D) Ten corrispondente risposte incrementali (nel topo con schiacciamento del nervo) con ampiezza totale di picco-picco di 14,923 mV diviso 10 per ottenere un SMUP media dimensioni di 1,4923 mV. Sensibilità dello schermo = 2 mV per divisione e una velocità di scansione di 1 ms per divisione. Calcolato MUNE = 50 (= MUNE CMAP/ SMUP media (74,9 mV / 1,4923 mV)). (** Si noti la diversa sensibilità per le risposte incrementali del mouse calca sciatico). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
MUNE e CMAP sono misure clinicamente rilevanti spesso utilizzate in studi di ricerca e di monitoraggio di pazienti con disturbi neuromuscolari come la SLA e l'atrofia muscolare spinale (SMA) 9, 10. Per esempio, in SMA, CMAP e MUNE correlano bene con l'età, la gravità e clinica misure di funzionalità 10-14. Entrambe le misure sono poco invasive e permettono la valutazione della funzione longitudinalmente nello stesso individuo. È importante sottolineare che tali misure non possono misurare l'attivazione o reclutamento del gruppo motore motoneuroni corticali, ma forniscono una valutazione clinicamente rilevante dell'integrità del motoneurone e la sua controparte funzionale, il gruppo motore.
Modelli animali di malattie neuromuscolari sono fondamentali per la comprensione dei meccanismi patogenetici della malattia umana e per lo sviluppo preclinico di agenti terapeutici potenzialmente efficaci. La capacità di tradurre misure di esito e biomarcatori che possono essereutilizzato tra le specie in grado di facilitare e accelerare la traduzione di promettenti risultati preclinici a test clinici sull'uomo. Diversi gruppi hanno già utilizzato entrambi (meccanici) misurazioni elettrofisiologiche e di forza per stimare la funzione blocco motore in modelli murini 2-4, 15-22. Data la relativa complessità delle misure, abbiamo affinato queste tecniche in un formato visivo per consentire un uso più diffuso e implementazione nei topi. Il formato del video dimostrativo e di istruzione, consente passaggi chiave della procedura da evidenziare e potenziali insidie da affrontare. L'applicazione di queste tecniche a test preclinici di potenziali terapie nelle malattie del motoneurone può migliorare la traduzione di terapie putativi dai topi alle malattie umane.
Ci sono diversi passaggi critici del processo di acquisizione delle risposte CMAP e mune. Posizionamento degli elettrodi di registrazione corretta e coerente e sufficiente il contatto elettrodo con la cervaarto sono critici per la misura riproducibile di ampiezza e di ridurre il rumore di fondo. Pertanto, uno stretto contatto tra la pelle degli arti posteriori ed elettrodi dovrebbe essere confermato in modo coerente. Abbiamo scoperto che elettrodi di superficie offrono registrazioni CMAP e Mune più coerente di elettrodi ad ago. A causa di tessuti sottocutanei molto sottili, piccoli movimenti della superficie di registrazione ago può portare ad ampie variazioni in ampiezza CMAP. Inoltre, la natura più invasivo di elettrodi ad ago non è ottimale per i topi neonati o studi longitudinali a causa di potenziali perturbazioni muscolare e lesioni. Un potenziale svantaggio di non selettivi, registrazioni elettrodo superficiale si riferisce alla possibilità di risoluzione fenotipo diminuita se un particolare muscolo è più o meno coinvolti rispetto ad un altro, e questo è stato riportato in un modello di topo ALS 21.
Acquisire la dimensione media SMUP è tecnicamente più impegnativo rispetto alla CMAP. A causa delle respons più piccolie dimensioni (nell'intervallo mV anziché mV) rumore di fondo può essere più problematico. Il rumore di fondo può essere ridotto regolando l'elettrodo di terra, catodo, anodo, e il controllo di altre apparecchiature elettriche in prossimità del setup sperimentale. Una gabbia di Faraday, tipicamente utilizzato per applicazioni elettrofisiologiche intracellulari, non è richiesto. Vista la determinazione delle singole risposte SMUP è l'abilità più difficili da acquisire e prende la pratica per ottenere risultati coerenti con adeguata ripetibilità. È importante garantire che le SMUPs che vengono registrate avviare entro la durata della risposta CMAP massima. Abbiamo definito i criteri per l'accettazione delle risposte individuali incrementali per rendere questo processo più semplice da eseguire e per aumentare l'affidabilità intra e inter-rater.
Un potenziale svantaggio della tecnica MUNE incrementale include la possibilità di sovrastimare il numero di unità motorie funzionali a causa di alternanza di motounità r. Abbiamo usato una tecnica simile a Shefner et al. dal fatto che ciascuna risposta dovrebbe essere considerata riproducibile un totale di 3 volte per ridurre l'impatto di questo fenomeno 3.
Nella nostra esperienza, i sistemi electrodiagnostic clinici sono ottimizzati per gli studi qui descritti a causa di una maggiore ergonomia dell'interfaccia sistema esaminatore-elettrodiagnostico consentono facilità di controllo. Il sistema a due canali utilizzati nel nostro laboratorio è dotato di due canali non commutata amplificazione mediante un amplificatore con 24 bit Convertitore analogico-digitale ed una frequenza di campionamento di 48 kHz per canale. Hardware guadagno può essere regolato da 10nV a 100 mV / divisione. Il filtro a bassa frequenza ha un range da 0,2 Hz-5 kHz, e le impostazioni del filtro ad alta frequenza varia da 30 Hz-10 kHz. Uno stimolatore a corrente costante viene utilizzata (intensità: 0-100 mA; durata: 0.02-1 ms). La maggior parte dei sistemi clinici hanno simili caratteristiche adeguate e possono essere regolati per registrare adeguatamente CMAP e Mune risposte. Ladditionally, piattaforme elettrofisiologici standard possono essere assemblati per registrare adeguatamente CMAP e MUNE, ma l'interfaccia può essere necessario regolare per facilità di registrazione e stimolazione rapida identificazione di CMAP e SMUP risposte.
Abbiamo già utilizzato le tecniche di CMAP e MUNE descritto qui per consentire una valutazione rapida e riproducibile dello sciatico muscolo innervato della dell'arto posteriore nei topi durante il periodo postnatale precoce all'età adulta 5. Queste tecniche permettono di valutazione in modelli murini in cui test comportamentali per la funzione del motore non è fattibile o è meno affidabile. L'applicazione di questa tecnica per topi neonati facilita lo studio dello sviluppo gruppo motore e ha il potenziale per espandere la nostra comprensione del motoneurone innervazione e la potatura. Ad esempio, abbiamo dimostrato che il numero di unità motorie funzionali registrati con MUNE aumenterà durante potatura da polyneuronal a innervazione mononeuronal durante la prima due settimanes della vita nei topi neonatale 5. La possibilità di testare topi per lunghi periodi di tempo con questa tecnica si presta allo studio della risposta dell'unità motore lesione del nervo periferico, disturbi neuromuscolari ereditarie e dell'invecchiamento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pro trimmer Pet Grooming Kit | Oster | 078577-010-003 | clippers for hair removal |
| Synergy T2 EMG system | Natus Neurology | Model no longer available | portable electrodiagnostic system |
| monopolar needles 28 G | Teca | 017K121 | cathode and anode stimulating electrodes |
| Alpine Biomed Digital Ring Electrode with twisted wires and 1.5 mm TP connectors. | Alpine Biomed | 9013S0312 | recording electrodes |
| Helping Hands alligator clip with iron base | Radio Shack | 64-079 | Maintaining recording electrode placement |
| Spectra 360 Electrode Gel | Parker Laboratories | 9013G5012 | applied to reduce skin impedance |
| monoject curved tip irrigating syringe | Covidien | 81412012 | utilized for application of electrode gel |
| EMG needle cable | Teca | 902-RLC-TP | to connect monopolar electrodes to electrodiagnostic stimulator |
| Disposable 2" x 2" Electrode or similar trimmed as needed | Carefusion | 019-415000 | ground electrode |
| Small Heating Plate with built-in RTD sensor, 15 x10 cm | World Precision Instruments | 61830 | warming plate used with animal temperature controller to transmit heat to animal |
| Silicone pad for use with ATC2000 | World Precision Instruments | 503573 | conductive removable pad to cover warming plate for easy cleaning |
| Animal temperature controller | World Precision Instruments | ATC2000 | low noise animal heating system for maintaining animal temperature |
| Veterinarian petroleum-based ophthalmic ointment | Puralube | 26870 | applied during anesthesia to avoid corneal injury |
References
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