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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

で閉鎖性頭部外傷性脳損傷を負わせる方法 Published: June 30, 2015 doi: 10.3791/52905
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 2, 1
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Genetics, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Natural Sciences, University of Puerto Rico-Aguadilla

ERRATUM NOTICE

Summary

ここでは、 ショウジョウバエにおいて閉鎖性頭部外傷性脳損傷（TBI）を与えるための方法を説明します。この方法は、ハエのために利用可能な実験ツールと技術の広大な配列を使用して、TBI病理の根底にある細胞および分子メカニズムを調査するためのゲートウェイを提供します。

Abstract

外傷性脳損傷（TBI）、物理的な認知、行動機能と死の障害を引き起こし、毎年何百万人もの人々に影響を与えます。 ショウジョウバエを用いた研究は、神経学的プロセスを理解する上で重要なブレークスルーを貢献しています。したがって、ヒトにおけるTBI病理の細胞および分子基盤を理解することを目標に、私たちはハエに閉鎖性頭部TBIを与えるためにハイインパクトトラウマ（HIT）装置を開発しました。ハエは、このような一時的な無能力および進行性神経変性などのヒトTBIと一致HITデバイス表示の表現型を行いました。 HITデバイスは、フライ脳への機械的損傷を引き起こし、バイアルの壁にハエを推進するために、スプリングベースのメ​​カニズムを使用しています。デバイスは、その操作は簡単で、迅速で、安価で構築することが容易であり、再現性のある結果を生成します。したがって、HIT装置は、既存の実験ツールとハエは基本対処するための技術と組み合わせることができTBIの診断と治療法の開発につながる可能性がTBIについての質問。具体的には、HITデバイスはTBI病状の遺伝的基礎を理解するために、大規模な遺伝子スクリーニングを行うことができます。

Introduction

外傷性脳損傷（TBI）は、外部の機械的な力から脳への損傷として定義されます。このような鈍力と脳が頭蓋骨の内側に当たるせる慣性加速と減速力などの閉鎖性頭部力から最も一般的には、TBIの結果。米国では、50,000人がTBIから毎年死亡し、2.5から6500000個人は、物理的な認知および行動上の問題1,2を衰弱させるなど、TBIの結果、で生きていると推定されています。 TBIの結果は、脳への主要な機械的傷害にも時間3-5にわたって生じる脳への二次細胞および分子の怪我だけでなく、他の組織にだけではなくです。 TBIを診断し、治療するための方法の開発は、TBIは、複雑な疾患過程であるため、困難であることが証明されています。異種の二私の主な傷害、人間の生理、および環境要因の結果の可変性njuriesと病理。根本的な変動要因は、一次損傷の重症度、繰り返しの一次傷害の間の時間、および個々の年齢および遺伝子型が含まれます。各変動要因は、TBIの結果にどのように寄与するかを理解することは、TBI 6,7を診断し、治療するためのアプローチの開発に役立つ可能性があります。

ここでは、TBIの結果に変動要因の寄与を描写するために使用することができるキイロショウジョウバエ （ショウジョウバエ）で閉鎖性頭部TBIを負わする方法について説明します。手のひらに対して激しくフライ培養バイアルの側面を打つ最初の観察は、野生型は、TBIの可能性の高い結果を一時的に行動不能になるために飛ぶ引き起こさに方法がベースにしています。したがって、我々は手打つ作用から加速と減速力を再現するための高インパクトトラウマ（HIT）デバイスを構築しました。高速ムービーが示していることから、単一のストライキHITデバイスは、自分の頭と体8でバイアル壁を数回連絡するハエが発生します。ある程度までは、すべての連絡先は、ハエの脳が跳ね返ると転倒や車のクラッシュ9に人間に何が起こるかに似た頭部カプセル、に対して変形させる可能性があります。したがって、脳10で運動失調が続く一時的無能力、モビリティの緩やかな回復、頭の中で遺伝子発現の変化、および進行性の神経変性を含む、脳損傷と一致HITデバイスディスプレイの表現型で処理したハエ。このように、HITデバイスはハエのために開発された実験ツールと技術の巨大な武器庫を使用して、TBIを研究することが可能となります。

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Protocol

HITデバイスの1建設

  1. 2つのクランプと4本のネジ（ 図1A）を使用して、ボードにスプリングを取り付けます。ボードの幅を基準にクランプを中心とボードの縁と外側のクランプ面一に互いに対してそれらを突き合わせ。クランプを取り付ける前に、バネの上にしっかりとフィットするようにペンチを使用してそれらを曲げます。
    注：HITデバイスを構築するために必要な材料の説明については、表1を参照してください。春のクランプ端部は、基板の端から1/8インチ（3.2ミリメートル）であるべきであり、自由端が3/4インチ（19ミリメートル）て、ボード上に拡張する必要があります。それは板の長さと平行に位置するようにバネを調整します。
  2. ベルクロループの粘着テープで一度周りのばねの自由端を包みます。マジックテープの外縁部は、スプリングの端部と同一平面である必要があります。それはCREによってバネに、バイアルを固定するために使用されるので、マジックテープが重要ですタイトな圧縮フィッティングをレーティング。ベルクロは、多くのバイアルを短時間で処理することができるように、バイアル瓶の容易な接続及び取り外しを可能にします。
  3. タイトな木の板に対して、中心に、逆さまアイスバケットカバーを置きます。オリエント長辺は、ボードの幅と平行になるようアイスバケットカバーの隆起領域。バイアルをバネに取り付けられたとき、スプリングがボード上に平らにしないようにアイスバケットの隆起領域は、木の板よりも1/2インチ（13ミリメートル）高いことに注意してください。
  4. アイスバケットカバーは基板と対象物の間に押し込まれ、動かないように、壁などの固定オブジェクトに対して、装置全体をスライドさせます。
  5. テープ段ボールの底に紙分度器は、バイアルトレイを飛行し、それが完全に垂直位置に引き戻されたときに90°のマークは、ばねと整列されるように、基板の長さに対して、エッジの上に立っています。

2。HIT装置の動作

  1. 空のバイアルにハエやタイトフィットのコットンボールを使用して、バイアルを栓-anesthetized 1と60 CO 2との間に配置します。
  2. それが下から1インチ（2.5センチ）になるまでバイアルにコットンボールを押してバイアルの底1インチ（2.5センチ）にハエを閉じ込めます。これは、1インチ（2.5センチ）のマークでバイアル上に線を描画するために有用です。バイアルのより大きなまたはより小さな領域にハエを閉じ込めることは表現型の重症度に影響を与える可能性があることに注意してください。
  3. ハエはCO 2から移動性を回復するために5分を待ちます。それは5分で完全にCO 2の影響を除去するのに十分であるかどうかを知らないことに留意されたいです。
  4. ベルクロの内縁は、バイアル（ 図1B）の頂部と同じ高さになるまでバイアルに春の終わりを挿入します。春が平らに置かれた場合、バイアルの1インチ（2.5センチ）アイスバケットカバーの隆起領域をオーバーラップする必要があります。バイアルがmを再利用することができますいずれかの回。
  5. 座った状態で、左手の親指と人差し指を使ってマジックテープ領域にバイアルを保持します。右手を使用して、ベンチトップに密な基板を保持します。あるいは、ベンチトップにタイトなボードを保持するために、C-クランプを使用しています。
  6. まっすぐ戻って所望の角度にバネを引き出します。春リリース。バネが完全に止まった状態にしてできるようにします。
  7. 春からバイアルを取り外し、ハエが≥5分間回復することができます。別のストライキにハエを被写体やフライ食品でバイアルにハエを転送します。
    注：種々のアッセイは、HIT装置からストライキの表現型効果を評価することができます。例えば、寿命への影響は、損傷後の時点で生存するハエの割合を分析することによって決定することができ、脳の形態への影響は、ヘッドの組織学的分析によって決定することができ、遺伝子発現に対する効果は、mRNAレベルの定量分析によって決定することができます10。
  8. Determinストライキに供されていない同一の対照ハエを処理することによるストライキによるものではない手続きの電子効果。アイスバケットカバーに対するバイアルの影響が大きな音を生成するので、保護を聞いて着用してください。

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Representative Results

私たちは、ハエが一次損傷後まもなく死ぬ理由を理解することに興味を持っています。死を定量化するために、我々は、一次損傷の24時間以内に死亡したハエの割合である24時間で死亡率指数（MI 24）を 、決定しました。 HIT装置からストライキに供ハエは、ハエの餌とバイアル中で25℃でインキュベートし、そして死んだハエの数は、24時間後に計数しました。私たちは、1〜60分を試験した（、（10〜60ハエを試験した）繰り返しストライキの間の時間をMI 24に影響を与える要因を識別するために、このアプローチを使用し、MI 24がバイアル中のハエの数に影響されないことがわかりました）、またはフライ10のセックス。これとは対照的に、我々は、一次損傷と遺伝子型時の年齢はMI 24に影響を与えなかったことがわかりました。古いハエは若いハエよりも高いMI 24を有し、異なる遺伝子型のハエは大きく異なるMI 24 sでした。

図2において、我々は、一次損傷の重症度は、MI 24に影響を与えるかどうかを試験しました。一次損傷の重症度を変更するには、我々は異なる角度にバネを偏向しました。それぞれの角度については、1118ハエ（標準実験室株）W古いのいずれか0-7または20-27日のバイアルはストライキの間の5分間で4ストライキを行いました。 60ハエの三つのバイアルは、各角度について試験しました。ハエは、糖蜜の食品でバイアルに移し、25℃でインキュベートし、死んだハエの数は、24時間後に計数しました。平均値の平均MI 24と標準エラーは、各角度について計算しました。これらのデータは、偏向のより大きな角度、 すなわちことを明らかにしている。、より重度の一次傷害、偏向角度が小さい、 すなわちより高いMI 24をもたらす。、あまり重傷。これは、両方の0-7及び20-27日齢のハエのために観察されました。また、Katzenberger ら 10、20〜27日齢のフロリダ州にありましたIEは角度≥50°で有意に高いMI 24 0-7より日齢のハエを持っていました。従って、これらのデータは、複数の年齢でMI 24は、一次損傷の重症度と相関することを示しています。

図1
図1：静止位置でHIT装置の上面図のHIT装置の図（A）のイラスト。 （B）HIT装置の側面図。春は、休止位置（暗赤色）に示されており、90°（明るい赤）に偏向されます。

図2
図2：一次傷害重症度は、MI 24と相関我々は0-7日齢のワットのためのMI 24を決定しました1118ハエ（ライトグレーのバー）と20〜27日齢のW 1118ハエ（濃い灰色の棒）は度で示された角度に偏向メートル。0度データがのためにありますHIT装置が施されていないハエ。平均MI 24および平均値の標準誤差が示されています。 0-7と20-27日齢のハエのMI 24が 50°（P <0.05、1両側t検定 ）と角度> 50°で有意に異なっていた（P <0.001、1両側t検定 ）の角度のためではなく< 50°（P> 0.1、1両側t検定 ）。

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Discussion

HIT装置方法は、それがTBI 11を貫通するのではなく、閉鎖性頭部を引き起こすという事実によってハエに外傷を負わせる他の方法と区別されます。また、HIT装置方法は、多くのハエでTBIを与えるために、より少ない時間、労力、およびスキルを取り、その方法は、大規模な遺伝子スクリーニングに、他の方法よりも適しています。最後に、HIT装置によって与え主要な傷害は、脳に限定されるものではないという事実は、制限と利点の両方があります。さらなる研究は、表現型が脳または他の身体部分への外傷によるものであるかどうかを評価する必要があるので、これは制限です。一方、多発性外傷（複数の身体部分への外傷）は、しばしばTBIを伴うとTBI表現型を調節すると考えられているので、HIT装置法は、TBIの表現型の多発性外傷の寄与を調べるために使用することができます。フライTBIモデルは、げっ歯類および非ヒト霊長類TBIモデル上の利点を有しています、in vivoイメージングなど 。

このプロトコルは、ハエに閉鎖性頭部TBIを与えるように設計されているHIT装置の構成と動作について説明します。我々は、MI 24と一緒にHITデバイスを使用しています</サブ> TBI 7次生物の死を研究するためのアッセイ。しかし、フライTBIモデルは死を理解するための多くの他の方法ならびにTBIの他の結果で使用することができます。例えば、TBIの物理的影響は、登山や便などのパラメータについてのアッセイを用いて測定することができ、TBIの行動の結果は、睡眠と学習および記憶10,12-14などのパラメータについてのアッセイを用いて測定することができます。脳における構造的効果は、免疫蛍光顕微鏡法および透過型電子顕微鏡などの画像化技術を用いて決定することができます。脳の分子の効果は、例えば、質量分析などのRNA配列又はプロテオミクスアッセイなどのゲノムアッセイを用いて決定することができます。脳における遺伝的影響は、このような条件付きの遺伝子ノックダウンと過剰発現のような手法を用いて決定することができます。 TBIの影響に関する環境への影響は、このようなインキュベーション温度と食事やのパラメータとして変化させる前または損傷後のパラメータによって決定することができます春の偏向角または反復ストライキの間の時間などのHIT装置。最後に、HIT装置は、TBIの結果は、若い個体より高齢の個体で悪化している理由として同様の治療を同定することができる大規模な薬物スクリーニングのための基本的な問題に対処するために、大規模な遺伝子スクリーニングのために使用することができますTBIの結果。

一貫した方法で使用される場合、我々は、HITデバイスが独立した実験とユーザ間の再現性の表現型を産生することを見出しました。再現性に影響を与えることができるパラメータは、HITデバイスのセットアップと操作です。表現型は非常に小さく、ボード、フライバイアル中のコットンボールの位置にアイスバケットカバーの位置の変化、およびマジックテープへのバイアルの位置によって影響を受けることができます。 図2に示すようにさらに、表現型はかなりの小さな変化によって影響を受けることができ春の偏向角。このように、HITデバイスの新規ユーザーは、セットアップと操作が他のユーザーのものと同じであることを保証するために監視する必要があります。私たちは日常的に彼らが1118ハエW古い0-7日のMI 24を決定したことで、新しいユーザーを調整します。最後に、HIT装置は、プロトコルに記載のものと同一である必要はありません。私たちは、ハエでTBIを与える能力を維持しながら、HIT装置の大部分を変更することができることを期待しています。

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Disclosures

我々は、開示する目的の競合がありません。

Acknowledgments

この作品は、健康補助金の国立研究所、R01 AG033620（BG）で、ロバート·ドレイパー技術革新資金（DAW）によってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zinc plated compression spring The Hillman  Group 540189 9 7/8 inch (length, 2.2 cm), 15/16 inch (outer diameter, 2.4 cm), 0.12 inch (wire size, 0.3 cm)
Wooden board 9 inch (length, 22.9 cm), 6.5 inch (width, 16.5 cm), 0.75 inch (height, 1.9 cm)
Clamps Sigma Electrical Manufacturing Corporation 49822 3.10 inch (length, 7.9 cm), 0.68 inch (width, 1.7 cm), 1.11 inch (height, 2.8 cm), EMT Two Hole Straps, click on type for 1 inch (2.5 cm) steel EMT conduit
Loop half of self-adhesive velcro 3 inch (length, 7.6 cm), (3/4 inch width, 1.9 cm)
Polyurethane ice bucket cover Fisher Scientific 02-591-45 9 1/8 inch (length, 23.2 cm), 9 1/8 inch (width, 23.2 cm), 1 1/4 inch (height, 3.2 cm)
Plastic fly vials Applied Scientific AS-510 3 11/16 inch (height, 9.4 cm), 1 1/16 inch (inner diameter, 2.7 cm), 1 1/8 inch (outer diameter, 2.9 cm)
Large cotton balls Fisher Scientific 22-456-883
Paper protractor 10 inch (diameter, 25.4 cm)

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References

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Tags

神経科学、問題100、

Erratum

Formal Correction: Erratum: A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila
Posted by JoVE Editors on 07/14/2015. Citeable Link.

An author's name was corrected in the publication of A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila. The second to last author's was spelled incorrectly. It has been updated from:

Barry Ganetky

to:

Barry Ganetzky

で閉鎖性頭部外傷性脳損傷を負わせる方法<em&gt;ショウジョウバエ</em
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Cite this Article

Katzenberger, R. J., Loewen, C. A.,… More

Katzenberger, R. J., Loewen, C. A., Bockstruck, R. T., Woods, M. A., Ganetzky, B., Wassarman, D. A. A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila. J. Vis. Exp. (100), e52905, doi:10.3791/52905 (2015).

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