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Neuroscience

Une méthode d'infliger Fermé chef Traumatic Brain Injury dans Published: June 30, 2015 doi: 10.3791/52905
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 2, 1
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Genetics, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Natural Sciences, University of Puerto Rico-Aguadilla

ERRATUM NOTICE

Summary

Nous décrivons ici une méthode pour infliger tête fermée cérébrale traumatique blessures (TBI) chez la drosophile. Cette méthode fournit une passerelle pour enquêter sur les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent pathologies TBI en utilisant la vaste gamme d'outils expérimentaux et techniques disponibles pour les mouches.

Abstract

Lésion cérébrale traumatique (TBI) affecte des millions de personnes chaque année, provoquant une insuffisance de physique, cognitif, et les fonctions comportementales et de la mort. Les études utilisant la drosophile ont contribué percées importantes dans la compréhension des processus neurologiques. Ainsi, dans le but de comprendre la base moléculaire et cellulaire de pathologies TBI chez les humains, nous avons développé le dispositif High Impact Trauma (HIT) à infliger tête fermée TBI dans les mouches. Les mouches soumises à l'affichage des phénotypes de périphériques compatibles avec HIT TBI humaine tels que l'incapacité temporaire et une neurodégénérescence progressive. Le dispositif de HIT utilise un mécanisme basé sur ressort pour propulser mouches contre le mur d'un flacon, causant des dommages mécaniques au cerveau de la mouche. Le dispositif est peu coûteux et facile à construire, son fonctionnement est simple et rapide, et il produit des résultats reproductibles. Par conséquent, le dispositif de HIT peut être combiné avec des outils et des techniques de vol pour répondre fondamentale expérimentales existantesquestions sur TBI qui peuvent conduire au développement de diagnostics et traitements de TBI. En particulier, le dispositif de HIT peut être utilisé pour effectuer des criblages génétiques à grande échelle pour comprendre la base génétique des pathologies TBI.

Introduction

Une lésion cérébrale traumatique (TBI) est défini comme étant une lésion au cerveau à partir d'une force mécanique externe. La plupart du temps, les résultats de TBI forces crâniens fermés tels que les forces d'inertie et de l'accélération franches et des forces de décélération qui provoquent le cerveau de frapper l'intérieur du crâne. Aux États-Unis, on estime que 50 000 personnes meurent chaque année de TBI et de 2,5 à 6.500.000 personnes vivent avec les conséquences de TBI, y compris débilitante physique, cognitif, des problèmes de comportement et 1,2. Les conséquences de TBI sont pas seulement due à des lésions mécaniques primaires dans le cerveau mais aussi à des blessures secondaires cellulaires et moléculaires dans le cerveau ainsi que d'autres tissus qui se produisent au cours du temps 5.3. Le développement d'approches pour diagnostiquer et traiter TBI est avérée difficile parce TBI est un processus de maladie complexe. La nature variable des blessures primaires, la physiologie humaine et les facteurs environnementaux en résulte i secondaire hétérogènenjuries et pathologies. Facteurs variables sous-jacentes comprennent la gravité de la blessure principale, le temps entre les blessures répétitives primaires, et l'âge et le génotype de l'individu. Comprendre comment chaque facteur variable contribue aux conséquences de TBI est susceptible d'aider à l'élaboration d'approches pour diagnostiquer et traiter 6,7 TBI.

Nous décrivons ici une méthode pour infliger fermé tête TBI dans Drosophila melanogaster (mouches des fruits) qui peut être utilisé pour délimiter la contribution des facteurs variables pour les conséquences de TBI. La méthode est basée sur une observation initiale que frapper intensément le côté d'un flacon de culture de volée contre la paume d'une main causé de type sauvage vole à devenir temporairement inapte, une conséquence probable de TBI. Ainsi, nous avons construit le dispositif à fort impact des traumatismes (HIT) de récapituler les forces d'accélération et de décélération de l'action de frapper à la main. Un film à haute vitesse montre qu'une seule frappe de laHIT dispositif provoque vole au contact de la paroi du flacon plusieurs fois avec leur tête et le corps 8. Dans une certaine mesure, tous les contacts sont susceptibles de provoquer le cerveau de la mouche à ricocher et déformer contre la capsule de la tête, semblable à ce qui se passe à l'homme dans les chutes et les accidents de voiture 9. En conséquence, les mouches traité avec les phénotypes affichage de l'appareil de HIT compatibles avec lésion cérébrale, y compris une incapacité temporaire suivie par une ataxie, une reprise progressive de la mobilité, des changements d'expression des gènes dans la tête, et la neurodégénérescence progressive dans le cerveau 10. Ainsi, le dispositif de HIT permet d'étudier TBI en utilisant l'énorme arsenal d'outils et de techniques développées pour les mouches expérimentales.

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Protocol

1. La construction de l'appareil de HIT

  1. Accrocher le ressort au conseil à l'aide de deux pinces et quatre vis (figure 1A). Centrer les pinces par rapport à la largeur de la planche et Butt-les un contre l'autre avec la chasse d'eau de serrage externe avec le bord de la carte. Avant de fixer les pinces, les plier en utilisant une pince pour tenir étroitement au cours du printemps.
    NOTE: Voir le tableau 1 pour les descriptions des matériaux nécessaires pour la construction du dispositif de HIT. La fin serrée du ressort devrait être de 1/8 de pouce (3,2 mm) à partir du bord de la carte, et l'extrémité libre doit s'étendre sur la planche de 3/4 pouce (19 mm). Régler le ressort de sorte qu'il est parallèle à la longueur de la planche.
  2. Envelopper l'extrémité libre du ressort une fois autour de la bande adhésive de boucles de Velcro. Le bord extérieur de la bande Velcro doit être aligné avec la fin du printemps. Le Velcro est important car il est utilisé pour fixer le flacon à la source par la CREAting un raccord de compression serré. Le velcro permet aussi une connexion rapide et l'élimination des flacons, permettant à de nombreux flacons à traiter dans un court laps de temps.
  3. Placez le couvercle de seau à glace à l'envers, centrée, serré contre la planche de bois. Orienter la région surélevée du couvercle de seau à glace de telle sorte que le bord long est parallèle à la largeur de la planche. Notez que la région surélevée du seau à glace est de 1/2 pouce (13 mm) de plus que la planche de bois, de sorte que quand un flacon est fixé au printemps, le printemps ne sera pas à plat sur la planche.
  4. Faites glisser l'ensemble du dispositif contre un objet fixe, comme un mur, de sorte que le couvercle du seau à glace est coincé entre le conseil et l'objet et ne bouge pas.
  5. Tape le rapporteur de papier au fond d'un carton voler bac flacon et reposer sur bord contre la longueur de la planche de sorte que la marque de 90 ° est aligné avec le printemps, quand il est tiré vers l'arrière à une position parfaitement verticale.

2.Le fonctionnement du dispositif de HIT

  1. Place entre 1 et 60 CO 2 -anesthetized vole dans un flacon vide et le bouchon du flacon en utilisant une boule de coton moulants.
  2. Confiner les mouches vers le bas de 1 pouce (2,5 cm) du flacon en poussant la boule de coton dans la fiole jusqu'à ce qu'elle soit de 1 pouce (2,5 cm) à partir du bas. Il est utile de tracer une ligne sur le flacon à la marque de 1 pouce (2,5 cm). Notez que confiner mouches à des régions plus ou moins grandes de la fiole peut influer sur la gravité des phénotypes.
  3. Attendez 5 min pour les mouches de récupérer la mobilité de la CO 2. Notez qu'il ne sait pas si 5 min est suffisante pour éliminer complètement les effets de CO 2.
  4. Insérez l'extrémité du ressort dans le flacon jusqu'à ce que le bord intérieur de la bande Velcro est aligné sur le haut du flacon (figure 1B). Lorsque le ressort est à plat, 1 pouce (2,5 cm) du flacon doit chevaucher la région surélevée du couvercle de seau à glace. Les flacons peuvent être réutilisés mn'importe quand.
  5. Alors qu'il était assis, maintenez le flacon à la région Velcro avec le pouce et l'index de votre main gauche. Tenez la carte étanche à la paillasse en utilisant votre main droite. Sinon, utilisez des serre-joints pour tenir le conseil serré pour la paillasse.
  6. Tirez le ressort parfaitement droite retour à l'angle désiré. Relâchez le printemps. Laisser le printemps à venir à un arrêt complet.
  7. Retirer la cuvette de printemps et permettent vol à récupérer pendant ≥5 min. Soumettre vol à une autre grève ou transférer les mouches dans un flacon avec de la nourriture à la mouche.
    REMARQUE: Une variété de dosages peut être utilisé pour évaluer les effets phénotypiques de grèves du dispositif de HIT. Par exemple, les effets sur la longévité peuvent être déterminées par l'analyse du pour cent de vol qui survivent à des heures après la lésion, les effets sur la morphologie du cerveau peuvent être déterminées par l'analyse histologique de la tête, et les effets sur l'expression génique peuvent être déterminés par analyse quantitative des niveaux d'ARNm 10.
  8. Déterminezeffets de e de la procédure qui ne sont pas en raison de grèves en traitant de façon identique vol de contrôle qui ne sont pas soumis à des grèves. Porter une protection auditive en raison de l'impact de la fiole contre le couvercle de seau à glace produit un bruit fort.

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Representative Results

Nous sommes intéressés à comprendre pourquoi les mouches meurent peu après la lésion primaire. Pour quantifier la mort, nous avons déterminé l'indice de mortalité à 24 h (MI 24), qui est le pourcentage de mouches qui sont morts dans les 24 heures de la blessure primaire. Les mouches soumises à des grèves du dispositif de HIT ont été incubées à 25 ° C dans un flacon avec de la nourriture à la mouche, et le nombre de mouches mortes a été compté après 24 h. Nous avons utilisé cette approche pour identifier les facteurs qui influent sur ​​le MI 24 et constaté que le MI 24 est pas affectée par le nombre de mouches dans un flacon (10 à 60 vol a été testé), le temps entre les grèves répétitives (1 à 60 min a été testé ), ou le sexe de la mouche 10. En revanche, nous avons constaté que l'âge au moment de la blessure primaire et le génotype fait affecter le MI 24. Mouches âgées eu un MI supérieur 24 que les jeunes mouches, et les mouches de différents génotypes eu significativement différents MI 24 s.

Sur la figure 2, Nous avons testé si la gravité de la blessure primaire affecte le MI 24. Pour modifier la gravité de la blessure principale, nous avons dévié le printemps à des angles différents. Pour chaque angle, les flacons de soit 0-7 ou 20-27 jours vieille w 1118 mouches (une souche de laboratoire standard) ont été soumis à quatre grèves à 5 min entre les grèves. Trois flacons de 60 mouches ont été examinées pour chaque angle. Les mouches ont été transférées à des fioles avec de la mélasse nourriture, on a incubé à 25 ° C, et le nombre de mouches mortes a été compté après 24 heures. L'erreur moyenne MI 24 et standard de la moyenne a été calculée pour chaque angle. Ces données révèlent que de plus grands angles de déviation, ie., Blessures primaires les plus graves, entraînent un MI supérieur 24 que les petits angles de déviation, ie., Les blessures moins graves. Ceci a été observé pour les deux vieilles mouches 0-7 et 20-27 jour. En outre, en accord avec Katzenberger et al. 10, 20-27 aujourd'hui âgé de fls avait un MI significativement plus élevé que 24 0-7 jours vieilles mouches à angles ≥50 °. Ainsi, ces données indiquent que dans plusieurs siècles, le MI 24 en corrélation avec la gravité de la blessure primaire.

Figure 1
Figure 1:. Schéma du dispositif de HIT (A) Illustration de la vue de dessus du dispositif de HIT dans la position de repos. (B) Illustration de la vue de côté du dispositif de HIT. Le ressort est représenté dans la position de repos (rouge foncé) et déviée à 90 ° (lumière rouge).

Figure 2
Figure 2:. Gravité des blessures primaire en corrélation avec le MI 24 Nous avons déterminé la MI 24 pour 0-7 jours vieille w 1118 mouches (barres gris clair) et 20-27 jours anciens w 1118 mouches (barres gris foncé) qui ont été soumis à quatre grèves depuis le dispositif de HIT avec le ressort déviés vers les angles indiqués en degrés. Les données 0 degré sont pour vole pas soumis au dispositif de HIT. Présentés sont la moyenne MI 24 et l'erreur standard de la moyenne. Le MI 24 de 0-7 et 20-27 jours vieilles mouches était significativement différente de 50 ° (P <0,05, un test t bilatéral) et des angles> 50 ° (P <0,001, un test t bilatéral) mais pas pour les angles < 50 ° (P> 0,1, un test t bilatéral).

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Discussion

La méthode de dispositif de HIT se distingue des autres méthodes qui leur causent des lésions traumatiques chez les mouches par le fait qu'il provoque la tête privée plutôt que de pénétrer TBI 11. En outre, la méthode de dispositif de HIT prend moins de temps, d'efforts et d'habileté pour infliger des TBI dans beaucoup de mouches, de sorte que la méthode est plus favorable que d'autres méthodes à écrans génétiques à grande échelle. Enfin, le fait que les blessures infligées primaires par le dispositif de HIT ne sont pas limités vers le cerveau est à la fois une limitation et un avantage. Il est une limitation, car des études supplémentaires sont nécessaires pour évaluer si les phénotypes sont dus à une blessure traumatique au cerveau ou à d'autres parties du corps. D'autre part, un polytraumatisme (lésion traumatique à plusieurs parties du corps) accompagne souvent TBI et est pensé pour moduler les phénotypes TBI, donc la méthode de dispositif de HIT peut être utilisée pour étudier la contribution de polytraumatisme à des phénotypes TBI. Le modèle de mouche TCC a également des avantages par rapport rongeur et TBI modèles de primates non humains in vivo etc.

Ce protocole décrit la construction et le fonctionnement du dispositif de HIT, qui est conçu pour infliger fermé tête TBI dans les mouches. Nous avons utilisé le dispositif de HIT en liaison avec le MI 24 </ Sub> test pour étudier la mort organismal suivante TBI 7. Toutefois, le modèle de TBI à la mouche peut être utilisée dans de nombreuses autres façons de comprendre la mort ainsi que d'autres conséquences de TBI. Par exemple, les conséquences physiques de TBI peut être mesurée en utilisant des essais de paramètres tels que l'escalade ou de fuite, et les conséquences de comportement de TBI peut être mesurée en utilisant des essais de paramètres tels que le sommeil et l'apprentissage et la mémoire 10,12-14. Les effets structurels sur le cerveau peut être déterminé en utilisant des techniques d'imagerie telles que la microscopie par immunofluorescence et microscopie électronique à transmission. Molecular effets sur le cerveau peut être déterminée en utilisant des dosages génomiques telles que l'ARN ou les dosages suivants protéomiques telles que la spectrométrie de masse. Les effets génétiques sur le cerveau peuvent être déterminées en utilisant des approches telles que knockdown conditionnelle de gène et la surexpression. Les effets environnementaux sur les conséquences de TBI peuvent être déterminées par différents pré- ou post-blessure paramètres tels que la température d'incubation et de l'alimentation ou des paramètres dele dispositif de HIT comme l'angle de déviation du printemps ou le temps entre les grèves répétitives. Enfin, le dispositif de HIT peut être utilisé pour les écrans génétiques à grande échelle pour répondre à des questions fondamentales telles que la raison pour laquelle les conséquences de TBI sont pires chez les personnes âgées que les personnes plus jeunes ainsi que pour les écrans de drogue à grande échelle qui peuvent être utilisés pour identifier des traitements pour les conséquences de TBI.

Lorsqu'il est utilisé d'une manière cohérente, nous avons constaté que le dispositif de HIT produit phénotypes reproductibles entre les expériences et les utilisateurs indépendants. Les paramètres qui peuvent affecter la reproductibilité sont la mise en place et le fonctionnement du dispositif de HIT. Phénotypes peuvent être affectés de manière significative par de petits changements dans la position du seau à glace couvercle par rapport à la carte, la position de la boule de coton dans le flacon à la mouche, et la position du flacon par rapport à la bande Velcro. En outre, comme le montre la figure 2, les phénotypes peuvent être affectées de manière significative par de petits changements dans laangle de déflexion printemps. Ainsi, les nouveaux utilisateurs du dispositif de HIT doivent être surveillés pour veiller à ce que la mise en place et le fonctionnement sont identiques à celles des autres utilisateurs. Nous calibrer régulièrement de nouveaux utilisateurs en leur faisant déterminent le MI 24 de 0-7 jours vieille w 1118 mouches. Enfin, le dispositif de HIT n'a pas besoin d'être identique à celle décrite dans le protocole. Nous nous attendons à ce que la plupart des parties du dispositif de HIT peuvent être modifiés tout en conservant la capacité d'infliger des TBI dans les mouches.

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Disclosures

Nous avons aucun conflit d'intérêt à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la Santé subvention, R01 AG033620 (BG) et par Robert Draper financement de la technologie de l'innovation (DAW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zinc plated compression spring The Hillman  Group 540189 9 7/8 inch (length, 2.2 cm), 15/16 inch (outer diameter, 2.4 cm), 0.12 inch (wire size, 0.3 cm)
Wooden board 9 inch (length, 22.9 cm), 6.5 inch (width, 16.5 cm), 0.75 inch (height, 1.9 cm)
Clamps Sigma Electrical Manufacturing Corporation 49822 3.10 inch (length, 7.9 cm), 0.68 inch (width, 1.7 cm), 1.11 inch (height, 2.8 cm), EMT Two Hole Straps, click on type for 1 inch (2.5 cm) steel EMT conduit
Loop half of self-adhesive velcro 3 inch (length, 7.6 cm), (3/4 inch width, 1.9 cm)
Polyurethane ice bucket cover Fisher Scientific 02-591-45 9 1/8 inch (length, 23.2 cm), 9 1/8 inch (width, 23.2 cm), 1 1/4 inch (height, 3.2 cm)
Plastic fly vials Applied Scientific AS-510 3 11/16 inch (height, 9.4 cm), 1 1/16 inch (inner diameter, 2.7 cm), 1 1/8 inch (outer diameter, 2.9 cm)
Large cotton balls Fisher Scientific 22-456-883
Paper protractor 10 inch (diameter, 25.4 cm)

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References

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Tags

Neuroscience émission 100, High Impact-dispositif de traumatologie de la mortalité une lésion cérébrale traumatique

Erratum

Formal Correction: Erratum: A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila
Posted by JoVE Editors on 07/14/2015. Citeable Link.

An author's name was corrected in the publication of A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila. The second to last author's was spelled incorrectly. It has been updated from:

Barry Ganetky

to:

Barry Ganetzky

Une méthode d&#39;infliger Fermé chef Traumatic Brain Injury dans<em&gt; Drosophila</em
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Katzenberger, R. J., Loewen, C. A.,… More

Katzenberger, R. J., Loewen, C. A., Bockstruck, R. T., Woods, M. A., Ganetzky, B., Wassarman, D. A. A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila. J. Vis. Exp. (100), e52905, doi:10.3791/52905 (2015).

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