En metod för att tillfoga Stängd Head traumatisk hjärnskada i Published: June 30, 2015 doi: 10.3791/52905

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Rebeccah J. Katzenberger¹, Carin A. Loewen², R. Tayler Bockstruck¹, Mikal A. Woods³, Barry Ganetzky², David A. Wassarman¹

¹Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, ²Department of Genetics, University of Wisconsin-Madison, ³Department of Natural Sciences, University of Puerto Rico-Aguadilla

Summary

Här beskriver vi en metod för att tillfoga sluten huvudtraumatisk hjärnskada (TBI) i Drosophila. Denna metod utgör en knytpunkt för att undersöka de cellulära och molekylära mekanismer som ligger bakom TBI sjukdomar med hjälp av den stora förekomsten av experimentella verktyg och tekniker som flugor.

Abstract

Traumatisk hjärnskada (TBI) drabbar miljontals människor varje år, vilket orsakar försämring av fysiska, kognitiva och beteendemässiga funktioner och död. Studier med Drosophila har bidragit viktiga genombrott i förståelsen neurologiska processer. Således, med målet att förstå den cellulära och molekylära grunden för TBI patologier hos människor, har vi utvecklat High Impact Trauma (HIT) enhet för att tillfoga stängda huvudet TBI i flugor. Flugor utsattes för HIT enhetens display fenotyper är förenliga med mänskliga TBI såsom tillfällig arbetsoförmåga och progressiv neurodegeneration. HIT enheten använder en fjäderbaserad mekanism för att driva flugor mot väggen av ett kärl, vilket orsakar mekaniska skador på flugan hjärnan. Anordningen är billig och enkel att konstruera, dess drift är enkelt och snabbt, och det ger reproducerbara resultat. Följaktligen kan HIT anordningen kombineras med befintliga experimentella verktyg och tekniker för flugor för att hantera grundläggandefrågor om TBI som kan leda till utveckling av diagnostik och behandling för TBI. I synnerhet kan den HIT anordningen användas för att utföra storskaliga genetiska skärmar för att förstå den genetiska grunden för TBI patologier.

Introduction

Traumatisk hjärnskada (TBI) definieras som skada i hjärnan från en extern mekanisk kraft. Vanligast TBI resultat från sluten huvudkrafter såsom trubbiga krafter och tröghetsacceleration och retardationskrafter som orsakar hjärnan att träffa insidan av skallen. I USA är det uppskattas att 50.000 personer dör varje år från TBI och 2,5-6.500.000 personer lever med konsekvenserna av TBI, inklusive försvagande fysiska, kognitiva och beteendeproblem ^1,2. Konsekvenserna av TBI är inte bara på grund av primära mekaniska skador på hjärnan utan även för sekundära cellulära och molekylära skador på hjärnan liksom andra vävnader som sker över tiden ^3-5. Utvecklingen av metoder för att diagnostisera och behandla TBI har visat sig vara svårt eftersom TBI är en komplex sjukdomsprocess. Den rörliga karaktär av primära skador, människans fysiologi och miljöfaktorer resulterar i heterogena sekundära injuries och patologier. Underliggande variabla faktorer inkluderar allvarligheten av den primära skadan, tiden mellan upprepade primära skador, och åldern och genotyp hos individen. Att förstå hur varje variabel faktor bidrar till konsekvenserna av TBI är sannolikt att underlätta utvecklingen av metoder för att diagnostisera och behandla TBI ^6,7.

Här beskriver vi en metod för att tillfoga sluten huvud TBI i Drosophila melanogaster (fruktflugor) som kan användas för att beskriva bidrag variabla faktorer till konsekvenserna av TBI. Metoden bygger på en inledande iakttagelse som intensivt träffa sidan av en fluga kulturflaska mot en handflata orsakade vildtyp flugor för att bli tillfälligt arbetsoförmögen, en sannolik konsekvens av TBI. Därför byggde vi High-Impact Trauma (HIT) anordning för att sammanfatta de accelerations- och retardationskrafter från hand slå åtgärder. En höghastighetsfilm visar att en enda strejk frånHIT enheten orsakar flyger till kontakta flaskan väggen flera gånger med huvudet och kroppen ^8. Till viss del, alla kontakter kan orsaka flugan hjärnan att rikoschett och deformeras mot huvudet kapsel, som liknar vad som händer med människor i fall och bilolyckor ^9. Följaktligen flugor behandlades med HIT enhetens display fenotyper är förenliga med hjärnskada, inklusive tillfällig arbetsoförmåga följd av ataxi, gradvis återhämtning av rörlighet, genuttryck förändringar i huvudet, och progressiv neurodegeneration i hjärnan ^10. Således gör HIT anordningen det möjligt att studera TBI hjälp av enorma arsenal av experimentella verktyg och tekniker som utvecklats för flugor.

Protocol

1. Konstruktion av HIT Device

1. Fäst fjädern till styrelsen med två klämmor och fyra skruvar (Figur 1A). Centrera klämmorna i förhållande till bredden av styrelsen och rumpan upp dem mot varandra med den yttre klämjämnhöjd med kanten av styrelsen. Innan fastsättning av klämmor, böja dem med en tång för att passa tätt över våren.
   OBS: Se tabell 1 för en beskrivning av det material som krävs för att konstruera HIT enheten. Den fastklämda slutet av våren bör vara 1/8 tum (3,2 mm) från kanten av styrelsen, och den fria änden ska sträcka sig över hela linjen med 3/4 tum (19 mm). Justera fjädern så att den ligger parallellt med längden på brädan.
2. Linda den fria änden av fjädern en gång runt med den adhesiva remsan av Velcro slingor. Den yttre kanten av kardborren bör vara i jämnhöjd med änden av fjädern. Den kardborre är viktigt eftersom det används för att fästa flaskan till våren genom crerande en tät kompressionskoppling. Kardborren tillåter också enkel anslutning och avlägsning av små flaskor, så att många flaskor som skall bearbetas under en kort tidsperiod.
3. Placera ishink locket upp och ner, centrerad, tätt mot träskiva. Rikta det förhöjda området av isen bucket locket så att långsidan är parallell med bredden i styrelsen. Notera att det förhöjda området av isen skopan är 1/2 tum (13 mm) högre än den träskiva, så att när en ampull är fäst vid fjädern fjädern inte kommer att ligga platt på bordet.
4. Skjut hela anordningen mot ett fast föremål såsom en vägg, så att isen bucket locket ligger inklämd mellan styrelsen och objektet och rör sig inte.
5. Tejpa pappersskiva till botten av en kartong flyga flaskan facket och ställ den på kanten mot längden på brädan så att 90 ° märket är i linje med fjädern när den dras tillbaka till en helt vertikalt läge.

2.Drift av HIT-enhet

1. Plats mellan 1 och 60 _CO2 -anesthetized flugor i en tom flaska och tillslut flaskan med hjälp av en åtsittande bomullstuss.
2. Begränsa flugorna till botten 1 tum (2,5 cm) hos flaskan genom att skjuta bomullstuss i flaskan tills den är 1 tum (2,5 cm) från botten. Det är bra att dra en linje på flaskan vid 1 tum (2,5 cm) varumärke. Observera att begränsa flugor till större eller mindre regioner av ampullen kan påverka strängheten av fenotyper.
3. Vänta 5 minuter för flugorna att återhämta rörlighet från _CO2. Observera att det inte är känt om 5 minuter är tillräcklig för att helt ta bort effekterna av _CO2.
4. För in änden av fjädern i flaskan tills den inre kanten av kardborren är i jämnhöjd med toppen av ampullen (figur 1B). När fjädern ligger plant, bör en tum (2,5 cm) av flaskan överlappa det förhöjda området av ice bucket locket. Flaskorna kan återanvändas mnågra gånger.
5. Samtidigt sitter, håll flaskan på kardborre region med tummen och pekfingret på vänster hand. Håll brädan tätt mot bänk med höger hand. Alternativt kan du använda C-klämmor för att hålla styrelsen tätt mot bänk.
6. Dra våren perfekt rakt bakåt till önskad vinkel. Släpp våren. Låt våren för att komma till en helt stilla.
7. Ta bort injektionsflaskan från våren och låt flugorna att återhämta sig i ≥5 min. Ämne flugor till en annan strejk eller överföra flugor till en flaska med fluga mat.
   OBS: En mängd olika analyser kan användas för att utvärdera de fenotypiska effekterna av strejker från HIT-enheten. Till exempel kan effekterna på livslängd bestämmas genom analys av procent av flugor som överlever vid tidpunkter efter skada, kan effekter på hjärnans morfologi bestämmas genom histologisk analys av huvudet, och effekter på genuttryck kan bestämmas genom kvantitativ analys av mRNA-nivåer ^10.
8. Fastställbarae effekterna av förfarandet som inte beror på strejker med identiskt behandla kontroll flugor som inte utsätts för strejker. Bär hörselskydd eftersom effekterna av flaskan mot ishink locket ger ett högt ljud.

Representative Results

Vi är intresserade av att förstå varför flugor dör strax efter primär skada. För att kvantifiera död, bestämde vi Mortality index vid 24 h (MI _24), vilket är den procentuella andelen av flugor som dog inom 24 timmar av den primära skadan. Flugor som utsätts för slag från HIT anordningen inkuberades vid 25 ° C i en injektionsflaska med fly mat, och antalet döda flugor räknades efter 24 timmar. Vi använde denna metod för att identifiera faktorer som påverkar MI ₂₄ och fann att MI ₂₄ inte påverkas av antalet flugor i en injektionsflaska (10 till 60 flugor testades), tiden mellan upprepade strejker (1 till 60 minuter testades ), eller kön flugan ^10. Däremot fann vi att ålder vid tidpunkten för den primära skadan och genotyp påverkade felindikatorn _24. Äldre flugor hade en högre MI ₂₄ än yngre flugor, och flugor av olika genotyper hade signifikant olika MI ₂₄ s.

I fig 2Undersökte vi om hur allvarlig den primära skadan påverkar Ml _24. För att ändra svårighetsgraden av den primära skadan, avlänkas vi fjädern till olika vinklar. För varje vinkel, var flaskor med antingen 0-7 eller 20-27 dagar gamla w ¹¹¹⁸ flugor (en standardmässig laboratoriestam) utsattes för fyra strejker med 5 min mellan strejker. Undersöktes för varje vinkel Tre flaskor med 60 flugor. Flugor överfördes till små flaskor med melass mat, inkuberades vid 25 ° C, och antalet döda flugor räknades efter 24 timmar. Den genomsnittliga MI ₂₄ och standardfel av medelvärdet beräknades för varje vinkel. Dessa data visar att större vinklar böjning, dvs., Svårare primära skador, resulterar i en högre MI ₂₄ än mindre vinklar böjning, dvs. Mindre allvarliga skador. Detta observerades för både 0-7 och 20-27 dagar gamla flugor. Vidare, i enlighet med Katzenberger et al., ^10, 20-27 dagar gamla fltalet hade en betydligt högre MI ₂₄ än 0-7 dagar gamla flugor på vinklar ≥50 °. Således är dessa data tyder på att vid flera åldrar MI ₂₄ korrelerar med svårighetsgraden av den primära skadan.

Figur 1:. Diagram av HIT anordningen (A) Illustration av den vy ovanifrån av HIT anordningen i viloläget. (B) Illustration av en sidovy av HIT anordningen. Fjädern är visad i sitt viloläge (mörkröd) och avlänkas till 90 ° (ljus röd).

Figur 2:. Primär skadornas svårighetsgrad korrelerar med MI ₂₄ Vi bestämde MI ₂₄ för 0-7 dagar gamla w 1118 flugor (ljusgrå staplar) och 20-27 dagar gamla w ¹¹¹⁸ flugor (mörkgrå staplar) som utsattes för fyra strejker från HIT enheten med våren avlänkas till de angivna vinklar i grader. De 0 graders data för flyger inte utsätts för HIT-enheten. Visas är den genomsnittliga MI ₂₄ och standardfelet av medelvärdet. MI ₂₄ av 0-7 och 20-27 dagar gamla flugor var signifikant olika för 50 ° (P <0,05, en tailed t-test) och vinklar> 50 ° (P <0,001, en ​​tailed t-test), men inte för vinklar < 50 ° (P> 0,1, en ​​tailed t-test).

Discussion

HIT anordningen metoden skiljer sig från andra metoder som vållar traumatisk skada i flugor av det faktum att det orsakar sluten huvud snarare än penetrerande TBI ^11. Dessutom tar HIT enhet metoden mindre tid, ansträngning och skicklighet för att orsaka TBI i många flugor, så metoden är mer mottaglig än andra metoder för storskaliga genetiska skärmar. Slutligen, det faktum att primära skador orsakade av HIT anordningen inte är begränsade till hjärnan är både en begränsning och en fördel. Det är en begränsning eftersom ytterligare studier krävs för att bedöma om fenotyper är på grund av traumatisk skada på hjärnan eller andra kroppsdelar. Å andra sidan, polytrauma (traumatisk skada till flera kroppsdelar) ofta följer TBI och tros modulera TBI fenotyper, så att enheten metoden HIT kan användas för att undersöka bidraget av polytrauma till TBI fenotyper. Flugan TBI modellen har också fördelar jämfört med gnagare och icke-mänskliga primater TBI modeller in vivo imaging osv.

Detta protokoll beskriver konstruktionen och driften av HIT anordningen, som är avsedd att tillfoga sluten huvud TBI i flugor. Vi har använt HIT anordningen i samband med Ml _{24 <}/ Sub> analys för att studera organism död efter TBI ^7. Däremot kan flyga TBI modellen användas på många andra sätt att förstå döden samt andra konsekvenser av TBI. Till exempel, kan fysiska konsekvenserna av TBI mätas med hjälp av analyser för parametrar såsom klättring eller flyg, och beteende konsekvenserna av TBI kan mätas med hjälp av analyser för parametrar såsom sömn och inlärning och minne ^10,12-14. Strukturella effekter på hjärnan kan bestämmas med användning av avbildningstekniker såsom immunofluorescens-mikroskopi och transmissionselektronmikroskopi. Molekylära effekter på hjärnan kan bestämmas med användning av genomiska analyser såsom RNA-punkter eller proteomic analyser såsom masspektrometri. Genetiska effekter på hjärnan kan bestämmas med hjälp av metoder såsom villkorad gen knockdown och uttryck. Miljöeffekter på följderna av TBI kan bestämmas genom olika pre- eller postskadeparametrar såsom inkubationstemperatur och diet eller parametrar förHIT enhet som vinkel fjäderavböjningen eller tiden mellan upprepade strejker. Slutligen kan HIT anordningen användas för storskaliga genetiska skärmar för att ta itu med grundläggande frågor som varför konsekvenserna av TBI är sämre hos äldre individer än yngre individer samt för storskaliga drogskärmar som kan användas för att identifiera behandlingar för konsekvenserna av TBI.

När den används på ett konsekvent sätt, har vi funnit att HIT-enheten ger reproducerbara fenotyper bland oberoende experiment och användare. Parametrar som kan påverka reproducerbarheten är installation och drift av HIT anordningen. Fenotyper kan påverkas avsevärt av små förändringar i positionen för ice bucket locket i förhållande till styrelsen, placeringen av bomullstuss i gylfen flaskan, och läget för flaskan i förhållande till kardborrebandet. Dessutom, som visas i figur 2, fenotyper kan påverkas avsevärt av små förändringar ivinkel fjäderavböjningen. Sålunda bör nya användare av HIT anordningen övervakas för att säkerställa att den installation och drift är identisk med den för andra användare. Vi kalibrerar rutinmässigt nya användare genom att låta dem bestämma MI ₂₄ av 0-7 dagar gamla w ¹¹¹⁸ flugor. Slutligen betyder HIT enheten inte behöver vara identisk med den som beskrivs i protokollet. Vi förväntar oss att de flesta delar av HIT-enheten kan ändras med bibehållen förmåga att orsaka TBI i flugor.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zinc plated compression spring	The Hillman  Group	540189	9 7/8 inch (length, 2.2 cm), 15/16 inch (outer diameter, 2.4 cm), 0.12 inch (wire size, 0.3 cm)
Wooden board			9 inch (length, 22.9 cm), 6.5 inch (width, 16.5 cm), 0.75 inch (height, 1.9 cm)
Clamps	Sigma Electrical Manufacturing Corporation	49822	3.10 inch (length, 7.9 cm), 0.68 inch (width, 1.7 cm), 1.11 inch (height, 2.8 cm), EMT Two Hole Straps, click on type for 1 inch (2.5 cm) steel EMT conduit
Loop half of self-adhesive velcro			3 inch (length, 7.6 cm), (3/4 inch width, 1.9 cm)
Polyurethane ice bucket cover	Fisher Scientific	02-591-45	9 1/8 inch (length, 23.2 cm), 9 1/8 inch (width, 23.2 cm), 1 1/4 inch (height, 3.2 cm)
Plastic fly vials	Applied Scientific	AS-510	3 11/16 inch (height, 9.4 cm), 1 1/16 inch (inner diameter, 2.7 cm), 1 1/8 inch (outer diameter, 2.9 cm)
Large cotton balls	Fisher Scientific	22-456-883
Paper protractor			10 inch (diameter, 25.4 cm)