En metode å påføre Stengt Leder traumatisk hjerneskade i Published: June 30, 2015 doi: 10.3791/52905

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Rebeccah J. Katzenberger¹, Carin A. Loewen², R. Tayler Bockstruck¹, Mikal A. Woods³, Barry Ganetzky², David A. Wassarman¹

¹Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, ²Department of Genetics, University of Wisconsin-Madison, ³Department of Natural Sciences, University of Puerto Rico-Aguadilla

Summary

Her beskriver vi en metode for å påføre lukket hode traumatisk hjerneskade (TBI) i Drosophila. Denne metoden gir en inngangsport til å undersøke de cellulære og molekylære mekanismer som ligger bak TBI patologi ved hjelp av det store utvalget av eksperimentelle verktøy og teknikker tilgjengelig for fluer.

Abstract

Traumatisk hjerneskade (TBI) rammer millioner av mennesker hvert år, forårsaker nedsatt fysisk, kognitiv og atferdsmessige funksjoner og død. Studier ved hjelp Drosophila har bidratt viktige gjennombrudd i forståelsen nevrologiske prosesser. Dermed, med mål om å forstå den cellulære og molekylære grunnlaget for TBI patologier hos mennesker, har vi utviklet High Impact Trauma (HIT) enheten skal påføre lukket hode TBI i fluer. Fluer utsatt for HIT enhetsvisnings fenotyper i samsvar med menneske TBI som midlertidig uførhet og progressive neurodegenerering. HIT-enheten har et fjærbasert mekanisme for å drive fluer mot veggen i en ampulle, forårsaker mekaniske skader på fly hjernen. Anordningen er billig og enkel å konstruere, sin drift er enkel og hurtig, og det gir reproduserbare resultater. Følgelig kan HIT anordningen kombineres med eksisterende eksperimentelle verktøy og teknikker for å løse grunnleggende fluerspørsmål om TBI som kan føre til utvikling av diagnostikk og behandling for hodeskader. Spesielt kan den HIT anordningen brukes til å utføre store genetiske skjermer for å forstå den genetiske basis av TBI patologier.

Introduction

Traumatisk hjerneskade (TBI) er definert som skade på hjernen fra en ekstern mekanisk kraft. Vanligst, TBI resultater fra lukkede hode krefter som sløv styrker og treghet akselerasjon og retardasjon krefter som forårsaker hjernen til å streike innsiden av skallen. I USA er det anslått at 50.000 mennesker dør hvert år av TBI og 2,5 til 6.500.000 personer lever med konsekvensene av TBI, inkludert ødeleggende fysisk, kognitiv, og problemene atferds ^1,2. Konsekvensene av TBI er ikke bare på grunn av primære mekaniske skader i hjernen, men også til sekundære cellulære og molekylære skader i hjernen, samt andre vev som oppstår over tid ^3-5. Utviklingen av fremgangsmåter for å diagnostisere og behandle TBI har vist seg å være vanskelig fordi TBI er en kompleks sykdom prosess. Den variable natur primære skader, human fysiologi, og miljøfaktorer resulterer i heterogene sekundær jegnjuries og patologi. Underliggende variable faktorer omfatter alvorlighetsgraden av den primære skaden, tiden mellom repeterende primær skader, og alder og genotypen til den enkelte. Forstå hvordan hver variabel faktor bidrar til konsekvensene av TBI er sannsynlig å hjelpe til med utviklingen av metoder for å diagnostisere og behandle TBI ^6,7.

Her beskriver vi en metode for å påføre lukket hode TBI i Drosophila melanogaster (fruktfluer) som kan brukes til å avgrense bidrag av variable faktorer til konsekvensene av TBI. Metoden er basert på en innledende observasjon som intenst treffer siden av en flue kultur hetteglass mot håndflaten av en hånd forårsaket villtype flyr å bli midlertidig uføre, en sannsynlig konsekvens av TBI. Dermed har vi konstruert High-Impact Trauma (HIT) enhet å rekapitulere akselerasjons- og bremsekrefter fra hånden slående handling. En høyhastighets Filmen viser at en enkelt angrep fraHIT-enheten fører flyr til kontakt hetteglasset veggen flere ganger med hodet og kropp ^8. Til en viss grad, alle kontakter vil sannsynligvis føre til at flua hjernen til rikosjetterer og deformere mot hodet kapsel, i likhet med hva som skjer med mennesker i fossen og bilulykker ^9. Følgelig fluer behandlet med HIT enhetsvisnings fenotyper konsistente med hjerneskade, inkludert midlertidig uførhet fulgt av ataksi, gradvis bedring av mobilitet, genuttrykk endringer i hodet, og progressive neurodegenerering i hjernen ^10. Dermed gjør HIT anordningen det mulig å studere TBI bruker enorme arsenal av eksperimentelle verktøy og teknikker som er utviklet for fluer.

Protocol

1. Byggingen av HIT Device

1. Fest våren til styret med to klemmer og fire skruer (Figur 1a). Sentrer klemmene i forhold til bredden på styret og rumpe dem opp mot hverandre med den ytre klemmen i flukt med kanten av brettet. Før du fester klemmene, bøye dem med tang for å passe stramt over våren.
   MERK: Se tabell 1 for beskrivelser av materialer som kreves for å konstruere HIT enheten. Den fastklemt slutten av våren skal være 1/8 tommer (3,2 mm) fra kanten av brettet, og den frie enden bør strekke seg over hele linja ved 3/4 tommer (19 mm). Juster fjæren slik at den ligger parallelt med lengden av brettet.
2. Pakk den frie enden av våren en gang rundt med limet stripe av borrelås looper. Den ytre kant av Velcro bør være i flukt med enden av fjæren. Borre er viktig fordi den brukes til å feste flasken til våren ved creating en stram kompresjonskoblingen. Borre tillater også enkel tilkobling og fjerning av hetteglass, slik at mange hetteglass som skal behandles i løpet av kort tid.
3. Sett isen bøtte lokket opp ned, sentrert, tett mot treplate. Orientere hevet regionen i isen bøtte dekselet slik at langsiden er parallelt med bredden på styret. Legg merke til at den hevede delen av isen bøtte er 1/2 tommer (13 mm) høyere enn treplate, slik at når et glass er festet til våren våren vil ikke ligge flatt på bordet.
4. Skyv hele enheten mot en fast gjenstand, for eksempel en vegg, slik at isen bøtte dekselet er kilt mellom styret og objektet, og beveger seg ikke.
5. Tape papiret vinkelmåler til bunnen av en papp fly ampulle skuffen og stå på kanten mot lengden av brettet slik at 90 ° mark er på linje med våren når det er trukket tilbake til en perfekt vertikal posisjon.

2.Drift av HIT Device

1. Sted mellom 1 og 60 CO ₂ -anesthetized fluer i en tom flaske og proppen i hetteglasset ved hjelp av en tettsittende bomullsdott.
2. Begrense fluene til bunnen 1 tomme (2,5 cm) av ampullen ved å skyve bomullsdott inn i flasken inntil den er en tomme (2,5 cm) fra bunnen. Det er nyttig å tegne en linje på hetteglasset på 1 tomme (2,5 cm) mark. Legg merke til at begrensnings fluer til større eller mindre områder av ampullen kan påvirke graden av fenotyper.
3. Vent 5 min for fluene å gjenopprette mobilitet fra CO _2. Legg merke til at det ikke er kjent hvorvidt 5 minutter er tilstrekkelig til å fjerne virkningene av CO _2.
4. Innsett enden av fjæren inn i hetteglasset til den indre kant av borrelåsen er i flukt med toppen av hetteglasset (figur 1B). Når fjæren ligger flatt, bør en tomme (2,5 cm) av ampullen overlapper den hevede område av isen bøtte dekselet. Ampuller kan gjenbrukes mnoen ganger.
5. Mens du sitter, hold hetteglasset på borrelås region ved hjelp av tommelen og pekefingeren på venstre hånd. Hold brettet tett til stasjonære maskiner med høyre hånd. Alternativt kan du bruke C-klemmer til å holde styret tett til stasjonære maskiner.
6. Trekk våren helt rett tilbake til ønsket vinkel. Slipp våren. La våren for å komme til en fullstendig stopp.
7. Fjern hetteglasset fra våren og la fluene å komme seg for ≥5 min. Utsett fluene til en annen streik eller overføre fluer til en ampulle med flue mat.
   MERK: En rekke analyser kan bli anvendt for å evaluere de fenotypiske effekter av slag fra HIT-enheten. For eksempel, kan virkninger på lang levetid bli bestemt ved å analysere prosent av fluer som overlever til tider etter skade, kan virkninger på hjernen morfologi bli bestemt ved histologisk analyse av hodet, og effektene på genekspresjon kan bestemmes ved kvantitativ analyse av mRNA-nivåer ^10.
8. Determine effekter av fremgangsmåten som ikke skyldes streik ved identisk behandling kontroll fluer som ikke er utsatt for slag. Bruk hørselsvern fordi virkningen av hetteglasset mot isen bøtte dekselet gir en høy lyd.

Representative Results

Vi er interessert i å forstå hvorfor fluene dør kort tid etter primær skade. For å kvantifisere død, bestemt vi Dødelighet indeks på 24 timer (MI _24), som er prosentandelen av fluer som døde innen 24 timer av primær skade. Fluer som utsettes for slag fra HIT-enheten ble inkubert ved 25 ° C i et medisinglass med flue mat, og antallet døde fluer ble talt etter 24 timer. Vi brukte denne tilnærmingen til å identifisere faktorer som påvirker MI ₂₄ og fant at MI ₂₄ ikke påvirkes av antall fluer i hetteglass (10 til 60 fluer ble testet), tiden mellom gjentatte streiker (1 til 60 min ble testet ), eller kjønn på flue ^10. I motsetning til dette, fant vi at alder ved tidspunktet for den primære skaden og genotype gjorde påvirker MI _24. Eldre fluer hadde en høyere MI ₂₄ enn yngre fluer og fluer av ulike genotyper hadde signifikant forskjellige MI ₂₄ s.

I figur 2, Testet vi om alvorligheten av den primære skaden påvirker MI _24. For å endre graden av den primære skaden, avbøyes vi fjæren til forskjellige vinkler. For hver vinkel, ble ampuller med enten 0-7 eller 20-27 dager gamle w ¹¹¹⁸ fluer (en standard laboratorium belastningen) utsatt for fire streiker med 5 min mellom streik. Tre ampuller med 60 fluer ble undersøkt for hver vinkel. Fluer ble overført til ampuller med melasse mat, inkubert ved 25 ° C, og antallet døde fluer ble talt etter 24 timer. Den gjennomsnittlige MI ₂₄ og standard feil av gjennomsnittet ble beregnet for hver vinkel. Disse data indikerer at større vinkler av deflection, altså., Mer alvorlige primære skader, resultere i en høyere MI ₂₄ enn mindre vinkler av deflection, altså., Mindre alvorlige skader. Dette ble observert for både 0-7 og 20-27 dager gamle fluer. Videre, i samsvar med Katzenberger et al. ^10, 20-27 dager gamle fltallet hadde en betydelig høyere MI ₂₄ enn 0-7 dager gamle flyr på vinkler ≥50 °. Således indikerer disse data at ved flere tider MI ₂₄ korrelerer med alvorlighetsgraden av den primære skaden.

Fig. 1: Diagram av HIT-enheten (A) illustrasjon av toppriss av HIT anordningen i hvilestilling. (B) Illustrasjon av sideriss av HIT-enheten. Fjæren er vist i hvilestilling (mørk rød) og avbøyes til 90 ° (lyserød).

Figur 2:. Primær skadegrads korrelerer med MI ₂₄ Vi bestemt MI ₂₄ for 0-7 dager gamle w 1118 fluer (lys grå søyler) og 20-27 dager gamle w ¹¹¹⁸ fluer (mørke grå søyler) som ble utsatt for fire streik fra HIT enheten med fjær forandret retning til de angitte vinkler i grader. De 0 graders data er for fluer ikke utsatt for det HIT enheten. Vist er den gjennomsnittlige MI ₂₄ og standard feil av gjennomsnittet. MI ₂₄ av 0-7 og 20-27 dager gamle fluer var signifikant forskjellig for 50 ° (P <0,05, en halet t-test) og vinkler> 50 ° (p <0,001, en ​​halet t-test), men ikke for vinklene < 50 ° (P> 0,1, en ​​tailed t test).

Discussion

HIT anordning Metoden skiller seg fra andre metoder som påfører traumatisk skade i fluer ved det faktum at den forårsaker lukket hode i stedet for å trenge inn TBI ^11. Videre tar HIT enhet metoden mindre tid, krefter og ferdigheter til å påføre TBI i mange fluer, slik at metoden er mer mottagelig enn andre metoder til store genetiske skjermer. Til slutt, for at primær skader påført av HIT-enheten ikke er begrenset til hjernen er både en begrensning og en fordel. Det er en begrensning fordi flere studier er nødvendig for å vurdere om fenotyper skyldes traumatisk skade på hjernen eller andre kroppsdeler. På den annen side, polytrauma (traumatisk skade i flere kroppsdeler) ofte ledsager TBI og er antatt å modulere TBI fenotyper, så HIT anordning metoden kan anvendes for å undersøke bidraget fra polytrauma til TBI fenotyper. Flua TBI modellen har også fordeler i forhold til gnagere og ikke-menneskelige primater TBI modeller in vivo avbildning osv.

Denne protokollen beskriver bygging og drift av HIT enhet, som er designet for å påføre lukket hode TBI i fluer. Vi har brukt HIT anordningen i forbindelse med MI _{24 <}/ Sub> analyse for å studere organisme død etter TBI ^7. Imidlertid kan fly TBI modellen brukes på mange andre måter å forstå døden samt andre konsekvenser av TBI. For eksempel kan fysikalske konsekvenser av TBI måles ved hjelp av analyser for parametere som klatring eller fly, og atferdsmessige konsekvenser av TBI kan måles ved hjelp av analyser for parametere som søvn og læring og hukommelse ^10,12-14. Strukturelle virkninger på hjernen kan bestemmes ved bruk av avbildningsteknikker slik som immunfluorescens-mikroskopi og transmisjonselektronmikroskopi. Molekylære virkninger på hjernen kan bestemmes ved hjelp av analyser av genomiske slik som RNA-seq eller proteomic assays slik som masse-spektrometri. Genetiske effekter på hjernen kan bestemmes ved hjelp av metoder som betinget genet knockdown og overuttrykk. Miljøeffekter på konsekvensene av TBI kan bestemmes ved varierende pre- eller post-skade parametere som inkubasjonstemperaturen og diett eller parametre forHIT enhet som vinkelen på våren nedbøyning eller tiden mellom repeterende streik. Endelig kan HIT enheten brukes for store genetiske skjermer for å løse grunnleggende spørsmål som hvorfor konsekvensene av TBI er verre i eldre personer enn yngre enkeltpersoner så vel som for store narkotika-skjermer som kan brukes til å identifisere behandlinger for konsekvensene av TBI.

Når den brukes på en konsekvent måte, har vi funnet at HIT enheten produserer reproduserbare fenotyper blant uavhengige eksperimenter og brukere. Parametere som kan påvirke reproduserbarhet er oppsett og drift av HIT enheten. Fenotyper kan bli betydelig påvirket av små endringer i plasseringen av isen bøtte dekselet i forhold til styret, posisjonen til bomullsdott i fluehetteglasset, og plasseringen av hetteglasset i forhold til borrelåsen. Videre, som vist i figur 2, fenotyper kan bli betydelig påvirket av små forandringer ivinkel på våren deflection. Derfor bør nye brukere av HIT-enheten overvåkes for å sikre at oppsett og operasjon er identisk med andre brukere. Vi rutinemessig kalibrere nye brukere ved å ha dem bestemme MI ₂₄ av 0-7 dager gammel w ¹¹¹⁸ fluer. Endelig gjør HIT-enheten ikke trenger å være identisk med den som er beskrevet i protokollen. Vi regner med at de fleste deler av HIT-enheten kan endres samtidig som evnen til å påføre TBI i fluer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zinc plated compression spring	The Hillman  Group	540189	9 7/8 inch (length, 2.2 cm), 15/16 inch (outer diameter, 2.4 cm), 0.12 inch (wire size, 0.3 cm)
Wooden board			9 inch (length, 22.9 cm), 6.5 inch (width, 16.5 cm), 0.75 inch (height, 1.9 cm)
Clamps	Sigma Electrical Manufacturing Corporation	49822	3.10 inch (length, 7.9 cm), 0.68 inch (width, 1.7 cm), 1.11 inch (height, 2.8 cm), EMT Two Hole Straps, click on type for 1 inch (2.5 cm) steel EMT conduit
Loop half of self-adhesive velcro			3 inch (length, 7.6 cm), (3/4 inch width, 1.9 cm)
Polyurethane ice bucket cover	Fisher Scientific	02-591-45	9 1/8 inch (length, 23.2 cm), 9 1/8 inch (width, 23.2 cm), 1 1/4 inch (height, 3.2 cm)
Plastic fly vials	Applied Scientific	AS-510	3 11/16 inch (height, 9.4 cm), 1 1/16 inch (inner diameter, 2.7 cm), 1 1/8 inch (outer diameter, 2.9 cm)
Large cotton balls	Fisher Scientific	22-456-883
Paper protractor			10 inch (diameter, 25.4 cm)