Introduction
심장 이식 모델은 자주 I / R 상해, 동종 이식 거부 반응, 이식 후 혈관 및 면역 에이전트의 효율성을 조사하는 데 사용됩니다. 마우스 모델은 공지 된 면역 학적 및 유전 적 배경이 많은 근친 형질 전환 균주 및 상대적으로 낮은 비용의 실험 가용성과 같은 많은 이점을 결합한다.
1973 년 생쥐의 복부 심장 이식하는 기술이 먼저 코리 등 1에 의해 설명되었다. 이 모델에서 이식받는 사람의 복부 대동맥과 하대 정맥에 주 폐동맥의 상행 대동맥의 엔드 - 투 - 측 문합에 의해 revascularized된다. 1991 년 생쥐의 자궁 심장 이식 봉합 기술은 첸 등의 알 2에 의해 설명되었다. 이 모델에서 역행 관상 동맥의 관류는 GR의 상행 대동맥에받는 사람의 경동맥 동맥의 문합에 의해 설립선미. 정맥 혈액 우심방, 우심실에 관상 정맥동을 통해 배수 및받는 사람의 외부 경정맥 정맥 (그림 1)에 폐동맥을 통해 배출됩니다. 복부 이식 주입에 비해 자궁 모델은 덜 침습적이며, 이식의 표면 위치는 추가로 추적 검사 (예 촉진, 심장 초음파 검사, 생체 내에 형광 현미경) 3,4를위한 아주 쉽게 접근 할 수 있습니다.
기술 향상 5,6에도 불구하고,이 모델의보다 광범위한 사용은 문 합부 누출과 혈전증의 발생률이 높은과 작은 혈관의 봉합 문합을 수행하기 때문에 기술적 인 문제에 국한되고있다. 1991 년, 마츠우라 등. 혈관벽 크게 자궁 심장 이식 7의 모델을 용이하게 합성 실린더 위에 everted되는 커프 기술을 소개했다. 이 기술은 푸이었다rther 신장 (8), 췌장 (9), 사지 (10), 간 11, 12, 13, 14 폐 및 혈관 이식 (15) 등 다양한 실험 이식 모델에 채택했다. 봉합 기술에 비해 필요한 문합을위한 시간과, 따라서, 온 허혈 손상 시간이 짧고에 커프 (16)의 기술을 이용하여 상당히 적은 혈관 합병증이있다. 또한, 높은 성공률로 동작을 수행하도록 미세 작은 외과 훈련 할 수있다. 커프 기술의 단점은 대뇌 재관류를 변경할 수 경동맥의 결찰 필수이다.
이 비디오 논문에서는 생쥐의 자궁 심장 이식을위한 개선 및 단순화 된 커프 기술을 제시한다.
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Protocol
모든 실험은 독일 심장 센터 뮌헨과 바이에른, 독일 (GZ. 55.2-1-54-2532.3-17-13)의 정부에 의해 승인되었다. 동물은 특정 병원체 무료 시설에 보관하고 의학 연구를위한 국가 사회와 국립 아카데미에서 제공하는 "실험 동물의 관리 및 사용을위한 가이드"에 의해 공식화 "실험 동물 관리의 원칙"을 준수하여 인간의 치료를받은 과학 및 국립 보건원 (NIH 출판 NO. 86-23가 1985 년 개정)에 의해 출판.
참고 : 두 개의 곡선 집게 및 선박 dilatators 포함 멸균 미세 수술 장비의 완전한 세트는, 절차 (그림 2a) 필요합니다. 수술 전후 예방 적 항생제는 일상적으로 필요한 것은 아니지만 면역 동물에 표시 될 수있다. 동물 단말기 이소 플루 란 흡입을 이용하여 희생되었다.
기증자 준비 및 이식 수확
<OL>2.받는 사람 준비
- 준비11 호 메스 또는 현미경 가위로 폴리이 미드 튜브를 절단하여 문합을위한 커프스. 커프는 원통형 몸체 및 혈관 클램프의 배치를위한 확장 (원주의 1 / 3의), 1mm (도 2b)의 길이가 각각 이루어져있다.
- 동물을 마취하고 전술 한 바와 같이 수술 내성을 확인. 유체 교체 0.25 ml의 따뜻한 식염수의 피하 (SC)를 주입한다.
- 전기 면도기를 사용하여 오른쪽 자궁 지역의 머리를 제거하고 따뜻한 패드 앙와위에서 동물을 배치합니다. 호흡을 손상시킬 수있는이 같은 전면 사지를 overstretching 피하면서 테이프의 가닥 다리를 고정합니다. 건조 함을 방지하기 위해 안과 용 연고를 사용하여 눈을 커버. 수술 부위를 클로르헥시딘으로 3 회 소독한다.
- 경정맥 노치에 오른쪽 하악 각도에서 가로 피부 절개를합니다.
- 퉁명스럽게 내선 동원ernal 경정맥. 바이폴라 집게와 곁가지를 소작하고 그들을 가로로 쪼개다.
- 턱밑 샘에서 정맥과 합류의 수준에서 합자 사이의 외부 경정맥을 나눈다.
- 커프를 통해 외부 경정맥을 당겨 커프의 확장에 혈관 클램프를 배치하여 근위 혈관을 폐색. 합자를 제거 1:10 헤파린 식염수로 혈관 내강을 관개.
- 커프를 통해 혈관 벽을 에버트와 사전 원주 8-0 실크 봉합사로 고정합니다.
- 흉쇄 근육의 피상적 인 부분을 제거합니다.
- 오른쪽 경동맥을 동원 경동맥 분기 아래 합자 사이의 혈관을 가로로 쪼개다.
- 커프를 통해 경동맥을 당겨 커프의 확장에 Yasargil 클램프를 배치하여 근위 혈관을 폐색. 합자를 제거 1:10 헤파린 식염수로 혈관 내강을 관개.
- 부드럽게 dilat전자 혈관 dilatator와 동맥 내강은 커프를 통해 혈관 벽을 에버트와 사전 원주 8-0 실크 봉합사로 고정합니다.
- 이식 주입을위한 충분한 공간을 확보하기 위해, 턱밑 샘의 오른쪽 엽을 제거합니다.
- 이식까지 촉촉한 수술 필드를 유지합니다.
3. 이식 주입
- 거꾸로 내측 지향 대동맥과 측면 폐동맥과받는 사람 자궁 경부 지역에서 이식을 놓습니다.
- 경동맥과 팔목에 걸쳐 이식의 대동맥을 당겨 원주 8-0 실크 봉합사로 문합을 확보.
- 그 앞쪽 측면에 폐 트렁크를 절개와 외부 경정맥과 팔목에 그것을 잡아 당깁니다. 또 원주 8-0 실크 봉합사로 문합을 확보.
- 경동맥의 언 클램프에 의해 다음, 외부 경정맥에 클램프를 제거합니다. 마음은 혈액 즉시 채 웁니다. R을 향상시키기eperfusion는 이식 상에 37 ° C 따뜻한 식염수를 놓습니다. 일반적으로 심장은 1 분 내에 동 율동을 개발하고 있습니다. 정맥 사이트에서 커프 확장을 제거합니다.
- 올바른 이식 위치를 확인, 문합은 비틀림없이 긴장이없는 선박이어야합니다. 이 이후 피부의 소작 혈관은 상처 치유를 손상시킬 수는 없습니다. 일반적으로 출혈 자발적으로 중지합니다. 단일 8-0 연속 봉합으로 피부를 닫습니다.
4. 수술 후 케어
- 유체 교체 0.25 ml의 따뜻한 식염수 사우스 캐롤라이나를 주입한다.
- 마취제는 날록손 (1.2 ㎎ / ㎏), 플루 마제 닐 (0.5 ㎎ / ㎏)과는 흉골 드러 누움을 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 따뜻한 패드 위에 동물 왼쪽 SC atipamezol (2.5mg / 체중 kg)을 주사 길항. 비정상적인 행동을 등록하는 적어도 하나의 추가 시간 동안 동물을 관찰한다. 완전히 recove 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 동물을 반환하지 않습니다빨간색.
- 부 프레 노르 핀과 선제 진통제를 제공 (0.05 ㎎ / ㎏ SC 세 하루에 번) 또는 시술 후 72 시간의 최소 기간 동안 지역 기관 프로토콜에 따라 다른 진통제.
- 외과 의사와 수의사는 동물을 정기적으로 볼 수 있습니다. 체중 감소> 15 %, 무관심, 부종 또는 외과 측 감염 동물의 경우 단말기 이소 플루 란 흡입을 사용하여 안락사된다.
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Representative Results
우리 팀은 성공적으로 약 20 훈련 수술 후 설명 된 기술을 수행 할 수 있습니다. 가장 어려운 부분은 쉽게 다시 플립 여러 시도가 찢어 벽을 초래할 수 있기 때문에, 커프스 위에 경동맥 혈관 벽을 에버트한다. 훈련 기간 후에, 평균 총 수술 시간은 60 ± 8 분이었다. 약 20 분은 기증자 수확, 자궁 혈관 문합과 피부 폐쇄에 대한 15 분 준비를위한 25 분 필요합니다.
심근 I / R 상해의 조사를 위해 우리는 92 %의 수술 성공률 다양한 실험 설정에서 동계 C57BL / 6 마우스에 200 개 이상의 작업을 수행. 조기 사망은 문합을 수행하기에 어려움 (N = 3), 문 합부 누출 (N = 2)의 원인 및 심폐 실패 (N = 10)이었다. 하나의 동물에 의한 신경 손상을 복구 후 안락사되었다. 수술 생존자 중, 이식 생존에> 95 %였다칠일 (그림 4). 동계 이식받는 사람의 숫자는 3 개월 이상 계속 살아있다. 예방 적 항생제를 사용하지 않을에도 불구하고, 우리는 어떤 감염성 합병증을 관찰하지 않았다.
첫 번째 시리즈, 12 동계 C57BL / 6 마우스는 조직 병리학 적 검사 (그림 3)에 대해 이식. 이식은 이식 전에 4 ℃에서 얼음에 저장하여 차가운 허혈 4 시간 노출시켰다. 이식은 재관류 7 일 후에 수확 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E)와 시리우스 빨간색으로 염색 하였다. Nontransplanted 동물 (N = 6) 컨트롤을 역임했다. 조직의 부종, 충혈, 침투 백혈구, 미세 혈관 폐색 및 간질 섬유화와 강력한 염증 반응에 나는 / R 리드. 초기 시리즈에서 한 동물 케타민 / 자일 라진의 반복 주입 한 후 사망했다. 이 합병증은 더 미다 졸람, medetomodine과 펜타닐을 포함하여 완벽한 antagonizable 마취를 사용하여 피할 수 있습니다. < / P>
그림 1 : 이소성 자궁 심장 이식에서 혈액의 흐름 (A) 개략도. 받는 사람의 경동맥 흐름에서 피가 심장 이식을 관류하는 상행 대동맥에와 관상 동맥에 역행. 관상 정맥동을 통해 우심방으로 정맥 혈액 배수구, 우심실을 채우고받는 사람의 외부 경정맥 정맥에 폐동맥을 통해 배출됩니다. 좌심실은 완전히 무시된다. (B) 문합 수술 중보기. 대동맥 (2)가 경동맥 (1) 및 폐 트렁크 대었다 커프 (3) 외부 경정맥와 커프 이상 (4). 그림에서 정맥 문합은 아직 완료되지 않았다.JPG "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 (a)는 두 개의 곡선 집게와 두 개의 용기 dilatators 등 멸균 미세 수술 도구의 전체 세트가 필요합니다. 확장 및 미세 혈관 클램프와 19-24 G에서 문합 커프 (나)가 사용된다.
그림 3 : 심근 I / 동계 C57BL / 6 마우스의 R-부상을 입증 조직 학적 샘플 H & 4 시간 냉 허혈 후 대조군 (A)에서와 동물의 마음의 E 염색 (20X 배율) 및 재관류 7 일 (B).. 장기간의 I / R은 조직 에드와 강력한 염증 반응의 결과EMA, 충혈, 침투 백혈구 및 미세 혈관 폐색. 동일한 실험 환경 시리우스 레드 염색 (40X 배율) 간질 콜라겐 침착을 보였고 후 I / 대조군 (C)과 비교하여 R (D).
그림 4 :. 동계 C57BL / 6 마우스에 이식 생존을 표시 심장 동종 이식 생존 카플란 - 마이어 플롯. 동물 조직 병리학 적 검사를위한 수술 후 7 일째에 안락사 도자기.
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Discussion
우리는 다양한 실험 설정에서 90 % 이상의 성공률과 200 개 이상의 심장 이식을 완료했습니다. 여기에 설명 된 기술로, 전체 절차는 숙련 된 의사에 의해 60 분 내에 완료 될 수있다. 장기 조달 전에 자궁 혈관을 제조함으로써, 총 그래프트 허혈 시간을 20 분으로 제한 할 수있다. 주입 (온 허혈 시간) 대 시간 봉합술 (16)에 비해 커프 기술을 이용하여 현저하게 짧다.
대신 단순히 이전에 5,17 설명 된대로 심장을 절개, 우리는 임상 적으로 사용 심정지 솔루션과 저체온증에 의해 이식을 관류하여 심장 마비를 유도한다. 결정질 Custodiol HTK 용액 10 밀리몰 / ℓ 칼륨과 나트륨, 칼슘, 마그네슘의 낮은 농도를 포함하고 효과적으로 마음을 체포. 첨가제 히스티딘, 트립토판 - 케 토글 루타 레이트가 산증을 감소 ATP를 제공하고, 세포막 보호 뒤링 허혈. 이 오픈 심장 수술 동안 제어 심장 마비의 임상 적 상태와 유사한 심근 I / R 상해의 조사를 위해이 모델에 이상적이다. 또한, 냉 허혈의 시작시 용액 내 심정지 약리 제제의 적용을 허용한다. 0-4 ℃에서의 저장을 이식하여 4 시간의 최대 시간 간격이 가능하다. 장시간 허혈 시간은 오른쪽 심장 챔버 및 출혈의 overextension 복잡 심근 hypocontractility 발생할 수 있습니다.
우리의 경험에서 몇 가지 중요한 키 포인트는 성공적인 재관류를 촉진 할 것이다. 완전한 경동맥의 동원 및 문합을위한 저 프로파일 Yasargil 클램프 vassel 최대 길이의 사용에 의해 유지 될 수있다. 연축은 동맥 상 1시 10분 희석 베린 낙하를 방지 할 수있다. 신경 학적 손상을 방지하기 위해 경동맥은 t 담보 순환을 유지하기 위해 분기 아래에 결찰된다 그는 내 경동맥. 혈관 내강이 조심스럽게 벽 찢어을 피하면서 극상 (0.2 ㎜) 팁 선박 dilatator으로 넓혀된다. 우리의 경험에 들고 봉합의 위치는 이전에 7 필수 아닌 설명했다. 커프 크기의 선택은 성공적인 우회술 중요하다. 동맥 문합 용 커프 내부 직경은 그래프트의 큰 대동맥과 불일치를 고려하여 경동맥 (250-300 μm의)의 외경보다 약간 커야한다. 외부 경정맥에 대한 (0.724에서 0.912 mm의 팔목 내경) 19 21 G로 경동맥에 대한 (0.510에서 0.643 mm의 팔목 내경) 22 24 G에 20-25g 사용 수갑 무게 마우스 및 소매 용 . 우리는이 매듭을 용이로 polyfilament 봉합사 (실크)를 선호한다. 미세 혈관 클램프 커프의 확장에 배치됩니다. 이것은 용기를 고정화하고 벽 외번을 용이하게한다.
그것은 회복을 연장하고 수술 사망률의 주요 원인이기 때문에 "ove_content> 저체온증 조심스럽게 피해야한다. Antagonizable neuroleptanalgesia 미다 졸람, medetomodine를 사용 펜타닐은 케타민 / 자일 라진 (18)에 비해 복구를 좋은 수술 내성을 제공하고 건다.자궁 심장 이식 모델은 비 생리적 비 적재 심장 모델 인한 심장 내 혈류에 고유 방향성이지만, 실험은 심장 이식에서 필수적인 도구이다. 이 비디오를 종이에 표시된 기술적 인 세부 사항은 연구가 실험실에서 비교적 쉽게이 모델을 수립 할 수 있도록해야한다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps JFC-7.2 | S&T | P-00036 | Curved tip 0.20 mm |
| Vessel dilatator D-5a | S&T | S-00124 | |
| Adventita scissor | S&T | S-00102 | |
| Vascular clamp B-1V | S&T | S-00396 | |
| Yasargil Clip | Peter Lazic | 65,097 | 3.5 mm lenght |
| Bipolar forceps | Micromed | 148-100-011 | tip 0.25 mm |
| Polyimide tubes | River Tech Medical | 19-24 gauge | |
| 8.0 silk ligatures | Catgut | ||
| Custodiol HTK solution | Essential Pharmaceuticals |
References
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