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Biology

एक विशिष्ट संवेदी प्रकोष्ठ के correlative confocal और 3 डी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

doi: 10.3791/52918 Published: July 19, 2015

Abstract

एक सेल फैटी का चित्रण अपने कार्य को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। यह एक ऐसी आंतों उपकला के enteroendocrine कोशिकाओं के रूप में विविध प्रकार की कोशिकाओं से बना ऊतकों भर में दूर तक फैला हुआ दुर्लभ प्रकार की कोशिकाओं के लिए एक मुश्किल परियोजना हो सकती है। 1,000: वे 1 के अनुपात में अन्य उपकला कोशिकाओं के बीच बिखरे हैं क्योंकि खाद्य और बैक्टीरिया के इन जठरांत्र सेंसर अध्ययन करने के लिए मुश्किल हो गया है। हाल ही में, ट्रांसजेनिक संवाददाता चूहों प्रतिदीप्ति के माध्यम से enteroendocrine कोशिकाओं की पहचान करने के लिए उत्पन्न किया गया है। उन में से एक पेप्टाइड YY-GFP माउस है। इस माउस का प्रयोग, हम confocal और धारावाहिक ब्लॉक चेहरे स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सहसंबंधी करने के लिए एक विधि विकसित की है। हम विधि cocem3D का नाम है और ऊतकों में एक विशिष्ट enteroendocrine सेल की पहचान करने और 3 डी में सेल के फैटी अनावरण करने के लिए आवेदन किया। cocem3D का संकल्प मात्रा पुनः के लिए कोशिका झिल्ली स्रावी vesicles के रूप में के रूप में छोटे अंगों की पहचान करने के लिए और अलग करने के लिए पर्याप्त हैndering। Cocem3D आसानी से अपने देशी ऊतकों में अन्य विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के 3 डी फैटी अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

एक कोशिका के अंदर जीवन समय और अंतरिक्ष में जगह लेता है। समय के साथ परिवर्तन अक्सर सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी तरह प्रतिदीप्ति इमेजिंग तकनीक के साथ संयुक्त समय चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग अध्ययन कर रहे हैं। अंतरिक्ष, एक सेल या सेल करने वाली सेल बातचीत के अंदर अंगों की व्यवस्था विशेष रूप से, केवल सेल के ठीक संरचना की एक पूरी खाते से प्राप्त किया जा सकता है। एक सेल के ठीक संरचना की एक व्यापक खाते भी सी की तरह, जीनोम उपलब्ध है जिन मामलों में जीनोमिक कार्य करने के लिए स्पष्टता ला सकता है एलिगेंस निमेटोड 1 या फ्लैट प्लेकोजोआ tricoplax 2 adherens। सीरियल सेक्शनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अब एक कुशल प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, समय, और धारावाहिक ब्लॉक चेहरे स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 3 (SBEM) जैसे स्वचालित 3 डी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी प्रौद्योगिकियों के विकास के लिए कम खर्चीला काम धन्यवाद है।

समारोह को स्पष्ट करने के लिए संरचनात्मक जानकारी के लिए आवश्यकता के कुछ सेल में बहुत स्पष्ट हैइस तरह के न्यूरॉन्स, glia, या संवेदी उपकला कोशिकाओं के रूप में समारोह भौतिक सेल करने वाली सेल बातचीत पर निर्भर करता है, जहां एल प्रकार,। हम पेट के लुमेन में पोषक तत्वों से संवेदी संकेतों अंततः भूख बढ़ाने वाला व्यवहार modulates कि एक विद्युत संकेत में transduced रहे हैं कि कैसे elucidating में विशेष रूप से रुचि रखते हैं। सर्किट जटिल है, लेकिन पोषक तत्वों संवेदी उपकला कोशिकाओं कहा जाता है, enteroendocrine कोशिकाओं के साथ संपर्क में आते हैं, जहां आंत की दीवार पर शुरू होता है। इस तरह के स्वाद कोशिकाओं के रूप में अन्य संवेदी उपकला कोशिकाओं के विपरीत, enteroendocrine कोशिकाओं एक हजार 4-7 करने के लिए एक के अनुपात में पेट उपकला भर में बिखरे हैं। नतीजतन, वे पहचान और अध्ययन करने के लिए मुश्किल हो गया है, और लंबे समय के लिए वे केवल पेट हार्मोन के एक स्रोत के रूप में देखा गया। लेकिन सेल विशिष्ट प्रतिदीप्ति संवाददाता चूहों के विकास के साथ, इन कोशिकाओं के जटिल संवेदी समारोह में उभर रहा है। इन संवाददाता चूहों में से एक, एक पेप्टाइड YY-GFP (PyyGFP) माउस का उपयोग करना, हम चाहते हैं कि enteroendocr पायाine कोशिकाओं हम neuropod नाम दिया है कि एक प्रमुख cytoplasmic पूंछ है। neuropods की उपस्थिति सेल करने वाली सेल संचार में एक संरक्षित समारोह का सुझाव दिया। इस प्रकार, हम एक enteroendocrine सेल के फैटी दस्तावेजीकरण द्वारा, neuropods के समारोह में प्राप्त किया जा सकता है कि समझाया।

पहचान करना मुश्किल है जो एक छितरी सेल में एक उपांग की संरचना समझने की जरूरत confocal माइक्रोस्कोपी और SBEM गठबंधन करने के लिए एक विधि विकसित करने के लिए मुख्य तर्क यह था। ब्याज की सेल PyyGFP enteroendocrine सेल विशिष्ट संवाददाता चूहों का उपयोग पहचान की थी। विधि हमें एक enteroendocrine सेल और उसके neuropod की पूरी फैटी दस्तावेज़ करने के लिए अनुमति दी। Neuropods के भीतर, हम न्यूरोनल axons की ढांचागत सुविधाओं पाया, और neuropods बाहर, हम आंतों का glia 8 के लिए एक शारीरिक संबंध पाया गया। दरअसल, neuropods इन कोशिकाओं के स्रावी समारोह में एक आवश्यक भूमिका का सुझाव सभी स्रावी vesicles के बारे में 70% होते हैं। निर्भर होनासंरचनात्मक डेटा, और हाल ही में हम इन neuropods के माध्यम से, enteroendocrine कोशिकाओं और न्यूरॉन्स पेट जीभ 8,9 में स्वाद कोशिकाओं के समान एक neuroepithelial सर्किट फार्म innervating पाया।

संरचनात्मक डेटा से उपजी जठरांत्र chemosensory तंत्र की ऐसी सुविधाओं Uncovering इस correlative माइक्रोस्कोपी विधि का उपयोग कर एकत्र हुए। हम इस विधि कोशिकाओं को एक बहुत कम अनुपात में ऊतकों के भीतर बिखरे हैं विशेष रूप से जहां कोशिका जीव विज्ञान के अन्य क्षेत्रों में उपयोगी हो सकता है। हम 3 डी (Cocem3D) में correlative confocal और धारावाहिक ब्लॉक चेहरे स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के रूप में विधि के लिए भेजा। विधि के बाद मुख्य चरण के शामिल है: ऊतक विच्छेदन, confocal माइक्रोस्कोपी, SBEM इमेजिंग, SBEM और confocal छवि सहसंबंध, और मैनुअल विभाजन। सहसंबंध शारीरिक के बजाय रासायनिक है क्योंकि अन्य correlative तरीकों की तुलना में, अवधारणा नहीं बल्कि साधारण है।

Protocol

सभी जानवरों की देखभाल और प्रयोगों के ड्यूक विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया।

Cocem3D पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल 10,11 के संयोजन से उपजी है और एक PyyGFP संवाददाता माउस 12 का उपयोग करते हुए एक विशिष्ट enteroendocrine सेल का अध्ययन करने के लिए यहाँ लागू किया गया था। इस विधि को आसानी से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ट्रांसजेनिक संवाददाता चूहों का उपयोग हित के अन्य कोशिकाओं को लागू किया जा सकता है। correlative confocal माइक्रोस्कोपी, धारावाहिक ब्लॉक चेहरे स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SBEM), और 3 डी में समर्पण डेटा: विधि के तीन वर्गों में वर्णित है।

Correlative confocal माइक्रोस्कोपी

इस खंड के उद्देश्य correlative confocal और SBEM इमेजिंग की अनुमति है कि आयामों के बाहर का बृहदान्त्र से एक ऊतक खंड फसल के लिए है। इस प्रकार के रूप प्रोटोकॉल है:

1. फसल काटने वाले ऊतक

  1. तैयार करनापीबीएस में 50 माइक्रोग्राम / एमएल हेपरिन समाधान के 10 मिलीलीटर।
  2. 10 ketamine का मिलीलीटर (100 मिलीग्राम / एमएल) और xylazine के 1 मिलीलीटर (20 मिलीग्राम / एमएल) के मिश्रण से xylazine / ketamine संवेदनाहारी स्टॉक तैयार करें।
    1. 0.1M पीबीएस में 4: xylazine / ketamine शेयर 1 पतला।
  3. पीबीएस में 4% paraformaldehyde और 0.1% glutaraldehyde युक्त लगानेवाला समाधान के 100 मिलीलीटर तैयार करें।
  4. Xylazine / ketamine संवेदनाहारी के एक घातक खुराक के साथ, 6 से 10 सप्ताह पुरानी एक PyyGFP माउस, anesthetize। माउस वजन के 20 ग्राम प्रति 0.15 मिलीलीटर पर intraperitoneally संवेदनाहारी इंजेक्षन।
  5. पूंछ या पैर की उंगलियों pinching द्वारा उचित माउस anesthetization पुष्टि करें, और सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर मरहम का उपयोग करें।
  6. लगानेवाला intracardially 10 छिड़कना के लिए एक चर प्रवाह क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का प्रयोग करें। शल्य कैंची का प्रयोग (13 सेमी लंबाई) में कटौती आंतों, हृदय और फेफड़ों को बेनकाब करने के लिए उदर गुहा खुला। संकीर्ण पैटर्न घुमावदार संदंश (12 सेमी लंबाई) के साथ दिल पकड़ो और क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप से तितली सुई (19 जी) डालने मैंNto निलय छोड़ दिया है। इसके तत्काल बाद, वसंत सीधे कैंची (लंबाई 4 मिमी) के साथ सही अलिंद काटा। 2 मिलीलीटर की दर से छिड़कना / मिनट पहले माउस की पूंछ तक 15 मिनट के लिए ठंडा लगानेवाला समाधान के साथ फिर हेपरिन 1 मिनट के लिए समाधान है, और साथ पूरी तरह से कठोर है।
    नोट: यह आंत्र mucosa में छोटे जहाजों की फोड़ को रोकने के लिए एक धीमी दर पर छिड़कना करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। जहाजों की फोड़ ऊतक के फैटी समझौता होगा। छिड़काव के लिए पर्याप्त है, तो जिगर 3-5 मिनट के भीतर रंग में पीला बारी चाहिए।
  7. का प्रयोग छोटे कैंची पेट की गुहा खुला और बाहर का मलाशय के लिए अंधान्त्र साथ जंक्शन से पूरे पेट के आबकारी। ठंडा पीबीएस में ऊतक रखें। पीबीएस में डूबे हुए है, जबकि छोटे वसंत कैंची से अन्त्रपेशी साथ पेट के खुले में कटौती।

2. ऊतक सेगमेंट विदारक और फिक्सिंग

  1. एक स्केलपेल का उपयोग करना, बाहर का बृहदान्त्र से लगभग 6 छोटे ऊतक खंड (2 मिमी 2) में कटौती। एक पत्रक ओ पर यह मत करोएफ दंत मोम और पीबीएस की कुछ बूंदों में डूबे हुए।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए लगानेवाला समाधान में ऊतक वर्गों का पोस्ट-ठीक।

3. सूक्ष्म विदारक ऊतक ब्लॉक

  1. Agarose पीबीएस में 5% कम पिघलने को तैयार है और 45 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में रहते हैं।
  2. 5% agarose कम पिघलने मानक आकार टिशू टेक cryomold की तरह, एक छोटे से प्लास्टिक कंटेनर का उपयोग करने में ऊतक खंडों शामिल करें।
  3. एक हिल ब्लेड सूक्ष्म पर एम्बेडेड वर्गों माउंट और ठंडा पीबीएस के साथ बफर ट्रे भरें।
  4. 0.8 आयाम और 0.04 मिमी / सेकंड की गति से 300 माइक्रोन ऊतक स्ट्रिप्स में कटौती। नोट: इस बिंदु पर, ऊतक स्ट्रिप्स agarose से उखाड़ फेंकना किया जाएगा।
  5. पुनः एम्बेड agarose में 300 माइक्रोन ऊतक स्ट्रिप्स और vibratome के ब्लेड लंबरूप सूक्ष्म पर उन्हें माउंट।
  6. एक vibratome का उपयोग, 50 माइक्रोन की मोटाई में ऊतक स्ट्रिप्स में कटौती। नोट: अंतिम ऊतक ब्लॉक के बारे में 300 माइक्रोन चौड़ा x 50 माइक्रोन मोटी होना चाहिए। ये Dimensions enteroendocrine सेल की मोटाई 15-20 माइक्रोन और neuropod की लंबाई 30-70 एनएम के बीच पता चला है कि कि पायलट कोंफोकल प्रयोगों से अनुकूलित कर रहे हैं। सेल के उन्मुखीकरण ऊतक ब्लॉक का सामना करने के लिए समानांतर है, तो इसलिए, एक पूरे सेल 50 माइक्रोन मोटी द्वारा ऊतक 300 माइक्रोन चौड़ा का एक ब्लॉक के भीतर समाहित किया जा सकता है। ब्याज के ऊतकों और सेल प्रकार के आधार पर इन आयामों बदलती हैं।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में ऊतक ब्लॉक स्टोर।

4. confocal इमेजिंग

  1. 4000: 1 में पीबीएस में DAPI गिराए द्वारा एक परमाणु दाग ​​समाधान तैयार है।
  2. 5 मिनट के लिए DAPI परमाणु दाग ​​में ऊतक ब्लॉक सेते हैं। नोट: DAPI धुंधला confocal और SBEM छवियों correlating के लिए उपयोगी है जो उनके नाभिक ने विशिष्ठ व्यक्ति की कोशिकाओं की सुविधा।
  3. आरोप लगाया गिलास स्लाइड पर माउंट ऊतक ब्लॉक, पीबीएस की कुछ बूँदें जोड़ने के लिए, और एक coverslip के साथ कवर।
  4. एक confocal खुर्दबीन का उपयोग करना, ब्लॉक की पहचानबरकरार विल्ली और ब्याज की PyyGFP कोशिकाओं के साथ एस और जेड के ढेर ऑप्टिकल वर्गों को प्राप्त करने के लिए उन्हें imaged।
    1. 1 माइक्रोन ऑप्टिकल वर्गों के Z ढेर प्राप्त करने के लिए एक 20X / 0.8 जीस योजना Apochromat उद्देश्य का उपयोग करें।
    2. Z ढेर के लिए, अन्य कोशिकाओं को रिश्ते निर्धारित करने के लिए 405 एनएम (DAPI) के लिए चैनलों का उपयोग, 488 एनएम अंतर्जात GFP के ब्याज की सेल स्थानीयकरण करने के लिए, और अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) के लिए सेल रिश्तेदार के स्थान निर्धारित करने के लिए लुमेन।
    3. 1,024 पिक्सेल या अधिक की छवि संकल्प का प्रयोग करें।

Agarose में 5. एम्बेडिंग ब्लाकों

  1. पीबीएस में 4% paraformaldehyde और 2.5% glutaraldehyde युक्त लगानेवाला के 10 एमएल तैयार करें।
  2. ध्यान से ऊतक ब्लॉक को नुकसान पहुँचाए बिना दूर गिलास स्लाइड से coverslip स्लाइड करने के लिए कवर पर्ची के किनारों में पीबीएस जोड़कर गिलास स्लाइड से ऊतक ब्लॉक निकालें। फिर, एक 1 करने के लिए स्लाइड से ऊतक ब्लॉक स्थानांतरित करने के लिए एक कला तूलिका का उपयोग.5 मिलीग्राम 4% paraformaldehyde और 2.5% glutaraldehyde लगानेवाला युक्त microcentrifuge ट्यूब।
  3. डाक तय ऊतक ब्लॉक हे / एन 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  4. पीबीएस के लिए ऊतक ब्लॉक स्थानांतरण। फिर, 5% दो गिलास स्लाइड के बीच उन्हें sandwiching द्वारा agarose कम पिघलने में फ्लैट ब्लॉक एम्बेड।
    नोट: agarose की एक पतली परत में ब्लॉक एम्बेड धुंधला दौरान पीछे हेरफेर आसान बनाता है।
  5. एक वर्ग में agarose कट और ऊपरी हाथ की ओर एक पायदान बनाते हैं। नोट: इस कदम के बाद के चरणों में उन्मुखीकरण को बनाए रखने के लिए आवश्यक है।
  6. आगे की प्रक्रिया जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस के साथ एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में स्टोर ब्लॉकों।

सीरियल ब्लॉक चेहरे स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SBEM)

इस खंड में, ऊतक ब्लॉक तैयार किया जाता है और कम बढ़ाई SBEM के साथ imaged। ब्लॉक चेहरे के सर्वेक्षण छवि तो ब्याज की सेल युक्त क्षेत्र की पहचान करने के लिए कोंफोकल डेटा के साथ जोड़ा जाता है। क्षेत्र एक बारपहचान की है, ऊतक 7 एनएम / पिक्सेल और 70 एनएम के स्लाइस के एक प्रस्ताव पर imaged है। इस संकल्प और अन्य अंगों से बड़े घने कोर स्रावी पुटिकाओं भेद करने के लिए पर्याप्त था। Enteroendocrine कोशिकाओं में, पुटिकाओं के इस प्रकार के व्यास में 13 एनएम 100 और 150 के बीच भिन्न होता है। इस प्रकार के रूप प्रोटोकॉल है:

6. धुंधला ऊतक वर्गों

  1. पीबीएस से ऊतक निकालें और 0.1 एम cacodylate बफर में तीन बार, 5 मिनट प्रत्येक कुल्ला।
  2. 1 घंटे में 0.1% में tannic एसिड के लिए दाग ब्लॉक कोशिका झिल्लियों 14 के विपरीत बढ़ाने के लिए 0.1 एम cacodylate बफर में भंग।
  3. प्रकाशित प्रोटोकॉल 11 के अनुसार बाद में धुंधला और ऊतकों की निर्जलीकरण बाहर ले। Deerinck एट अल के बाद। प्रोटोकॉल, इन समाधानों को तैयार: 1) 1% (डब्ल्यू / वी) thiocarbonhydrazide (THC); 2) एस्पार्टेट समाधान नेतृत्व; 3) 1% uranyl एसीटेट, और 4) आज़मियम tetraoxyde / पोटेशियम ferrocyanide (Oso 4 / कश्मीर Ferrocyanide)। 4% Oso 4 और 2x मिक्स1 पर [10 एमएल एच 2 ओ में कश्मीर Ferrocyanide और 0.86g ना Cacodylate 0.3g] कश्मीर Ferrocyanide शेयर: 1 के अनुपात Oso 4 / कश्मीर Ferrocyanide बनाने के लिए। नोट: agarose में एम्बेडेड ऊतक के बाद धुंधला दौरान हैंडलिंग सुविधा। सावधानी बाद राल घुसपैठ के लिए agarose हटायें।
  4. कुल्ला नमूने तो तीन 0.1 एम cacodylate बफर में बार, 5 मिनट प्रत्येक, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए OsO4 / कश्मीर Ferrocyanide समाधान के साथ दाग।
  5. 60 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए दर्पण के साथ अल्ट्रा शुद्ध पानी में तीन बार, 5 मिनट प्रत्येक, और दाग में कुल्ला।
  6. आरटी पर 60 मिनट के लिए 2% Oso 4 (कोई कश्मीर Ferrocyanide) के साथ अल्ट्रा शुद्ध पानी में तीन बार, 5 मिनट प्रत्येक और दाग कुल्ला। अल्ट्रा शुद्ध पानी में फिर से तीन बार, 5 मिनट प्रत्येक कुल्ला।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस / 1% uranyl एसीटेट हे के साथ एन दाग। अल्ट्रा शुद्ध पानी में तीन बार, 5 मिनट प्रत्येक कुल्ला।
  8. 60 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए नेतृत्व aspartate के साथ दाग। अल्ट्रा शुद्ध पानी में तीन बार, 5 मिनट प्रत्येक कुल्ला।
  9. Solutio में rinsing द्वारा ऊतकों निर्जलीकरणइथेनॉल की सांद्रता में वृद्धि के साथ एनएस। 50%, 75%, 85%, 95%, और पूर्ण 100% इथेनॉल के साथ, 2 बार, 5 मिनट प्रत्येक कुल्ला। अंत में, प्रोपलीन आक्साइड के साथ दो बार, 10 मिनट प्रत्येक वर्गों कुल्ला।

राल में 7. घुसपैठ और एम्बेडिंग ऊतक वर्गों

  1. राल व्यावसायिक रूप में avaialble किट का उपयोग कर के साथ ब्लॉक घुसपैठ। एक EPON एम्बेड किट का उपयोग राल में शामिल करें ऊतकों। 48% Epoxy, 20% मिलीलीटर DDSA, 30% मिलीलीटर एनएमए, और 2% DMP30 की एक राल मिश्रण तैयार करें। 5 मिनट के लिए सख्ती राल मिश्रण आंदोलन और फिर बुलबुले सतह पर आने के लिए अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए शून्य में मिश्रण जगह है।
  2. 1 पर प्रोपलीन आक्साइड के साथ राल मिक्स: 1 के अनुपात और सख्ती से हिला। ऊतकों से अंतिम निर्जलीकरण कुल्ला निकालें, और propylene ऑक्साइड के साथ मिश्रित राल जोड़ें। एक रोटेटर हे में नमूनों के साथ प्लेस शीशी / एन और शीशी uncapped छोड़ दें। अगले दिन, ताजा बना EPON राल जोड़ने और रोटेटर में 90 मिनट के लिए मिश्रण।
  3. में उन्हें sandwiching द्वारा संभव के रूप में फ्लैट राल में शामिल करें ब्लॉकएक दूसरे को 15 से चिपके से उन्हें रोकने के लिए तरल रिहाई एजेंट के साथ इलाज किया गया है कि कांच की स्लाइड्स के बीच।
  4. ब्लॉक फ्लैट एम्बेडेड रहे हैं एक बार, 60 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 48 घंटे के लिए ब्लॉकों का इलाज।
  5. ब्लॉक जारी करने के अलावा स्लाइड खींचो।

8. बढ़ते और इमेजिंग के लिए ऊतक ब्लॉक ट्रिमिंग

  1. एक विदारक गुंजाइश के तहत, ब्लॉक trimming से पहले ब्याज की कोशिकाओं से युक्त क्षेत्रों की पहचान करने की सुविधा के लिए confocal micrographs की उस के साथ राल में एम्बेडेड ऊतक ब्लॉक के उन्मुखीकरण मैच।
  2. मैन्युअल रूप से नीचे एक ~ 500 X 500 माइक्रोन ब्लॉक-सामना करने के लिए राल एम्बेडेड ब्लॉक ट्रिम।
  3. 30 मिनट के लिए प्रवाहकीय epoxy और शुष्क युक्त एक पिन पर फ्लैट ब्लॉक माउंट। फिर, 60 डिग्री सेल्सियस पर एक सतह और सूखी हे / एन पर ब्लॉक फ्लैट करना।
  4. कोट कोलाइडयन चांदी तरल के साथ ब्लॉक। सीओ की सुविधा के लिए एक सही कोण पर ब्लॉक का टुकड़ा करने की क्रिया सुनिश्चित करने के लिए ऊतक वर्गों फ्लैट बनाए रखेंधारावाहिक ब्लॉक चेहरा और confocal micrographs rrelating।

9. SBEM

  1. छवि एक SBEM प्रणाली से लैस एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग ब्लॉक (ई .g।, 3View)।
  2. सेट प्रारंभिक मोटाई ~ 2 माइक्रोन वेतन वृद्धि पर खंड और ऊतकों के चेहरे ब्लॉक से उभर जब तक कटौती।
  3. पूरे ब्लॉक चेहरे की एक surver छवि मोल।
  4. फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, निर्धारण के दौरान और 16 धुंधला नमूना warping के लिए एक आम विभाजक और खाते उत्पन्न करने के लिए धारावाहिक ब्लॉक चेहरा और confocal दोनों micrographs की माप ले।
  5. Confocal छवियों में निर्देशांक के लिए विभाजक गुणा करके ब्लॉक चेहरे पर ब्याज के क्षेत्र का पता लगाएँ। एक संदर्भ के रूप में, माइक्रोविली, जाम कोशिकाओं, या लामिना propria की स्थिति की तरह है, यह भी अन्य ढांचागत सुविधाओं का उपयोग करें।
  6. पर ब्याज की छवि क्षेत्र एक 2.25 केवी और उच्च वैक्यूम मोड में 7 एनएम / पिक्सेल (या 15,147X बढ़ाई)। स्लाइस वेतन वृद्धि सेट किया जाना चाहिए70 एनएम या उससे कम पर।
  7. कच्चे 16-बिट .dm3 प्रारूप में SBEM डेटा ले लीजिए।

भूतल विभाजन के लिए 10.अनुकूलन SBEM छवियां

  1. 8 बिट झगड़ा करने के लिए कच्चे .dm3 प्रारूप से SBEM छवियों कन्वर्ट।
  2. फिजी में एक 0.8 गाऊसी धुंधला फिल्टर का उपयोग कर छवियों झगड़ा फ़िल्टर।
  3. मूल आकार के 25% के लिए सेट डेटा नीचे पैमाने पर और सेट को संभालने के लिए आवश्यक राम स्मृति की मात्रा को कम करने के लिए एक झगड़ा ढेर के रूप में इसे बचाने के लिए।
  4. अनुवाद मोड में फिजी प्लगइन "झारना के साथ रैखिक स्टैक संरेखण" का उपयोग कर SBEM छवियों के ढेर संरेखित करें और "फसल 3 डी" प्लगइन का उपयोग फसली। नोट: फसल आगे segmenting और मात्रा प्रतिपादन के लिए आवश्यक राम स्मृति की मात्रा कम करने के लिए मदद करता है।

3 डी में डाटा प्रतिपादन

11. confocal माइक्रोस्कोपी

  1. स्वत: "सतहों" उपकरण की विधा को पार का उपयोग कर Z ढेर पुनर्निर्माण किया। चित्रा -1, एक आरईसी से पता चलता हैपूर्ण तीव्रता के रूप में 0.126 माइक्रोन पर सतहों क्षेत्र विस्तार, पर चिकनी विकल्प का उपयोग कर प्रत्येक चैनल की onstruction, और thresholding।

12. सीरियल ब्लॉक चेहरा SEM के

नोट: मैन्युअल डेटा विभाजन एक बहुत समय लेने वाली प्रक्रिया है और कई सप्ताह लग सकते हैं प्रक्रिया प्रदान करने की सुविधाओं पर निर्भर करता है। Bohórquez एट अल में प्रस्तुत वीडियो और आंकड़ों के लिए विभाजन। 2014 8 मैन्युअल रूप से किया और श्रम के बारे में 500 घंटे के लिए ले लिया गया था। यह विभाजन की प्रक्रिया शुरू होने से पहले प्रतिपादन की जरूरत के लिए आवश्यक सुविधाओं को प्राथमिकता करने के लिए सिफारिश की है। प्रक्रिया निम्नलिखित है:

  1. ड्रा मोड में "सतहों" उपकरण और ब्याज की सेल गाया मैन्युअल रूप से खंड और मात्रा के लिए 50 मिसे के मोड ड्राइंग पर "समोच्च" विकल्प का प्रयोग करें।
  2. चिकनी प्रतिपादन या तेज प्रतिपादन के लिए हर 5 स्लाइस के लिए सेल के हर टुकड़ा पर आकृति ट्रेस।
  3. निर्यात अंतिम आईएम300 डीपीआई या अधिक के एक प्रस्ताव पर "स्नैपशॉट" उपकरण का उपयोग उम्र।

Representative Results

यहाँ प्रस्तुत विधि उपकला की एक परत के भीतर एक विशेष सेल का फैटी अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस मामले में ब्याज की सेल मायावी enteroendocrine सेल है। बगल में उनकी पहचान केवल सेल विशिष्ट प्रतिदीप्ति संवाददाता चूहों के विकास के साथ पिछले कुछ वर्षों में संभव हो गया है। 2011 में, हम हार्मोन पी वाई वाई के प्रमोटर हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन 17 की अभिव्यक्ति जो ड्राइव में एक चूहा विकसित किया है। इस PyyGFP माउस में, छोटी आंत और पेट के बाहर का भाग की enteroendocrine कोशिकाओं को आसानी से पराबैंगनी प्रकाश के तहत प्रतिष्ठित हैं। इस माउस मॉडल एक enteroendocrine सेल युक्त एक ऊतक ब्लॉक की पहचान करने और SBEM के लिए यह प्रक्रिया करने के लिए एक आधार था। सहसंबंध विधि cocem3D यहाँ के रूप में जाना जाता है और पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल 10,11 पर बनाया गया था।

ऊतक ब्लॉक के आयामों का अनुकूलन सह-संबंध के लिए महत्वपूर्ण है। प्रारंभिक प्रयोगों में,यह ब्याज की सेल के पूरे शरीर को कवर करते हुए एक ऊतक ब्लॉक में 300 माइक्रोन लंबे x 50 माइक्रोन मोटी SBEM छवियों की संख्या एक न्यूनतम करने के लिए कम हो जाता है कि निर्धारित किया गया था। चित्रा 1 ए एक हिल ब्लेड microtrome के लिए प्रयोग कर विच्छेदन की एक अनदेखी से पता चलता है सही आयामों के साथ ऊतक ब्लॉक प्राप्त करते हैं। कम से कम 100 ब्लॉकों ब्याज की कोशिकाओं बरकरार साथ उन लेने के लिए उन के माध्यम से छंटाई से पहले प्राप्त कर रहे हैं। चयनित ब्लॉकों confocal माइक्रोस्कोपी और छवि Z ढेर ने उतारी रहे हैं ऑप्टिकली हर 1 माइक्रोन (चित्रा 1 बी और सी) स्थान दिया गया है। चित्रा -1 माउस के लघ्वान्त्र में एक enteroendocrine सेल की एक मात्रा गाया दृश्य दिखाता है। इसका प्रमुख neuropod ~ 60 माइक्रोन के लिए उपकला कोशिकाओं के नीचे फैली हुई है।

ब्याज की सेल पूरे ब्लॉक चेहरे की एक SBEM छवि के साथ कोंफोकल Z ढेर correlating से पाया जाता है। एक उदाहरण के एक PyyGFP के बाहर का बृहदान्त्र से एक ब्लॉक के यहां प्रस्तुत किया हैमाउस। कोंफोकल Z ढेर (2A चित्रा) प्राप्त करने के बाद, ब्लॉक कम पिघलने agarose की एक पतली परत (चित्रा 2B) में अंतर्निहित है। इस ब्लॉक के बाद के हेरफेर के लिए आवश्यक है। यह SBEM स्लाइस के साथ ऑप्टिकल स्लाइस मैच के लिए संभव के रूप में फ्लैट ब्लॉक के उन्मुखीकरण को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। चित्रा -2 में, एक प्रतिनिधि छवि ऊतक ब्लॉक के पूरे चेहरे का दिखाया गया है। इस आंकड़े के हिस्से पहले से Bohorquez एट अल में प्रकाशित किए गए थे।, 2014 8। यह बाद में खाता ऊतक स्थलों और आयामों में लेने के द्वारा confocal छवि के साथ जोड़ा गया था। चित्रा 2 डी खुलासा ब्लॉक के confocal और SBEM छवि का ओवरले से पता चलता है ब्याज की हमारी सेल का सटीक स्थान।

सेल की पहचान की गई है, एक बार SBEM इमेजिंग स्रावी vesicles और अन्य सेल organelles की पहचान करने के लिए पर्याप्त उच्च एक प्रस्ताव पर किया जाता है। डेटा सेट में वह प्रस्तुतब्लॉक की छवियों को हर 70 समुद्री मील दूर ले जाया गया के रूप में पुन पिक्सेल प्रति 7 एनएम पर उतारी थी। डेटा सेट ऊतक गहराई के 45 माइक्रोन कि अवधि 643 छवियों निहित। कुछ microns कम बढ़ाई पूरे ब्लॉक चेहरे की प्रारंभिक इमेजिंग के दौरान मुंडा कर रहे हैं। कच्चे SBEM डेटा सेट .dm3 प्रारूप में हासिल कर लिया और बाद में निपटने के लिए झगड़ा करने के लिए बदल गया था। SBEM ढेर के हित के ही क्षेत्र को शामिल करने के लिए फिजी सॉफ्टवेयर प्लगइन "फसल (3 डी)" ब्लॉक का उपयोग फसली गया था। यह मात्रा प्रतिपादन के लिए आवश्यक रैम स्मृति की मात्रा कम कर देता है। सेल में अपनी स्थिति और स्रावी पुटिकाओं द्वारा की पहचान की है, और Imaris सॉफ्टवेयर का उपयोग कर हिस्सों में बंटा हुआ था। 3 enteroendocrine सेल की 3 डी में एक प्रतिपादन होता है चित्रा।

चित्र 1

चित्रा 1:। Correlative confocal माइक्रोस्कोपी (ए) कार्यप्रवाह के एक टुकड़े टुकड़े करनाएक ऊतक में आंतों ऊतक 300 X 50 माइक्रोन मोटी ब्लॉक। (बी) के सही आयामों के एक प्रतिनिधि ऊतक ब्लॉक। माउस छोटी आंत से इन आयामों के एक ऊतक ब्लॉक पेट के बारे में 8 तहखाने के मामले में, के बारे में 3 विल्ली तक फैला है या उस पर ध्यान दें। ब्याज की एक सेल युक्त छोटी आंत में (सी) एक अंकुर। Imaris सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 3 डी में गाया (डी) एक confocal z ढेर एक प्रमुख neuropod आंतों उपकला के नीचे चलने के साथ एक enteroendocrine सेल से पता चलता है। ब्लू = DAPI के परमाणु दाग। बार्स = 10 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: सीरियल ब्लॉक चेहरे स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ए) एक sele की confocal छवि।ब्याज की PyyGFP enteroendocrine कोशिकाओं (हरा) युक्त बृहदान्त्र से cted ऊतक ब्लॉक। ब्लॉक confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged है एक बार (बी), यह तो agarose गिलास स्लाइड का उपयोग कर कम पिघलने में फ्लैट एम्बेडेड है। Agarose में ऊतक ब्लॉक एम्बेड बाद में हेरफेर की सुविधा है, और बाएँ कोने पर निशान सही ओरिएंटेशन में SBEM भीतर ब्लॉक माउंट करने के लिए मदद करता है। ब्लॉक के चेहरे का (सी) SBEM छवि। SBEM साथ कोंफोकल डेटा (डी) सहसंबंध ब्याज (सफेद तीर) के सेल की पहचान करने के लिए। सी और यह आंकड़ा के विकास में छवियां Bohorquez एट अल। से संशोधित कर रहे हैं, 2014 8। ब्लू DAPI के परमाणु दाग =। बार्स = 10 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। Imaris सॉफ्टवेयर का उपयोग कर enteroendocrine सेल का डाटा 3 डी में प्रतिपादन (ए) मात्रा प्रतिपादन। सेल स्रावी पुटिकाओं के साथ पैक एक neuropod गये हैं। एक enteroendocrine सेल के फैटी का पूरा विवरण के लिए, Bohórquez एट अल।, 2014 में 8 को देखें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल chemosensation जैव चिकित्सा अनुसंधान के क्षेत्र में एक नया रोमांचक क्षेत्र के रूप में उभर रहा है। इस वजह से enteroendocrine कोशिकाओं 18 में कार्यात्मक स्वाद रिसेप्टर्स की खोज करने के लिए महान हिस्से में है। बाद के अध्ययन enteroendocrine कोशिकाओं कार्बोहाइड्रेट, लिपिड, और aminoacids 5,6,19,20 सहित पोषक तत्वों, के लिए विशिष्ट रिसेप्टर्स व्यक्त दिखाया है। इन खोजों के लिए उत्प्रेरक कारक enteroendocrine कोशिकाओं fluorescently 20 चिह्नित कर रहे हैं, जिसमें रिपोर्टर चूहों का विकास किया गया है। हम बाहर का छोटी आंत और पेट के 17,21 के enteroendocrine कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए, इन चूहों में से एक, PyyGFP माउस का विकास किया। वे तृप्ति 22,23 के inducers हैं, जो दोनों के पी वाई वाई और ग्लूकागन-जैसे पेप्टाइड 1, स्राव करती क्योंकि ये कोशिकाएं रुचि के हैं। समय में, इन कोशिकाओं की एक पूरी अल्ट्रा संरचनात्मक खाता तो हम उन्हें उनके संकेत तंत्र को समझने के लिए आवश्यक माना गया था, जो लापता हो गया था।

"ontent> यहाँ, हम SBEM साथ confocal माइक्रोस्कोपी पाटने के लिए एक नेत्रहीन एक विधि का वर्णन किया। पद्धति हमें enteroendocrine कोशिकाओं की पूरी फैटी दस्तावेज़ करने के लिए। हम इन कोशिकाओं को तीन में शामिल है कि एक neuropod है सूचित किया है कि अनुमति दी है जो Cocem3D, के रूप में जाना जाता है कोशिकाओं enteroendocrine कि इन neuropods शारीरिक रूप से न्यूरॉन्स से कनेक्ट हालांकि स्रावी पुटिकाओं 8 के सभी के क्वार्टर। neuropod के भीतर, neurofilaments और neuronal एक्सोन ज्यादा पसंद कर रहे हैं, neuropods आंतों का glial कोशिकाओं 8 द्वारा पोषित कर रहे हैं। अधिक महत्वपूर्ण है, यह है आंत innervating और पेट के 9।

Cocem3D की शक्तियों में से एक अपनी सादगी है। कोंफोकल ने उतारी और SBEM एक ऊतक के भीतर एक विशेष सेल की पहचान की सुविधा जा सकता है कि एक ब्लॉक में ऊतक के नमूने को कम करना। स्रावी vesicles और अन्य अंगों 7 एनएम / पिक्सेल के एक प्रस्ताव पर आसानी से पहचाना जा सकता है। SBEM में वर्गों खारिज कर रहे हैं, क्योंकि आगे की प्रक्रियाविशिष्ट प्रोटीन की पहचान करने के ऊतकों का गाना इस बिंदु पर एक विकल्प नहीं है। हालांकि, इस तरह के ऊतकों ब्लॉक से वर्गों संरक्षित कर रहे हैं, जिसमें Atum 24, जैसे तरीकों का विकास, सेल में विशिष्ट प्रोटीन की पहचान सकें होने की संभावना है। Enteroendocrine कोशिकाओं मस्तिष्क में आंत और तृप्ति में भोजन के बीच एक संवेदी इंटरफेस हैं क्योंकि enteroendocrine कोशिकाओं पर chemosensory रिसेप्टर्स की विशिष्ट स्थान निर्धारण, मोटापे के लिए दवा के उपचारों के विकास के लिए आवश्यक जानकारी है।

Disclosures

डॉ सतीश Medicetty के एक कर्मचारी है और Renovo तंत्रिका इंक से 100% वेतन प्राप्त करता है; हालांकि, इस डेटा साझा करने और सामग्री पर जौव नीतियों के लेखक का पालन परिवर्तन नहीं करता है। ब्याज की कोई संघर्ष शेष लेखकों के लिए घोषित किया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline Life technologies 10010023
Heparin sodium salt Sigma H4784
Paraformaldehyde  Sigma 158127 4%, freshly made in PBS, final pH 7.4
Glutaraldehyde Sigma G5882
Dental wax Electron Microscopy Sciences 72660
Low-melting agarose Life technologies 16520-100 5%, freshly made in PBS
Standard Tissue-Tek Cryomold Electron Microscopy Sciences 62534-25
DAPI  nuclear stain Life technologies D1306
Postively charged glass slides and coverslips
Fine art paintbrush #1
Cacodylate buffer Electron Microscopy Sciences 11650
Tannic acid Electron Microscopy Sciences 21700
EMbed 812 kit  Electron Microscopy Sciences 14120
Liquid releasing agent  Electron Microscopy Sciences 70880
Liquid silver colloidal    Electron Microscopy Sciences 12630
CircuitWorks conductive epoxy   ITW Chemtronics CW2400
Variable flow peristaltic pump VWR 70730-064
VT1200S Vibrating blade microtome Leica
Zeiss 780i confocal microscope Carl Zeiss 
Sigma VP Scanning Electron Microscope  Carl Zeiss 
3view system Gatan
Renovo Neural Inc (Cleveland, OH) http://www.renovoneural.com Renovo provides 3d EM services
Fiji software Open access software
Computer station with 16 GB of RAM or more
Data visualization software Imaris 7.5  Bitplane

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References

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एक विशिष्ट संवेदी प्रकोष्ठ के correlative confocal और 3 डी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी
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Bohórquez, D., Haque, F., Medicetty, S., Liddle, R. A. Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell. J. Vis. Exp. (101), e52918, doi:10.3791/52918 (2015).More

Bohórquez, D., Haque, F., Medicetty, S., Liddle, R. A. Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell. J. Vis. Exp. (101), e52918, doi:10.3791/52918 (2015).

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