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Chemistry

बेड़ा नियंत्रित Polymerization के माध्यम से सप्ताह में तीन घटक फ्लोरोसेंट Glycopolymers की सतही और कुशल तैयारी

Published: June 19, 2015 doi: 10.3791/52922
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1,4
1Department of Biochemistry, University of Missouri, 2Department of Biological Sciences, University of Missouri, 3Department of Molecular Microbiology & Immunology, University of Missouri, 4Department of Child Health, University of Missouri

Abstract

सिंथेटिक glycopolymers विभिन्न जैव रासायनिक और जैव चिकित्सा अनुसंधान के क्षेत्रों में उपयोग किया वाद्य और बहुमुखी उपकरण हैं। प्रतिवर्ती अलावा विखंडन चेन हस्तांतरण का उपयोग अच्छी तरह से नियंत्रित फ्लोरोसेंट सांख्यिकीय glycopolymers का एक सरल और कुशल संश्लेषण का एक उदाहरण (बेड़ा) आधारित polymerization प्रदर्शन किया है। (2-aminoethyl) methacrylamide (AEMA) - संश्लेषण lactobionolactone और एन की प्रतिक्रिया से प्राप्त β-गैलेक्टोज युक्त glycomonomer 2-lactobionamidoethyl methacrylamide की तैयारी के साथ शुरू होता है। 2-Gluconamidoethyl methacrylamide (GAEMA) एक टर्मिनल β-galactoside कमी एक संरचनात्मक अनुरूप के रूप में प्रयोग किया जाता है। (2-hydroxyethyl) स्पेसर के रूप में एक्रिलामाइड, AEMA आगे प्रतिदीप्ति लेबलिंग के लिए लक्ष्य के रूप में, और glycomonomers - एन: निम्न बेड़ा की मध्यस्थता copolymerization प्रतिक्रिया तीन अलग अलग मोनोमर्स शामिल है। जलीय प्रणालियों के सहिष्णु, प्रतिक्रिया में इस्तेमाल किया बेड़ा एजेंट (4-cyanopentanoic एसिड) -4-dithiobenzoate है।कम dispersities (≤1.32), उम्मीद के मुताबिक copolymer रचनाओं, और polymerizations के उच्च reproducibility उत्पादों के बीच मनाया गया। फ्लोरोसेंट पॉलिमर AEMA पर प्राथमिक एमाइन कार्य समूहों को लक्षित Carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर के साथ glycopolymers संशोधित करके प्राप्त कर रहे हैं। जिसके परिणामस्वरूप glycopolymers की Lectin बाध्यकारी specificities के विशिष्ट glycoepitope पहचानने lectins के साथ लेपित इसी agarose मोती के साथ परीक्षण द्वारा सत्यापित कर रहे हैं। के रूप में वांछित क्योंकि संश्लेषण की आसानी के लिए, उत्पाद रचनाओं की तंग नियंत्रण और प्रतिक्रिया का अच्छा reproducibility, इस प्रोटोकॉल, विशिष्ट संरचनाओं और रचनाओं के साथ अन्य बेड़ा आधारित glycopolymers की तैयारी की दिशा में अनुवाद किया जा सकता है।

Introduction

पिछले दो दशकों में, सिंथेटिक glycopolymers साथ जांच मान्यता लेक्टिन 1-3 प्रक्रियाओं पर ध्यान केंद्रित है, जो अनुसंधान शामिल है कि संक्रामक तंत्र की जांच में महत्वपूर्ण क्षमता का प्रदर्शन, धीमी गति से लेकिन लगातार विकास से गुजरा है। Multivalent चीनी moieties रखने सिंथेटिक glycopolymers काफी ज्यादा लेक्टिन बाध्यकारी efficacies का प्रदर्शन के बाद से monovalent कार्बोहाइड्रेट की तुलना में, वे glycobiology क्षेत्र 3 में काफी मांग कर रहे हैं। नैदानिक ​​अनुसंधान के क्षेत्र में विशेष रुचि के मानव श्वसन सेल सतहों और श्लेष्मा ग्लाइकोप्रोटीन पर उपलब्ध कार्बोहाइड्रेट के साथ बंधन लेक्टिन की मध्यस्थता बैक्टीरियल चिह्नित करने के लिए फ्लोरोसेंट glycopolymers का इस्तेमाल होता है। प्रारंभिक इन विट्रो अध्ययन में बैक्टीरिया बाध्यकारी परीक्षण में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध polyacrylamide आधारित glycopolymers कार्यरत हैं। इन जांच के अनेक परिणाम आशाजनक से पता चला है, लेकिन दोनों पीओएल में, obtainability, और बहुत कुछ करने के लिए बहुत कुछ भिन्नताओं के बारे में चिंताओं को उठायाymer आणविक वजन और glycoepitope सामग्री। एक किफायती में प्रयोगशाला प्रोटोकॉल संरचना सामग्री, आकार, और बैक्टीरियल lectins को लक्षित सिंथेटिक glycopolymers की पवित्रता का एक संतोषजनक नियंत्रण के लिए प्रदान करेगा जो विकसित किया गया था।

Glycopolymers करने के लिए एक उपयुक्त सिंथेटिक दृष्टिकोण के लिए खोज में, एक अपेक्षाकृत नए polymerization की तकनीक प्रतिवर्ती अलावा विखंडन श्रृंखला-ट्रांसफर (बेड़ा) एजेंटों 4 कार्यरत कि नियंत्रित कट्टरपंथी polymerization का एक प्रकार का उपयोग कर परीक्षण किया गया था। इस तरह बेड़ा अभिकर्मकों हाल ही में कुछ glycopolymer तैयारियों 5-7 में इस्तेमाल किया गया है। अन्य glycopolymer तैयारी प्रोटोकॉल के साथ तुलना में, बेड़ा की मध्यस्थता polymerizations मोनोमर संरचनाओं और स्थितियों की प्रतिक्रिया, जलीय समाधान के साथ संभावित संगतता, और इच्छित पोलीमेरिक उत्पादों 8,9 की कम आकार dispersity की एक किस्म के लिए सहिष्णुता सहित कई फायदे हैं, प्रदर्शित करता है। उल्लेखनीय ब्याज का बेड़ा-बीए की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल रहे हैंविशिष्ट कार्यों 10-13 हो सकता है, जिनमें से प्रत्येक अलग मोनोमर्स, की रचनाओं के नियंत्रण की अनुमति SED त्रिकोणीय घटक glycopolymers। हालांकि, पिछले अनुसंधान प्रयासों के दोनों सबसे anomeric लटकन कार्बोहाइड्रेट 10 का अभाव है, या कार्यरत अक्सर सहपॉलिमरों हैं जो सांख्यिकीय पॉलिमर से विभिन्न प्रयोजनों की सेवा जो covalently जुड़ा हुआ homopolymers, से मिलकर बनता है कि सप्ताह में तीन ब्लॉक copolymers में जिसके परिणामस्वरूप polymerizations, कदम रखा, जिसमें मोनोमर के अनुक्रम अवशेष एक सांख्यिकीय नियम 9-13 का पालन करें।

हाल ही में, thiocarbonylthio बेड़ा यौगिक रोजगार (4-cyanopentanoic एसिड) एक जलीय वातावरण में -4-dithiobenzoate के एक समूह की तैयारी विशिष्ट लटकन शर्करा और में अपने आवेदन युक्त रैखिक त्रिकोणीय घटक सांख्यिकीय glycopolymers बेड़ा आधारित लेक्टिन की मध्यस्थता बंधन बैक्टीरियल परीक्षण 14 की सूचना मिली थी। एक दृश्य ढंग से प्रस्तुत इस विधि के समग्र लक्ष्य, सप्ताह में तीन घटक को तैयार हैबेड़ा नियंत्रित copolymerization के माध्यम सांख्यिकीय फ्लोरोसेंट glycopolymers। क्योंकि एक कदम polymerization के प्रोटोकॉल की आसानी के पोलिमर, लंबाई और रचनाओं, और प्रतिक्रिया के उच्च reproducibility पर ठीक नियंत्रण, इस प्रोटोकॉल आसानी से वांछित संरचनाओं के साथ glycopolymers के अन्य बेड़ा आधारित संश्लेषण के लिए लागू किया जा सकता है।

Protocol

Glycomonomer 1. संश्लेषण 2-Lactobionamidoethyl Methacrylamide

  1. समाधान सिर्फ बादल छाए रहेंगे बदल जाता है जब तक एक बूंद बुद्धिमान फैशन में पूर्ण इथेनॉल जोड़ने धीरे धीरे निर्जल मेथनॉल के 3.0 मिलीलीटर में lactobionic एसिड के 2 जी भंग और, फिर rotoevaporation के माध्यम से सॉल्वैंट्स को हटा दें।
  2. 3.0 एमएल निर्जल मेथनॉल में और, एक बार फिर, धीरे-धीरे फिर से, बस से बादल छाए रहेंगे, जब तक पूर्ण इथेनॉल जोड़ rotoevaporation के माध्यम से सॉल्वैंट्स लुप्त हो जाना, 1.1 कदम से, छाछ भंग। Lactobiono-1,5-लैक्टोन (1.94 ग्राम, 98% उपज) प्राप्त करने के लिए इस चरण 3 बार दोहराएं। इस उत्पाद को निम्नलिखित प्रतिक्रियाओं में इस्तेमाल किया जा करने के लिए पर्याप्त शुद्धता की है।
  3. एन मेथनॉल के 3.0 मिलीलीटर में lactobionolactone का 1.0 जी जोड़ें - (2-aminoethyl) methacrylamide (AEMA, 0.58 ग्राम) और उदकुनैन monomethyl आकाश (MEHQ, 1.0 मिलीग्राम), स्व-polymerization के एक अवरोध करनेवाला, में 2.0 मेथनॉल की मिलीलीटर, पीछा triethylamine की 1.0 मिलीलीटर से। 48 घंटे के लिए आरटी पर हिलाओ।
  4. विआयनीकृत एच 2 ओ के 20 मिलीलीटर (DH 2 जोड़ें
  5. MEHQ की 1.0 मिलीग्राम से युक्त एक प्राप्त बीकर में - (फार्म, 10 मिमी x 20 मिमी ओह) DH 2 हे के 20 मिली, तो एक आयनों विनिमय कॉलम के माध्यम से जलीय घोल पारित जोड़ने के लिए, किसी भी शेष lactobionic एसिड को दूर करने के लिए।
  6. Rotoevaporation के माध्यम से सूखापन के लिए वाष्पन द्वारा, 1.5 चरण में उत्पादित triethylamine, निकालें।
  7. DH 2 हे के 20 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे धीरे प्रतिक्रियाशील सामग्री detectable हैं कोई ninhydrin तक कटियन विनिमय राल (एच + प्रपत्र) के 1 मिलीग्राम aliquots जोड़कर unreacted AEMA हटा दें। फिर इथेनॉल समाधान में एक 2% ninhydrin के साथ थाली छिड़काव, एक पतली परत क्रोमैटोग्राफी थाली करने के लिए इसे लागू करने, प्रत्येक राल के बाद इसके अलावा समाधान के 1 μl aliquots लेने से हटाने की निगरानी करें। कोई गहरे नीले रंग की थाली 1 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाता है जब विकसित करने के लिए मनाया जाता है, अंत बिंदु पर पहुंच गया है।
  8. फिर ठंडे निर्जल एसीटोन जोड़ने, मेथनॉल (~ 0.5 मिलीलीटर) की एक न्यूनतम राशि में फ्रीज सूखे सामग्री भंग करके नमूना से MEHQ निकालें (-20 सी, 15 मिलीलीटर °) उत्पाद वेग। फिर से एक सफेद पाउडर (0.94 ग्राम, 68% उपज) के रूप में 2-lactobionamidoethyl methacrylamide (LAEMA) प्राप्त करने के लिए वैक्यूम के तहत एक desiccator में वेग से सूखे, एक fritted कांच चिमनी का उपयोग निस्पंदन द्वारा वेग लीजिए। इस उत्पाद को निम्नलिखित प्रतिक्रियाओं में इस्तेमाल किया जा करने के लिए पर्याप्त शुद्धता की है।

Monomer के 2. संश्लेषण 2-Gluconamidoethyl Methacrylamide

ध्यान दें: एक लटकन चीनी अधिकारी नहीं है जो 2-gluconamidoethyl methacrylamide की तैयारी (GAEMA), एक प्रकाशित विधि 15 से अनुकूलित किया गया था।

  1. एक समाधान के लिए मेथनॉल के 10 एमएल में भंग AEMA का 2.0 जी जोड़ेंसरगर्मी के साथ मेथनॉल के 30 मिलीलीटर में डी-gluconolactone (1.6 ग्राम) और, की, धीरे धीरे triethylamine के 1.6 मिलीलीटर जोड़ने।
  2. 24 घंटे के लिए आरटी पर प्रतिक्रिया हिलाओ।
  3. तब शुष्क एसीटोन के 10 एमएल के साथ धोने, एक fritted कांच चिमनी का उपयोग कर उपजी उत्पाद फ़िल्टर और वेग isopropanol के 10 मिलीलीटर प्रत्येक के साथ तीन बार कुल्ला। वैक्यूम के तहत एक desiccator में उपजी उत्पाद सूखी।

3. बेड़ा Glycopolymer संश्लेषण

  1. वाणिज्यिक एन में उपस्थित अवरोध करनेवाला MEHQ को दूर करने के लिए - (2-hydroxyethyl) एक्रिलामाइड (HEAA), एल्यूमीनियम ऑक्साइड नैनोकणों के 0.5 ग्राम जोड़ने के बाद 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब, के लिए HEAA के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 30 सेकंड के लिए 300 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र, और निम्नलिखित प्रतिक्रिया में शीर्ष परत HEAA का उपयोग करें।
  2. ध्यान से LAEMA के 32.8 मिलीग्राम (70.0 μmol), AEMA की 1.7 मिलीग्राम (10.5 μmol) और HEAA (270 μmol) की 27.5 μl जोड़ने के लिए, सभी प्रकार, एक अच्छी तरह से साफ 1 मिलीलीटर Schlenk ट्यूब, DH 2 ओ के 0.4 मिलीलीटर में भंग एक monom होने: 3: 77, 20 के एर दाढ़ अनुपात।
  3. एक समानांतर प्रतिक्रिया में, 3.2 कदम में LAEMA का उपयोग करने के एवज में किसी भी लटकन चीनी के पास नहीं है कि नियंत्रण पॉलिमर, उत्पादन प्रतिक्रिया में GAEMA के 21.4 मिलीग्राम (70.0 μmol) स्थानापन्न के क्रम में।
  4. संबंधित Schlenk ट्यूब (यानी, 3.2 या 3.3) के लिए, क्रमिक रूप से DMF के 250 माइक्रोग्राम से युक्त (4-cyanopentanoic एसिड) -4-dithiobenzoate (1.9 μmol, बेड़ा एजेंट) की 0.53 मिलीग्राम, और DMF के 50 μl युक्त के 50 μl जोड़ने 4,4'-azobis- (4-cyanovaleric एसिड) (0.9 μmol, सर्जक)। धीरे उंगली दोहन द्वारा मिश्रण।
  5. Schlenk ट्यूब में निहित सामग्री को एक सूखी बर्फ रोजगार रुक: इथेनॉल स्नान (100 मिलीलीटर इथेनॉल में 75 जी सूखी बर्फ), 10-50 mTorr के भीतर करने के लिए एक निर्वात लागू होते हैं, तो Schlenk वाल्व को बंद करें और धीरे-धीरे आरटी के लिए पिघलना करने के लिए समाधान की अनुमति । दो बार इस फ्रीज खाली पिघलना चक्र को दोहराएँ। सभी अभिकर्मकों पिछले पिघलना के बाद भंग कर रहे हैं सुनिश्चित करें।
  6. एक sealable प्लास्टिक बीए में Schlenk ट्यूब रखेंजी, बैग की हवा खाली, और फिर इसे सील। 70 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ देते हैं एक पानी के स्नान के लिए Schlenk ट्यूब युक्त बैग स्थानांतरण और 24 घंटे के लिए सेते हैं।
  7. ध्यान से एक तैयार डायलिसिस बैग (= 3500 MWCO) को Schlenk ट्यूब में हल हस्तांतरण, और पहले 8 घंटे के लिए DH 2 हे हर एक घंटे में बदल रहा है, 24 घंटे के लिए DH 2 ओ (10 एक्स 2 एल) के खिलाफ dialyze। डायलिसिस के बाद, एक टेस्ट ट्यूब को डायलिसिस टयूबिंग से नमूना हस्तांतरण -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूना फ्रीज, और फिर इसे lyophilize।

नोट: परिणामी सांख्यिकीय पाली methacrylamide / एक्रिलामाइड (पीएमए) लटकन या (3.3 कदम से) डी gluconamide (चरण में 3.2 से) 4- हे -β-डी-galactopyranosyl-डी-gluconamide (lactobionamide) युक्त सहपॉलिमरों, क्रमशः रहे हैं प्राप्त की। चर्चा की सुविधा के लिए, इन दो glycopolymers क्रमशः पीएमए-LAEMA और पीएमए-GAEMA, संक्षिप्त रूप में कर रहे हैं।

Fluorophores साथ Glycopolymers 4. उत्तर-संशोधन

  • क्रमशः, फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस, 0.1 एम सोडियम फास्फेट, 0.15 एम NaCl, पीएच 7.5) के 0.9 मिलीलीटर में प्राथमिक एमाइन कार्य समूहों की ~ 0.9 μmole युक्त glycopolymer पीएमए-LAEMA या PMA-GAEMA की 5.0 मिलीग्राम भंग।
  • धीरे-धीरे तेजी से सरगर्मी के साथ समाधान करने के लिए DMF के 100 μl में Carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर की 0.6 मिलीग्राम जोड़ें। धीरे आरटी पर अंधेरे में 16 घंटे के लिए प्रतिक्रियाओं हलचल।
  • प्रकाश से रक्षा करते हैं, एक तैयार डायलिसिस टयूबिंग (MWCO = 3500) में नमूना लोड और पहले 8 घंटे के लिए डायलिसिस समाधान हर घंटे बदल रहा है, 16 घंटे के लिए DH 2 ओ (एल 2) के खिलाफ dialyze। डायलिसिस के बाद, एक टेस्ट ट्यूब को डायलिसिस टयूबिंग से नमूना हस्तांतरण -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूना फ्रीज, और फिर इसे lyophilize।

    • नोट: lyophilization के बाद, फ्लोरोसेंट glycopolymers पीएमए-LAEMA-Fluorescein और पीएमए-GAEMA-Fluorescein, क्रमश: प्राप्त कर रहे हैं।

    Gly 5. विशेषतासहपॉलिमरों

    1. संख्या औसत आणविक वजन (एम एन), वजन औसत आणविक वजन (एम डब्ल्यू) और जेल पारगमन क्रोमैटोग्राफी (जीपीसी) सॉफ्टवेयर, एक जीपीसी से लैस एक वाणिज्यिक HPLC प्रणाली पर glycopolymers की dispersity (एम डब्ल्यू / एम एन) का निर्धारण 0.6 मिलीग्राम / मिनट 14 के प्रवाह की दर पर eluent के रूप में 0.1 एम Tris / 0.1 एम सोडियम क्लोराइड बफर (पीएच 7) का उपयोग ब्याज की आणविक वजन, और एक अपवर्तनांक डिटेक्टर, के लिए उपयुक्त स्तंभ। (: 200-1,200,000 जी / मोल मेगावाट) आणविक भार मानकों के रूप में पॉलीथीन ग्लाइकोल मानकों का प्रयोग करें।
    2. Glycopolymers 16 के भीतर प्राथमिक एमाइन कार्य समूहों की वास्तविक सांद्रता यों। एक प्रकाशित विधि 17 के अनुसार संश्लेषित glycopolymers की कुल कार्बोहाइड्रेट सामग्री का विश्लेषण करें।
    3. , GAEMA और glycopolymers पीएमए-LAEMA, पीएमए-GAEMA एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी 14 डी ओ 2 में संरचनात्मक संरचना और glycomonomers LAEMA की शुद्धता का परीक्षण प्रदर्शन।

    साथ सिंथेटिक Glycopolymers 6. बाध्यकारी टेस्ट agarose मोती Lectin में लिपटे

    1. 1 मिनट के लिए 300 XG पर Erythrina शिखा-गली लेक्टिन (ईसीएल) लिपटे agarose मोती के निलंबन, अपकेंद्रित्र के 50 μl पीबीएस के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें, और ध्यान हटाने के लिए और सतह पर तैरनेवाला के निपटान के। दो बार इस चरण को दोहराएँ, और फिर पीबीएस के 0.5 मिलीलीटर में मोती resuspend।
    2. 1 घंटे के लिए आरटी पर, अंधेरे में, जोड़ें 3 पीएमए-LAEMA-Fluorescein या मोती निलंबन पीबीएस के 6 μl में पीएमए-GAEMA-Fluorescein (नकारात्मक नियंत्रण) के माइक्रोग्राम, और मिश्रण सेते हैं।
    3. पीबीएस के 0.2 मिलीलीटर में पीबीएस में तीन बार, और resuspend मोतियों की 1.5 मिलीलीटर के साथ मिश्रण धो लें। (उत्तेजना तरंगदैर्ध्य (Teflon में लिपटे) एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस खुर्दबीन स्लाइड पर एक कुएं में एक विभाज्य (4 μl) लोड एक कवर पर्ची के साथ कवर, और एक FITC फिल्टर का उपयोग कर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा निरीक्षण: 467-498 एनएम, उत्सर्जन वेवलेंथ: 513- 566 एनएम) और एक 10x उद्देश्य टी के बंधन जांच करने के लिएवह मोती के साथ 14 glycopolymers फ्लोरोसेंट।

    Representative Results

    Glycomonomer का संश्लेषण

    Lactobionic एसिड glycomonomers की तैयारी के लिए एक उदाहरण के रूप में इस के साथ साथ इस्तेमाल किया गया था। LAEMA 11 के संश्लेषण पर प्रारंभिक रिपोर्ट में विधियों का प्रयोग, असंतोषजनक पवित्रता के साथ तैयारी में विभिन्न पैदावार मनाया गया। कटियन और आयनों विनिमय रेजिन का उपयोग कर संशोधित शोधन विधि 1 एच और 13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी (चित्रा 1) द्वारा पुष्टि की है, जो स्थिर उत्पाद उपज और उच्च शुद्धता की पेशकश की unreacted सामग्री शुरू, हटाने के लिए।

    बेड़ा glycopolymer संश्लेषण और fluorophores के साथ glycopolymers के बाद संशोधन

    कदम रखा बेड़ा polymerizations के माध्यम से तैयार ब्लॉक glycopolymers के विपरीत, इस एक कदम copolymerization प्रोटोकॉल बहुलक रीढ़ भर में एक समान glycomonomer वितरण प्रदान करता है। यहाँ दिखाए गए glycopolymers जीएल 20 मोल% होते हैंycomonomer, एक स्पेसर के रूप में HEAA के 77 मोल%, और बाद संशोधनों (चित्र 2 देखें)। 1 एच और 13 सी-एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए एक लक्ष्य के रूप में AEMA के 3 मोल% पीएमए-LAEMA और पीएमए-GAEMA के ढांचे की पुष्टि की (आंकड़े 3 और 4)। चित्रा 5 में दिखाया गया है, बेड़ा बिना संश्लेषित glycopolymer की जीपीसी क्षालन प्रोफाइल के खिलाफ साजिश रची है, जब पीएमए-LAEMA और पीएमए-GAEMA दोनों बेड़ा दृष्टिकोण की प्रभावकारिता साबित कम dispersities है। जैसी कि उम्मीद थी, पीएमए-GAEMA की वजह से एक लटकन चीनी के पीएमए-GAEMA की कमी के पीएमए-LAEMA की तुलना एन छोटे एक मीटर है। कार्बोहाइड्रेट और बेड़ा glycopolymers की सामग्री प्राथमिक एमाइन कार्य समूहों का विश्लेषण उत्पाद glycopolymers में monomers के अनुपात बेड़ा की मध्यस्थता polymerization प्रतिक्रिया (1 टेबल) में कार्यरत मोनोमर्स शुरू करने की stoichiometric अनुपात के साथ संगत है कि पता चला। इस मोनोमर compositio के एक तंग नियंत्रण का प्रतीकएनएस संश्लेषित glycopolymers में, डिजाइन के रूप में।

    सक्रिय fluorophores के साथ प्राथमिक एमाइन कार्य समूहों का रिएक्शन प्रोटीन लेबलिंग में एक व्यापक रूप से इस्तेमाल की तकनीक है। इस तकनीक Carboxyfluorescein साथ शुद्ध glycopolymers लेबल करने के लिए यहां कार्यरत था। बाद के संशोधन के बाद, फ्लोरोसेंट पॉलिमर (चित्रा 6) प्राप्त किया गया। प्रतिक्रिया में fluorescein लेबल पॉलिमर की कोई गिरावट जीपीसी विश्लेषण से पता चला था (डेटा) नहीं दिखाया।

    लेक्टिन में लिपटे agarose मोती के साथ सिंथेटिक glycopolymers का परीक्षण बंधन

    प्रयोगों में कार्यरत संश्लेषित glycopolymers की लेक्टिन बाध्यकारी विशिष्टता का आकलन करने के लिए, ज्ञात कार्बोहाइड्रेट बाध्यकारी विशिष्टता के साथ लेक्टिन-लेपित agarose मोती इस्तेमाल किया गया था। Erythrina शिखा-गली लेक्टिन (ईसीएल), β-डी-galactoside की दिशा में एक बाध्यकारी विशिष्टता है। चित्रा 7A स्पष्ट है कि पीएमए-LAEMA-FL दर्शाताएक लटकन कार्बोहाइड्रेट के रूप में β-डी-galactoside शामिल है जो uorescein, ईसीएल लेक्टिन के साथ बंधन मजबूत प्रदर्शन किया। इसके विपरीत, एक लाकेट चीनी अधिकारी नहीं है जो glycopolymer पीएमए-GAEMA-Fluorescein के ईसीएल के लिए बाध्य नकारात्मक, चित्रा 7B में दिखाया गया है। इस परिणाम संश्लेषित फ्लोरोसेंट glycopolymer के बंधन प्रभावशीलता और आत्मीयता एक मिसाल है।

    चित्र 1
    निरुपित चित्रा 1. 1 एच (क) और LAEMA के लिए 13 सी-एनएमआर (ख) स्पेक्ट्रा (डी ओ 2)। (यह आंकड़ा वांग से संशोधित किया गया है एट अल। 14) इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें आंकड़ा।

    <रख-together.within-पेज = "हमेशा">: के लिए पी वर्ग = "jove_content" चित्र 2
    चित्रा 2. लटकन चीनी के रूप में β-galactoside युक्त फ्लोरोसेंट glycopolymer पीएमए-LAEMA के संश्लेषण के योजनाबद्ध चित्र। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र तीन
    1 एच (ए) और 13 सी-एनएमआर पीएमए-LAEMA glycopolymer के लिए (बी) के स्पेक्ट्रा (डी ओ 2)। (यह आंकड़ा वांग से संशोधित किया गया है एट अल। 14) निरुपित चित्रा 3. प्लीएसई इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 4
    निरुपित चित्रा 4. 1 एच (ए) और 13 सी-एनएमआर पीएमए-GAEMA के लिए (बी) के स्पेक्ट्रा (डी ओ 2)। (यह आंकड़ा वांग से संशोधित किया गया है एट अल। 14) एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े की।

    चित्रा 5
    बेड़ा आधारित पीएमए-GAEMA और पीएमए-LAEMA चित्रा 5. जेल पारगमन क्रोमैटोग्राफी निशान के साथ और बेड़ा एजेंट का उपयोग किए बिना तैयार किया। बेड़ा एजेंट (नीला) के बिना तैयार पीएमए-LAEMA, RAFT- के विपरीत आधारित पीएमए-LAEMA (हरा) (एम एम एन / डब्ल्यू) एक बहुत कम dispersity है। बेड़ा आधारित पीएमए-GAEMA (लाल) और पीएमए-LAEMA समान जीपीसी प्रोफाइल है, लेकिन पूर्व की वजह से किसी भी लटकन शर्करा के अभाव के एक छोटे एम एन की है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 6
    पहले और फ्लोरोफोरे के साथ पोस्ट-संशोधन के बाद चित्रा 6 पीएमए-LAEMA। (ए) सफेद गैर लेबल glycopolymer (बाएं ट्यूब) के साथ तुलना में, fluorescein लेबल पीएमए-LAEMA एक मजबूत पीले रंग (दाएं ट्यूब) से पता चलता है। यूवी, गैर लेबल पीएमए-LAEMA (पीबीएस में छोड़ दिया ट्यूब, 1 मिलीग्राम / एमएल) के तहत (बी) fluorescein लेबल पीएमए-LAEMA जबकि (पीबीएस में सही ट्यूब, 1 मिलीग्राम / एमएल) से पता चलता है अंधेरा है और कोई प्रतिदीप्ति के साथ प्रस्तुत करता है मजबूत हरी प्रतिदीप्ति।: //www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 7
    चित्रा 7. Erythrina शिखा-गली लेक्टिन (ईसीएल) लिपटे agarose मोती glycopolymers युक्त β-डी-galactoside बाँध, और नहीं एक लटकन चीनी रखने नहीं उन। (ए) पीएमए-LAEMA-Fluorescein (3 माइक्रोग्राम) ईसीएल के साथ बंधन मजबूत प्रदर्शन नहीं, नहीं, लटकन β-डी-galactoside अवशेषों के पास जो (बी) पीएमए-GAEMA-Fluorescein, में जबकि, कोई लेक्टिन लिपटे मोतियों के साथ बंधन से पता चला है। स्केल बार = 100 माइक्रोन।

    तालिका 1. लक्ष्य निर्धारण सिंथेटिक मापदंडों और glycopolymers की वास्तविक रचनाओं के मूल्यों। एक) मूल्यों का लक्ष्य निर्धारण, मूल्यों है किउत्पादों के वांछित हैं; ख) डी पी, polymerization की डिग्री; ग) एनए, उपलब्ध नहीं है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    डी पी बी Dispersity Glycomonomers के वास्तविक सामग्री
    मोल%     		प्राथमिक एमाइन के वास्तविक सामग्री
    मोल%
    मूल्यों का लक्ष्य निर्धारण 100 <1.3 20 3
    पीएमए-LAEMA 99 1.26 19 3.2
    पीएमए-GAEMA 89 1.32 एनए ग 2.7

    Discussion

    एक सरल और कुशल के साथ और एक लटकन कार्बोहाइड्रेट के बिना बेड़ा आधारित त्रि-घटक फ्लोरोसेंट glycopolymers, के लिए प्रोटोकॉल, और एक लेक्टिन बाध्यकारी परीक्षण में उनके उपयोग, इस रिपोर्ट में प्रदर्शन किया है। प्रोटोकॉल glycomonomers LAEMA और GAEMA की तैयारी के साथ शुरू होता है। एक एक कदम बेड़ा नियंत्रित copolymerization के माध्यम से, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य उपज, उम्मीद के मुताबिक मोनोमर संरचना और कम dispersity साथ glycopolymers प्राप्त कर रहे हैं। Carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर के साथ glycopolymers के बाद के संशोधन के बाद, जिसके परिणामस्वरूप संबंधित फ्लोरोसेंट लेबल glycopolymer के बंधन में अपनी लेक्टिन बाध्यकारी विशिष्टता के लिए आसानी से परीक्षण योग्य है।

    बाद में glycopolymer संश्लेषण में नियोजित किया जा करने के लिए कर रहे हैं कि glycomonomers की प्रारंभिक प्रारंभिक चरणों में, आसानी से उपलब्ध lactobionic एसिड और gluconolactone उपयोग किया गया। सिद्धांत रूप में, जटिल oligosaccharides को मोनोसैक्राइडों से ब्याज की किसी भी कार्बोहाइड्रेट, converte किया जा सकता हैग्लूकोज की C6 पर प्राथमिक हाइड्रॉक्सिल समूह पर लक्ष्य चीनी conjugating द्वारा glycomonomers डी। को कम ग्लूकोज अवशेषों के ऑक्सीकरण, और एक लैक्टोन करने के लिए इसके बाद के निर्जलीकरण के बाद, उत्पाद तो आसानी से हो सकता है इसी glycomonomer के लिए फार्म AEMA पर प्राथमिक एमाइन के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की। इस मार्ग के आगे उदाहरण हाल ही में एक रिपोर्ट 14 में देखा जा सकता है। यह किसी भी polymerization के कदम की शुरुआत से पहले, MEHQ, एक शक्तिशाली polymerization के अवरोध करनेवाला, उपयोग करने के लिए बस से पहले सभी monomer और glycomonomer तैयारियों से हटा दिया जाना चाहिए कि ध्यान दिया जाना चाहिए। यह आसानी से MEHQ तो तुरंत उच्च उपज में अवरोध करनेवाला से मुक्त उत्पाद वेग -20 डिग्री सेल्सियस पर एसीटोन के साथ इलाज के पास है कि glycomonomer भंग करने के लिए मेथनॉल की न्यूनतम राशि का उपयोग करके पूरा किया है।

    किसी भी कट्टरपंथी polymerization योजना में आवश्यक, विस्तार और मोनोमर purities के लिए ध्यान पर जोर दिया जाता है। एक बेड़ा polymerization की प्रणाली की खासियत है के रूप में, यह के होते हैंएक कट्टरपंथी स्रोत, एक बेड़ा अभिकर्मक, एक monomer और विलायक। इस कल्पना की प्रस्तुति में, एक एकल कदम बेड़ा polymerization की प्रणाली एक जलीय घोल में तीन अलग-अलग मोनोमर्स रखने प्रतिक्रिया मिश्रण से उत्पन्न सांख्यिकीय सहपॉलिमरों के उत्पादन पर केंद्रित है कि वर्णित है। दो अलग-अलग बेड़ा की मध्यस्थता प्रतिक्रियाओं से एक एक लटकन पास है कि एक glycomonomer का इस्तेमाल करता है जो में प्रस्तुत कर रहे हैं, कोई बाध्य कार्बोहाइड्रेट अवशेषों के साथ एक पोलिओल रखने, कार्बोहाइड्रेट टर्मिनस (यानी, β-डी-गैलेक्टोज), और अन्य गैर को कम करने। दोनों बेड़ा की मध्यस्थता प्रतिक्रियाओं के लिए आम एक स्पेसर अणु के रूप में कार्य करता है कि एक विलक्षण हाइड्रॉक्सिल समूह रखने मोनोमर्स थे, और एक और एक एमिनो प्रतिक्रियाशील फ्लोरोफोरे के साथ पोस्ट-संशोधन के लिए एक नि: शुल्क एमाइन रखने।

    प्रतिक्रिया मिश्रण और वातावरण में ऑक्सीजन की उपस्थिति के बाद से बेड़ा की मध्यस्थता polymerization के लिए हानिकारक है, के स्तर का पता लगाने के लिए अपने हटाने आसानी से कई फ्रीज ईवा के माध्यम से पूरा किया हैcuate पिघलना चक्र उच्च वैक्यूम के तहत Schlenk ट्यूब प्रतिक्रिया पोत को बनाए रखने।

    यह जरूरत के रूप में प्रतिक्रिया में अलग monomers के दाढ़ अनुपात समायोजित किया जा सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। इसके अलावा, इस्तेमाल किया बेड़ा एजेंट की राशि अलग से है, जिसके परिणामस्वरूप पॉलिमर की लंबाई 18 से नियंत्रित किया जा सकता है। हालांकि, सर्जक को बेड़ा एजेंट की दाढ़ अनुपात हमेशा उत्पाद की कम dispersity आश्वस्त करने के लिए दो से अधिक होना चाहिए। इन शर्तों के तहत, copolymerization के विकास स्थिर है, और प्रतिक्रिया के reproducibility बहुत अधिक है। यही कारण है कि यह एक कारण उनके अलग polymerization की गति के लिए, एक सांख्यिकीय copolymer के भीतर भाग लेने वाले सभी monomers के पूरी तरह से एक समान वितरण प्राप्त संभावना नहीं है कि कहा जा रहा है। बहुलक के भीतर विभिन्न monomers के वितरण निस्र्पक अभी भी बहुत चुनौतीपूर्ण है।

    बाद के संशोधन विधि, यहाँ प्रस्तुत, दोनों सरल और अधिक amenabl हैलेबल glycopolymers 2,11 करने के लिए लागू अन्य प्रोटोकॉल की तुलना में फ्लोरोसेंट लेबल की एक व्यापक चयन का उपयोग करने के लिए ई,। ये पानी में घुलनशील एमाइन प्रतिक्रियाशील fluorophores के कई क्वांटम डॉट्स, biotins, और दूसरों को भी शामिल होगा। संश्लेषित, लेबल glycopolymers के बंधन में specificities आसानी से निरीक्षण जाना जाता बंधन समानताएं साथ lectins उपयोग कर रहे हैं। कोई लटकन चीनी रखने पीएमए-GAEMA एक उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण है। इस मार्ग के माध्यम से तैयार विभिन्न फ्लोरोसेंट लेबल के साथ Glycopolymers सफलतापूर्वक लेक्टिन की मध्यस्थता बैक्टीरियल 14 बंधन की जांच में इस्तेमाल किया गया है। प्रस्तुत हैं, सांख्यिकीय फ्लोरोसेंट glycopolymers की इस सरल और कुशल तैयारी glycobiological अनुसंधान के एक विस्तृत विविधता के लिए महान क्षमता प्रदान करना चाहिए।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagent
    Lactobionic acid Sigma-Aldrich 153516
    D-Gluconolactone  Sigma-Aldrich G2164
    N-(2-hydroxyethyl) acrylamide (HEAA) Sigma-Aldrich 697931
    Orange II sodium salt Sigma-Aldrich O8126
    Hydroquinone monomethyl ether (MEHQ) Sigma-Aldrich 54050 Polymerization inhibitor
    N-(2-aminoethyl) methacrylamide hydrochloride (AEMA) Polysciences, Inc 24833-5
    Triethylamine Fisher Scientific BP-616
    Anion-exchange resin IRN-78 hydroxide-form, 80 mesh Sigma-Aldrich 10343-U
    Cation-exchange resin 50Wx8, 200 mesh Sigma-Aldrich 217514
    Aluminum oxide, ~150 mesh  Sigma-Aldrich A1522 Type WN-6, Neutral, Activity Grade Super I
    Ninhydrin Sigma-Aldrich N4876 An ethanol solution of 0.2% ninhydrin was used in the test
    4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic acid Sigma-Aldrich 722995 RAFT agent
    4,4′-Azobis(4-cyanovaleric acid) Sigma-Aldrich 11588 Polymerization initiator
    Carboxyfluorescein succinimidyl ester  Life Technologies C1157
    Erythrina Cristagalli lectin coated agarose bead Vector Laboratories AL-1143 
    Solvent
    dH2O Produced by Barnstead water purification system, 18 megOhm-cm
    Isopropanol Fisher Scientific A461-4 ACS grade or better
    Methanol Fisher Scientific A454-4 ACS grade or better
    Absolute ethanol Fisher Scientific BP2818-100 ACS grade or better
    Dimethylformamide Sigma-Aldrich 22705 ACS grade or better
    Acetone Fisher Scientific A929-4 ACS grade or better
    Equipment
    Dialysis membrane (MWCO: 3,500) Spectrum Labs 132720
    Polyethylene glycol analytical standard standard Sigma-Aldrich O2393
    Schlenk tube, 1 ml Quark Glass Customized
    TSK-GEL G4000 PWxl  Tosoh Bioscience  8022 Used for GPC analysis of the glycopolymers
    Empower 3 with GPC/SEC package Waters Corporation
    Waters Alliance HPLC system  Waters Corporation Equipped with refractive index detector (Waters 2414) and fluorescence detector (Waters 2475)
    Avance III 800 MHz NMR Spectrometer Bruker Corporation
    BX43 fluorescence microscope Olympus Corporation Used with FITC filter in the glycopolymer binding test
    Rotavap / Rotoevaporator Heidolph
    Fritted disc funnel Fisher Scientific 10-310-109
    Lyophilizer Labconco
    Immunofluorescence microscope slide Polysciences 18357-1
    Revco Ultima Plus -80 °C Freezer Thermo Scientific
    Plastic Vacuum Bag and Hand Pump Ziploc
    Vacuum Pump, Direct Drive, Maxima C Plus Fisher Scientific
    Vacuum Gauge Sargent-Welch

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    References

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    Wang, W., Lester, J. M., Amorosa, A. … More

    Wang, W., Lester, J. M., Amorosa, A. E., Chance, D. L., Mossine, V. V., Mawhinney, T. P. Facile and Efficient Preparation of Tri-component Fluorescent Glycopolymers via RAFT-controlled Polymerization. J. Vis. Exp. (100), e52922, doi:10.3791/52922 (2015).

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