An efficient, three-step synthesis of RAFT-based fluorescent glycopolymers, consisting of glycomonomer preparation, copolymerization, and post-modification, is demonstrated. This protocol can be used to prepare RAFT-based statistical glycopolymers with desired structures.
Syntetiske glycopolymers er instrumentale og alsidige værktøjer, der anvendes i forskellige biokemiske og biomedicinske forskningsområder. Et eksempel på en let og effektiv syntese af velkontrollerede fluorescerende statistiske glycopolymers igennem reversibel tilsætning-fragmentering kæde-overførsel (RAFT) -baseret polymerisation påvises. Syntesen begynder med fremstillingen af β-galactose-holdige glycomonomer 2-lactobionamidoethyl methacrylamid fremstillet ved reaktion mellem lactobionolactone og N – (2-aminoethyl) methacrylamid (AEMA). 2-Gluconamidoethyl methacrylamid (GAEMA) anvendes som en strukturel analog mangler en terminal β-galactosid. Følgende RAFT-medieret copolymerisationsreaktion omfatter tre forskellige monomerer: N – (2-hydroxyethyl) acrylamid som afstandsstykke, AEMA som mål for yderligere mærkning fluorescens, og glycomonomers. Tolerant over vandige systemer, raft middel anvendt i reaktionen, er (4-cyanpentansyre) -4-dithiobenzoate.Lave dispersities (≤1.32), forudsigelige copolymersammensætninger og høj reproducerbarhed af polymerisationerne blev observeret blandt de produkter. Fluorescerende polymerer opnås ved at modificere glycopolymers med carboxyfluorescein succinimidylester målretning den primære amin funktionelle grupper på AEMA. Lectin-bindende særlige forhold de resulterende glycopolymers verificeres ved at teste med tilsvarende agaroseperler belagt med specifikke glycoepitope genkende lektiner. På grund af den lette syntesen, den stramme kontrol af produktets sammensætninger og den gode reproducerbarhed af reaktionen denne protokol kan oversættes hen imod fremstilling af andre raft-baserede glycopolymers med specifikke strukturer og sammensætninger, som ønsket.
I de seneste to årtier har undersøgelser med syntetiske glycopolymers gennemgået langsom men konstant udvikling, hvilket viser et betydeligt potentiale i at undersøge smitsomme mekanismer, der omfatter forskning, der fokuserer på lectin anerkendelse processer 1-3. Eftersom syntetiske glycopolymers besidder multivalente sukkergrupper udviser meget højere lectin-bindende effektiviteter sammenlignet med monovalente kulhydrater, er de af stor efterspørgsel i glycobiology felt 3. Af særlig interesse i den kliniske forskning er brugen af fluorescerende glycopolymers at karakterisere lectin-medierede bakteriel binding med kulhydrater rådighed på humane respiratoriske celleoverflader og slim glycoprotein. Tidligt i vitro studier beskæftiget kommercielt tilgængelige polyacrylamid-baserede glycopolymers i bakterielle bindende tests. Flere af disse prober viste lovende resultater, men udtrykt bekymring med hensyn til, anskaffe, og meget-til-masse afvigelser i både polYmer molekylvægt og glycoepitope indhold. En økonomisk in-laboratoriet protokol blev udviklet som vil give en tilfredsstillende styring af indhold struktur, størrelse og renhed af syntetiske glycopolymers målrettet bakterielle lektiner.
På jagt efter en egnet syntetisk tilgang til glycopolymers blev en forholdsvis ny polymerisationsteknik testet ved hjælp af en form for kontrolleret radikalpolymerisation der ansat reversibel tilføjelse-fragmentering kæde-transfer (Raft) agenter 4. Sådanne raft reagenser er for nylig blevet anvendt i et par glycopolymer præparater 5-7. Sammenlignet med andre glycopolymer forberedelse protokoller, raft-medierede polymerisationer påvise adskillige fordele, herunder tolerance over for en række forskellige monomere strukturer og reaktionsbetingelser, potentiel kompatibilitet med vandige opløsninger, og lav størrelse dispersitet de ønskede polymere produkter 8,9. Af bemærkelsesværdige interesse er protokoller for udarbejdelse af RAFT-baSED tri-komponent glycopolymers, hvilket tillader kontrol af sammensætninger af forskellige monomerer, som hver især kan have særskilte funktioner 10-13. Men de fleste af de tidligere forskning bestræbelser enten manglede anomere vedhæng carbohydrater 10 eller ansat forskydninger polymerisationer resulterede i tri-blokcopolymerer, der består af kovalent bundne homopolymerer, som ofte tjener forskellige formål end statistiske polymerer, som er copolymerer, hvori sekvensen af monomer rester følge en statistisk regel 9-13.
Nylig, anvendelse af den thiocarbonylthio RAFT forbindelse (4-cyanpentansyre) -4-dithiobenzoate i et vandigt miljø, fremstilling af en gruppe af RAFT-baserede lineære tri-komponent statistiske glycopolymers indeholdende specifikke vedhæng sukkerarter og deres anvendelse i lectin-medieret bakteriel binding tests blev rapporteret 14. Det overordnede mål med denne metode, præsenteres på en visuel måde, er at forberede tri-komponentstatistiske fluorescerende glycopolymers via RAFT-kontrollerede copolymerisation. Grund af den lethed af en-trins polymerisation protokollen, fin kontrol over polymerlængde og sammensætninger, og den høje reproducerbarhed af reaktionen denne protokol kan let anvendes på andre raft-baserede synteser af glycopolymers med ønskede strukturer.
En letkøbt og effektiv protokol for RAFT-baserede tri-komponent fluorescerende glycopolymers, med og uden et vedhæng kulhydrat, og deres anvendelse i en lektin-bindende test, er påvist i denne rapport. Protokollen starter med udarbejdelse af glycomonomers LAEMA og GAEMA. Gennem en ettrins RAFT-kontrollerede copolymerisation, glycopolymers med reproducerbar udbytte forudsigelig monomersammensætning og lav dispersitet, opnås. Efter post-modifikation af glycopolymers med carboxyfluorescein succinimidylester, bindingen af den resulterende respektive fluorescensmærket glycopolymer er let testes for sin lectin-bindingsspecificitet.
I de indledende fremstillingstrin for glycomonomers, der skal anvendes i de efterfølgende glycopolymer synteser blev let tilgængelige lactobionsyre og gluconolacton udnyttet. I teorien, nogen kulhydrater af interesse, fra monosaccharider til komplekse oligosaccharider, kan være converted til glycomonomers ved konjugering målet sukker på den primære hydroxylgruppe på C6 af glucose. Efter oxidation af den reducerende glucose-rest, og den efterfølgende dehydratisering til en lacton, kan produktet derefter let omsættes med den primære amin på AEMA at danne den tilsvarende glycomonomer. Kan ses Yderligere eksempler på denne rute i en nylig rapport 14. Det skal bemærkes, at inden nogen polymerisationstrin, MEHQ, en potent polymerisationsinhibitor, skal fjernes fra alle monomere og glycomonomer præparater lige før brug. Dette opnås let ved anvendelse af den minimale mængde methanol for at opløse glycomonomer der besidder MEHQ derefter straks behandle det med acetone ved -20 ° C til udfældning af inhibitor-frie produkt i højt udbytte.
Afgørende i enhver radikalpolymerisering ordning, er opmærksomhed på detaljer og monomere renheder fremhæves. Som det er typisk i et kompleks polymerisationssystemet, den består afen radikal kilde, en bunke reagens, en monomer og opløsningsmiddel. I denne visualiseret præsentation, er et enkelt trin RAFT polymerisation beskrevne system, der fokuserer på udarbejdelse af statistiske copolymerer frembragt fra en reaktionsblanding besidder tre forskellige monomerer i en vandig opløsning. To separate raft-medierede reaktioner præsenteres i hvilken man anvender en glycomonomer der besidder en pendant, ikke-reducerende carbohydrat terminus (dvs. β-D-galactose), og det andet, der besidder en polyol uden bundne carbohydratrest. Fælles for begge raft-medierede reaktioner var monomerer besidder en enestående hydroxylgruppe, der fungerer som en spacer-molekyle, og en anden besidder en fri amin for post-modificering med en amino-reaktiv fluorophor.
Idet tilstedeværelsen af oxygen i reaktionsblandingen og miljø er skadelig for RAFT-medieret polymerisation, er dens fjernelse at spore niveauer let opnås via adskillige fryse-evaCuate-tø cykler mens Schlenk-rør reaktionsbeholder under højvakuum opretholdelse.
Det skal bemærkes, at det molære forhold mellem forskellige monomerer i reaktionen kan justeres efter behov. Også ved at variere mængden af FLÅDE middel, længden af de resulterende polymerer kan reguleres 18. Imidlertid bør det molære forhold af raft middel og initiator altid være større end to for at sikre den lave dispersitet af produktet. Under disse betingelser, udviklingen i copolymerisationen er stabil, og reproducerbarheden af reaktionen er meget høj. Det er sagt, er det usandsynligt, at man opnår en fuldstændig ensartet fordeling af alle deltagende monomerer inden for en statistisk copolymer, grundet deres forskellige polymerisationsprocesser hastigheder. Karakterisering fordelingen af forskellige monomerer i polymeren er stadig meget udfordrende.
Den post-modifikation metode, præsenteres her, er både enklere og mere amenable til anvendelsen af et bredere udvalg af fluorescerende mærker, sammenlignet med andre protokoller, der anvendes til mærkning glycopolymers 2,11. Disse vil omfatte mange af de vandopløselige aminreaktive fluoroforer, quantum dots, biotiner, og andre. Bindingsspecificiteterne af syntetiserede, mærkede glycopolymers let kontrollerbar bruger lektiner med kendte bindingsaffiniteter. PMA-GAEMA besidder ingen pendant sukker er en passende negativ kontrol. Glycopolymers med forskellige fluorescerende markører fremstillet via denne rute er blevet anvendt med succes i undersøgelser af lektin-medieret bakteriel binding 14. Som præsenteret, bør letkøbt og effektiv forberedelse af statistiske fluorescerende glycopolymers giver stort potentiale for en bred vifte af glycobiological forskning.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Experiment Station Chemical Laboratories of the University of Missouri, and by the Cystic Fibrosis Association of Missouri.
Reagent | |||
Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | |
D-Gluconolactone | Sigma-Aldrich | G2164 | |
N-(2-hydroxyethyl) acrylamide (HEAA) | Sigma-Aldrich | 697931 | |
Orange II sodium salt | Sigma-Aldrich | O8126 | |
Hydroquinone monomethyl ether (MEHQ) | Sigma-Aldrich | 54050 | Polymerization inhibitor |
N-(2-aminoethyl) methacrylamide hydrochloride (AEMA) | Polysciences, Inc | 24833-5 | |
Triethylamine | Fisher Scientific | BP-616 | |
Anion-exchange resin IRN-78 hydroxide-form, 80 mesh | Sigma-Aldrich | 10343-U | |
Cation-exchange resin 50Wx8, 200 mesh | Sigma-Aldrich | 217514 | |
Aluminum oxide, ~150 mesh | Sigma-Aldrich | A1522 | Type WN-6, Neutral, Activity Grade Super I |
Ninhydrin | Sigma-Aldrich | N4876 | An ethanol solution of 0.2 % ninhydrin was used in the test |
4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic acid | Sigma-Aldrich | 722995 | RAFT agent |
4,4′-Azobis(4-cyanovaleric acid) | Sigma-Aldrich | 11588 | Polymerization initiator |
Carboxyfluorescein succinimidyl ester | Life Technologies | C1157 | |
Erythrina Cristagalli lectin coated agarose bead | Vector Laboratorie | AL-1143 | |
Solvent | |||
dH2O | Produced by Barnstead water purification system, 18 megOhm-cm | ||
Isopropanol | Fisher Scientific | A461-4 | ACS grade or better |
Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | ACS grade or better |
Absolute ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | ACS grade or better |
Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 22705 | ACS grade or better |
Acetone | Fisher Scientific | A929-4 | ACS grade or better |
Equipment | |||
Dialysis membrane (MWCO: 3,500) | Spectrum Labs | 132720 | |
Polyethylene glycol analytical standard standard | Sigma-Aldrich | O2393 | |
Schlenk tube, 1 mL | Quark Glass | Customized | |
TSK-GEL G4000 PWxl | Tosoh Bioscience | 8022 | Used for GPC analysis of the glycopolymers |
Empower 3 with GPC/SEC package | Waters Corporation | ||
Waters Alliance HPLC system | Waters Corporation | Equipped with refractive index detector (Waters 2414) and fluorescence detector (Waters 2475) | |
Avance III 800 MHz NMR Spectrometer | Brucker Corporation | ||
BX43 fluorescence microscope | Olympus Corporation | Used with FITC filter in the glycopolymer binding test | |
Rotavap / Rotoevaporator | Heidolph | ||
Fritted disc funnel | Fisher Scientific | 10-310-109 | |
Lyophilizer | Labconco | ||
Immunofluorescence microscope slide | Polysciences | 18357-1 | |
Revco Ultima Plus -80C Freezer | Thermo Scientific | ||
Plastic Vacuum Bag and Hand Pump | Ziploc | ||
Vacuum Pump, Direct Drive, Maxima C Plus | Fisher Scientific | ||
Vacuum Gauge | Sargent-Welch |