An efficient, three-step synthesis of RAFT-based fluorescent glycopolymers, consisting of glycomonomer preparation, copolymerization, and post-modification, is demonstrated. This protocol can be used to prepare RAFT-based statistical glycopolymers with desired structures.
Sentetik glycopolymers çeşitli biyokimyasal ve biyomedikal araştırma alanlarında kullanılan enstrümantal ve çok yönlü araçlardır. Döner ilaveli parçalanma zincir transfer kullanılarak, iyi kontrol edilen floresan istatistik glycopolymers bir basit ve etkin sentezinin bir örneği (RAFT) tabanlı polimerizasyon gösterilmiştir. (2-aminoetil) metakrilamit (AEMA) – sentez lactobionolactone ve N reaksiyonu ile elde edilen β-galaktoz içeren glycomonomer 2-lactobionamidoethyl metakrilamid hazırlanması ile başlar. 2-Gluconamidoethyl metakrilamid (gaema) bir terminal β-galaktoz içermeyen bir yapısal analogu olarak kullanılır. (2-hidroksietil) ara parçası olarak akrilamid, AEMA fazla flüoresan etiketleme için bir hedef olarak ve glycomonomers – N: Aşağıdaki RAFT aracılı kopolimerizasyon reaksiyonu, üç farklı monomer içerir. Sulu sistemlerin Toleranslı, reaksiyonda kullanılan RAFT madde (4-siyano-pentanoik asit) -4-dithiobenzoate olup.Düşük dispersities (≤1.32), tahmin edilebilir bir kopolimer bileşimleri ve polimerizasyon yüksek bir tekrarlanabilirliği ürünleri arasında gözlenmiştir. Floresan polimerler AEMA birincil amin fonksiyonel grupları hedefleyen carboxyfluorescein süksinimidil ester ile glycopolymers değiştirerek elde edilir. Ortaya çıkan glycopolymers lektin bağlayıcı özgüllükler belirli glycoepitope tanıyan lektinlerin kaplanmış gelen agaroz boncuklarla test ederek doğrulanır. Arzu edildiği için sentez kolaylığı, ürün bileşimlerinin sıkı bir kontrol ve reaksiyonun iyi bir tekrarlanabilirlik, bu protokol, özel yapılar ve kompozisyonlar diğer RAFT bazlı glycopolymers hazırlanmasına yönelik tercüme edilebilir.
Son yirmi yılda, sentetik glycopolymers ile araştırmalar tanıma lektin 1-3 süreçleri üzerinde duruluyor araştırma dahil bulaşıcı mekanizmalar incelenmesinde önemli bir potansiyel gösteren, yavaş ama sürekli gelişmeyi uğramıştır. Multivalent şeker kısımlarını sahip sentetik glycopolymers çok daha yüksek lektin bağlayıcı etkinliklerinin sergileyen beri tek değerlikli karbonhidrat kıyasla, onlar Glikobiyoloji alanda 3 büyük talep vardır. Klinik araştırmalarda özellikle ilgi insan solunum hücre yüzeylerinde ve mukoza glikoprotein üzerinde mevcut karbonhidrat bağlanma lektin aracılığıyla bakterilerin karakterize etmek için flüoresan glycopolymers kullanılmasıdır. Erken in vitro çalışmalar bakteriyel bağlama testlerinde ticari olarak temin edilebilen poliakrilamid-bazlı glycopolymers kullanılabilir. Bu prob çeşitli sonuçlar umut verici gösterdi, ancak her ikisi de pol, obtainability ve çok-to-lot sapmaların ilgili endişelerini dileYmer molekül ağırlığı ve glycoepitope içeriği. Ekonomik bir in-laboratuar protokolü yapısı içeriğine, boyut, ve bakteriyel lektinleri hedefleme sentetik glycopolymers saflık tatmin edici bir kontrol sağlayacak geliştirildi.
Glycopolymers uygun bir sentetik yaklaşıma arayışında, nispeten yeni bir polimerizasyon tekniği, tersine çevrilebilir bir ek parçalanma zincir transfer (RAFT) maddeler 4 çalışan kontrollü radikal polimerizasyon tipi kullanılarak test edilmiştir. Bu RAFT reaktifler son birkaç glycopolymer preparasyonlar 5-7 kullanılmıştır. Diğer glycopolymer hazırlanması protokolleri ile karşılaştırıldığında, RAFT aracılı polimerizasyonları, monomer yapı ve reaksiyon koşulları, sulu çözeltiler, potansiyel bir uyumluluk ve arzu edilen polimer ürünleri 8,9 küçük boyut dispersiteleri çeşitli toleransı da dahil olmak üzere birçok avantaj gösterirler. Önemli ilgi RAFT-ba hazırlanması için protokollerfarklı işlevleri 10-13 sahip olabilir, her biri farklı monomerlerin bileşimlerinin kontrol etmesine izin veren sed tri-bileşenli glycopolymers. Bununla birlikte, daha önceki araştırma çabaları iki en anomerik askılı karbonhidrat 10 yoksun ya da kullanılan çoğu kopolimerleridir istatistiki polimerlerin farklı amaçlara hizmet şekilde bağlanmış olan homopolimerler, oluşan tri-blok kopolimerleri elde polimerizasyonlar, adım olan monomer sırası kalıntıları istatistiksel kural 9-13 izleyin.
Son zamanlarda, thiocarbonylthio RAFT bileşiği kullanılarak (4-siyano-pentanoik asit) sulu bir ortamda -4-dithiobenzoate, bir grubunun hazırlanması, belirli askılı şekerler ve bunların uygulama içeren, doğrusal üç-bileşenli istatistik glycopolymers RAFT tabanlı lektin-aracılı bağlanma, bakteriyel Testler 14 rapor edildi. görsel bir şekilde sunulmaktadır, bu yöntem, genel amacı, tri-bileşenini hazırlamakRAFT kontrollü kopolimerizasyonu yoluyla istatistiki flüoresan glycopolymers. Çünkü tek aşamalı bir polimerizasyon protokolünün kolaylığı nedeniyle, polimer uzunluğu ve bileşimlerinde ve reaksiyonun, yüksek tekrarlanabilirliği üzerinde tam kontrol, bu protokol hali hazırda arzu edilen yapılara sahip glycopolymers diğer RAFT tabanlı sentezlere uygulanabilir.
Bir basit ve etkili olan ve bir kolye karbonhidrat olmadan RAFT tabanlı tri-bileşenli floresan glycopolymers için protokol ve lektin bağlayıcı testinde kullanımı, bu raporda gösterilmiştir. Protokol glycomonomers LAEMA ve gaema hazırlanması ile başlar. Tek-aşamalı bir RAFT kontrollü kopolimerizasyonu yoluyla yeniden üretilebilir bir verimle, öngörülebilir bir monomer bileşimine ve düşük bir dağılma ile glycopolymers elde edilir. Carboxyfluorescein süksinimidil ester ile glycopolymers sonrası modifikasyon sonrasında, elde edilen ilgili floresan-etiketli glycopolymer bağlanması, lektin bağlama özgüllüğü açısından kolaylıkla test edilebilir.
Daha sonra glycopolymer sentezlerde kullanılan edilecek glycomonomers ilk hazırlayıcı adımda, kolaylıkla temin laktobiyonik asit ve glukonolakton kullanılmıştır. Teorik olarak, kompleks, oligosakaritler monosakkaridden ilgi herhangi bir karbonhidrat, Converte olabilirglikoz C6 birincil hidroksil grubu üzerine hedef şeker konjuge tarafından glycomonomers d. Indirgeme glucose kalıntısının oksidasyonu ve bir lakton olan ek olarak dehidrasyon sonra, ürün daha sonra kolaylıkla olabilir karşılık gelen glycomonomer oluşturulması için AEMA birincil amin ile reaksiyona sokulur. Bu yol daha başka örnekleri arasında, bir son raporunda 14 görülebilir. Bu, herhangi bir polimerizasyon adımı başlamadan önce, MEHQ, güçlü bir polimerizasyon inhibitörü, kullanımdan hemen önce, bu tüm monomerin ve glycomonomer preparasyonlar çıkarılmalıdır not edilmelidir. Bu hali hazırda MEHQ sonra hemen yüksek verimde inhibitör içermeyen ürünün çökelmesi için -20 ° C'da aseton ile tedavi sahip glycomonomer çözünmesi için minimum miktarda metanol kullanılarak gerçekleştirilir.
Herhangi bir radikal polimerizasyon düzeni Essential, detay ve monomer saflık dikkat vurgulanmıştır. Bir sal polimerizasyon sistemi tipik olarak, bu oluşmaktadırradikal bir kaynak, bir RAFT reaktif, bir monomer ve çözücü. Bu görsel sunum, tek aşamalı bir RAFT polimerizasyonu sistemi, bir sulu çözelti içinde üç farklı monomerler sahip bir reaksiyon karışımından elde edilen istatistiki kopolimerlerin üretimine odaklanmıştır tarif edilmektedir. Iki ayrı RAFT aracılı tepkiler bir kolye sahip olan bir glycomonomer kullanan içinde sunulmuştur, herhangi bir ilişkili karbonhidrat artığı ile bir poliol sahip, karbohidrat terminus (örneğin, β-D-galaktoz), ve diğer non-azaltır. Her iki RAFT aracılı reaksiyonlar için ortak bir ara molekülü olarak hizmet veren tekil bir hidroksil grubuna sahip monomerler, ve başka bir amino reaktif florofor ile sonrası modifikasyonu için bir serbest amin, sahiptirler.
Reaksiyon karışımı, çevre oksijen varlığında yana RAFT aracılı polimerizasyon için zararlı olan, seviyelerini takip etmek durumunda bunun çıkarılması hali hazırda birkaç dondurularak eva ile gerçekleştirilirCuate-çözülme döngüleri yüksek vakum altında savurma tüp reaksiyon kabı korurken.
Bu gerektiği gibi reaksiyonda farklı monomerin molar oranı ayarlanabilir olduğu not edilmelidir. Ayrıca, kullanılan RAFT madde miktarının değiştirilmesiyle, elde edilen polimerlerin uzunluğu 18 kontrol edilebilir. Ancak, başlatıcı RAFT ajanının buna olan molar oranı, her ürünün düşük dağıtma özelliği temin etmek için iki daha büyük olmalıdır. Bu koşullar altında, kopolimerizasyon evrimi kararlı olduğunu ve reaksiyonun tekrarlanabilirliği çok yüksektir. Yani biri nedeniyle farklı polimerizasyon hızlarına, bir istatistik kopolimer içindeki tüm katılımcı monomerlerin tamamen tekdüze dağılım elde etmesi olası değildir, söyleniyor. Polimerin içinde farklı monomerlerin dağılımı karakterize hala çok zordur.
post-modifikasyon yöntemi, burada sunulan, hem daha basit ve amenabl olduğunuEtiket glycopolymers 2,11 uygulanan diğer protokollere göre floresan etiketler daha geniş bir seçim kullanımına e. Bunlar, suda çözünebilir amin-reaktif fluorophores birçok kuantum noktalar, biotins ve diğerleri içerir. Sentezlenen etiketli glycopolymers bağlayıcı özgüllükleri kolaylıkla kanıtlanabilir bilinen bağlanma ilgisi ile lektinleri kullanıyor. Hiçbir kolye şeker sahip PMA-gaema uygun bir negatif kontrolüdür. Bu yolla hazırlanan farklı floresan etiketler ile Glycopolymers başarılı bir lektin aracılı bakteriyel 14 bağlanma incelemelerinde kullanılmıştır. Görüldüğü gibi, istatistiksel olarak flüoresan glycopolymers bu basit ve etkin hazırlanması glycobiological araştırma çeşitli büyük potansiyel sağlamalıdır.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Experiment Station Chemical Laboratories of the University of Missouri, and by the Cystic Fibrosis Association of Missouri.
Reagent | |||
Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | |
D-Gluconolactone | Sigma-Aldrich | G2164 | |
N-(2-hydroxyethyl) acrylamide (HEAA) | Sigma-Aldrich | 697931 | |
Orange II sodium salt | Sigma-Aldrich | O8126 | |
Hydroquinone monomethyl ether (MEHQ) | Sigma-Aldrich | 54050 | Polymerization inhibitor |
N-(2-aminoethyl) methacrylamide hydrochloride (AEMA) | Polysciences, Inc | 24833-5 | |
Triethylamine | Fisher Scientific | BP-616 | |
Anion-exchange resin IRN-78 hydroxide-form, 80 mesh | Sigma-Aldrich | 10343-U | |
Cation-exchange resin 50Wx8, 200 mesh | Sigma-Aldrich | 217514 | |
Aluminum oxide, ~150 mesh | Sigma-Aldrich | A1522 | Type WN-6, Neutral, Activity Grade Super I |
Ninhydrin | Sigma-Aldrich | N4876 | An ethanol solution of 0.2 % ninhydrin was used in the test |
4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic acid | Sigma-Aldrich | 722995 | RAFT agent |
4,4′-Azobis(4-cyanovaleric acid) | Sigma-Aldrich | 11588 | Polymerization initiator |
Carboxyfluorescein succinimidyl ester | Life Technologies | C1157 | |
Erythrina Cristagalli lectin coated agarose bead | Vector Laboratorie | AL-1143 | |
Solvent | |||
dH2O | Produced by Barnstead water purification system, 18 megOhm-cm | ||
Isopropanol | Fisher Scientific | A461-4 | ACS grade or better |
Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | ACS grade or better |
Absolute ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | ACS grade or better |
Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 22705 | ACS grade or better |
Acetone | Fisher Scientific | A929-4 | ACS grade or better |
Equipment | |||
Dialysis membrane (MWCO: 3,500) | Spectrum Labs | 132720 | |
Polyethylene glycol analytical standard standard | Sigma-Aldrich | O2393 | |
Schlenk tube, 1 mL | Quark Glass | Customized | |
TSK-GEL G4000 PWxl | Tosoh Bioscience | 8022 | Used for GPC analysis of the glycopolymers |
Empower 3 with GPC/SEC package | Waters Corporation | ||
Waters Alliance HPLC system | Waters Corporation | Equipped with refractive index detector (Waters 2414) and fluorescence detector (Waters 2475) | |
Avance III 800 MHz NMR Spectrometer | Brucker Corporation | ||
BX43 fluorescence microscope | Olympus Corporation | Used with FITC filter in the glycopolymer binding test | |
Rotavap / Rotoevaporator | Heidolph | ||
Fritted disc funnel | Fisher Scientific | 10-310-109 | |
Lyophilizer | Labconco | ||
Immunofluorescence microscope slide | Polysciences | 18357-1 | |
Revco Ultima Plus -80C Freezer | Thermo Scientific | ||
Plastic Vacuum Bag and Hand Pump | Ziploc | ||
Vacuum Pump, Direct Drive, Maxima C Plus | Fisher Scientific | ||
Vacuum Gauge | Sargent-Welch |