Implantasjon av Miniosmotic Pumper og Levering av Tract Tracers å studere Brain Omorganisering i Patofysiologiske betingelser

Protocol

Dyreforsøk ble utført med godkjenning av myndighetene (G1361 / 13, AZ84-02.04.2013.A192 og G1362 / 13, AZ84-02.04.2013.A194; Bezirksregierung Düsseldorf) basert på NIH Retningslinjer for Care og bruk av forsøksdyr.

1. Utarbeidelse av Miniosmotic Pumper

1. I et sterilt miljø (f.eks., Cellekultur hette), får pumpen, kateter, strømme moderator, hjerne-tilsetning kanyle og avstandsplater som skal benyttes (figur 1).
2. For levering av legemidler direkte inn i ventriklene bruke en avstandsskive, slik at bare spissen av kanylen nålen er i kontakt med ventrikkelen. Hold kanylen opp ned med en tang. Legg til to dråper cyanoacrylate lim (CA) og innføre én spacer plate.
3. La kanylen på en plan overflate som vender oppover, slik at limet mellom avstandsskiven og kanylen tørker.
4. Skjær kateteret i deler av ca 2,5 cm.
5. For each pumpe, forberede et minimum av 300 til 350 ul av løsningen av interesse som det vil være nødvendig for å fylle pumpen således ekstrudering av all luft inne i den for å hindre dannelse av bobler i kateteret. bobler vil hindre strømningen av Løsningen inn i hjernen.
6. Koble kateteret forsiktig til strømnings moderator.
7. Ved hjelp av en 2 ml sprøyte forbundet med kanylen gitt av hjernen infusjonssett, fylle pumpen til en liten mengde av oppløsningen unnslipper pumpen, og dermed hindre luftbobler inne i den.
8. Fylle nøye flyten moderator og kateter betale oppmerksomhet for å hindre eventuelle bobler rester inne i kateteret.
9. Innføre strømmen moderatoren inne i pumpen.
10. Når de er fylt, kobles forsiktig kanylen til enden av kateteret. Hvis det er observert at en boble dannes fjerne kanylen og nøye fylle kateteret med bærer eller medikament-løsning, og deretter gjeninnføre kanylen.
11. Plasser pump i en beholder med steril saltvannsoppløsning og la den på 37 ° CO / N.
12. Før implantasjon sjekker for bobledannelse. Om nødvendig (ie., Er bobler observert) fjerne kanylen og fylle røret. Koble kanylen. Dette tar bare noen få mikroliter løsning.

2. Implantasjon av Miniosmotic Pumper

Merk: For disse forsøkene fikk dyrene bedøvet med 1% isofluran (30% O _2, 70% N ₂ O). Men hvis dette ikke er tilgjengelig, er det også mulig ¹¹ anvendelse av intraperitoneale injeksjoner av anestesi.

1. Finn dyret i stereo enheten under anestesi og dekker øynene med en beskyttende salve for å hindre tørrhet mens under anestesi. Bekreft anestesi ved å observere en manglende respons i bakpote når trykket med fingrene eller med en tang. Ikke gå videre før dyret er helt sover.
2. Skjær pels over hanad enten med saks eller en barbermaskin. Skjær så mye som mulig uten å skade huden.
3. Rense huden med 70% etanol og desinfeksjonsmiddel med antibakterielle og soppdreper egenskaper.
4. Med en skalpell åpne en 1 cm innsnitt litt til høyre for midtlinjen og eksponere skallen.
5. Rengjør skallen med en bomullspinne. Suge den med 70% etanol og passerer det over skallen. Dette vil indusere skallen tørke.
6. Hvis skallen har lett blødning, bruk en cauterizer å eliminere eventuelle blødning poeng. Blod hindrer CA tørker godt over benet når kanylen er implantert.
7. Bruk stereotactic enheten til å lage et merke på det punktet av skallen der kanylen blir implantert. For ventrikulære infusjoner på venstre hemisfære koordinatene er -0,2 mm caudal, 0,9 mm lateralt for bregma (Figur 2A).
8. Forsiktig bore over skallen lage en 45 ° vinkel; Dette hindrer boret fra uhell gå inn i brain. Gjentatte bore etter noen sekunder, og deretter sjekke hvor dypt hullet er. Stoppe boring når hodeskallen har blitt tynnet men fortsatt ikke helt penetrert.
9. Bryt hjernehinnene med spissen av en steril nål før full tilgang til hjernen er oppnådd. Gjøre det forsiktig, så det å ikke skade hjernen.
10. Rengjør skallen med 70% etanol ved hjelp av en bomullspinne.
11. Innføre en rett pinsett under huden på dyret i en antero-caudal retning. Bruk pinsett til å åpne plass under huden på ryggen av dyret, hvor pumpen blir implantert. Innføre pumpen inn i ryggen på dyret forlater kateterets kanyle og utenfor (figur 2B). Pumpen vil forbli i denne stilling inntil den er fjernet, og ikke trenger noen form for fiksering.
12. Nøye plassere fire små dråper lim ved siden av nålen i kanylen.
13. Introdusere nøye nålen gjennom skallen uten å flytte den sidelengs. Hold den på plass for 15-30 sek until kanylen er fullstendig koblet (figur 2C.1). Når på plass, vil kanylen nå 2,5 mm i dorso ventrale retning hvis en avstandsskive har vært brukt. Hvis den er riktig montert, vil kanylen være festet til benet til slutten av forsøket.
14. Plasser en finger over den avtakbare -fanen og deretter bruke den andre hånden til å klippe den av ved halsen med et sett med saks (figur 2C.2).
15. Lukke såret på huden med en 5-0 sutur og tilsett noen dråper povidon-jod-løsning (PVP-I) på toppen av såret for å hindre smitte (figur 2D).
16. Flytt dyret inn i et nytt bur. Ikke plasser opererte dyr med dyr som har fortsatt ikke blitt operert. Holde dyr som har blitt implantert med pumper alene i burene i løpet av tiden av Drug Administration.
17. Ikke la mus uten tilsyn før de er våkne og har gjenvunnet sternal recumbency.

3. Pump flyttbal

Merk: Vanligvis forsøket avsluttes ved slutten av leveringstiden tillates ved hjelp av pumpen, men det er mulig å fjerne pumpen for å kunne utføre sekundære eksperimenter som en følge opp til levering av legemidler. For å gjøre sporveis injeksjoner er det således nødvendig å fjerne pumpen.

1. Plasser dyret i seterotactic enheten under anestesi og dekke øynene med beskyttende salve for å hindre tørrhet mens under anestesi. Bekreft anestesi ved å observere en manglende respons i bakpote når trykket med fingrene eller med en tang. Ikke gå videre før dyret er helt sover.
2. Åpne huden forsiktig ved å skjære gjennom innsnitt gjøres på dagen for pumpen implantasjon.
3. Med en kirurgisk klemme holder kanylen og trekk den ut. Det bør være lett fjernes fra skallen. Som mild blødning er forventet, stoppe det ved å plassere en bomullsdott og vente i 1-2 min.
4. Trekk pumpe ut av kateteret. Hanlp den komme ut ved å trykke det, skaper press over huden.
5. Lukke såret igjen med en 5-0 sutur og tilsett noen dråper av PVP-I.
6. Flytt dyret inn i et nytt bur. Ikke legg opererte dyr med dyr som har fortsatt ikke blitt operert. Dyr som har gjennomgått kirurgi kan settes sammen.
7. Ikke la mus uten tilsyn før de er våkne og har gjenvunnet sternal recumbency.
8. At dyret kan komme seg i 10 dager før du fortsetter å kanalen tracer injeksjon.

4. Trykk Tract Tracer Injection 45 ° Angles på Right Motor Cortex

1. Plasser dyret på stereoenhet under narkose og dekker øynene med en beskyttende salve for å hindre tørrhet mens under anestesi. Bekreft anestesi ved å observere en manglende respons i bakpote når trykket med fingrene eller med en tang. Ikke gå videre før dyret er helt sover.
2. Åpne hodeskadene.
3. Clene skallen med 70% etanol ved hjelp av en bomullspinne.
4. Innføre en 5 mL glassprøyte (26S ga) på den vertikale innehaveren av anordningen. Sørge for at den nedre ende av glassholderen er nettopp på holdestykket. Sprøyten må ikke være for langt under det som så vil det være mulig å plassere den ved 45 ° fra den vertikale stilling og utføre injeksjonen.
5. Orientere sprøyten direkte over bregma og finn deretter de ønskede koordinater. For en injeksjon på motor cortex koordinatene er: Punkt 1: +0,5 mm rostralt og 2,5 mm lateral med hensyn til bregma. Punkt 2: 1,34 mm rostrale, 2,5 mm lateralt i forhold til bregma.
6. Når koordinatene har blitt plassert, viser deres posisjon over skallen med en markør med en tynn spiss. Gjør bare en prikk i skallen som overdreven blekk utgivelsen kan skjule riktig koordinat.
7. Bore nøye skallen holder bore 45 °. Som i trinn 2.8, kontrollerer skallen ofte slik at det ikke fullt ut perfinndampes ved for å unngå skader på hjernen forårsaket av bore. Med tuppen av en sprøyte for å sikre at alle ben er fjernet.
8. Last 600 nl av kanalen tracer fortynning inn i sprøyten.
9. Justere den vertikale posisjonen til 45 ° mot høyre side av dyret. Under mikroskop ved å plassere spissen av sprøyten er nålen rett foran hullet.
10. Bevege det i den vertikale retning ved hjelp av 1,5 mm. La nålen stødig i denne posisjonen i 30 sek til 1 min før du gjør trykk injeksjoner.
11. Injiser 300 nl av tracer fortynning i tre trinn på 100 nl adskilt fra hverandre ved 30 sek. Etter siste injeksjon, forlater sprøyten stabil i 30 sekunder til ett minutt for å unngå sporstoffet til å strømme ut av hjernen.
12. Sakte trekke ut sprøyten, flytte det over det andre hullet og gjenta den samme prosessen med de resterende 300 nl som er inne i sprøyten.
13. Etter den andre injeksjonen, fjern sprøyten og fortsett å lukke wound med en 5-0 sutur og tilsett noen dråper av PVP-I.
14. Flytt dyret inn i et nytt bur. Ikke legg opererte dyr med dyr som har fortsatt ikke blitt operert. Dyr som har gjennomgått kirurgi kan settes sammen. Ikke la mus uten tilsyn før de er våkne og har gjenvunnet sternal recumbency.
15. At dyret kan komme seg i 10 dager før offer.

5. Tract Tracer Observation

1. Bedøve dyret fullt per institusjonelle retningslinjer. Bekreft anestesi ved å observere en manglende respons i bakpote når trykket med fingrene eller med en tang. Ikke gå videre før dyret er helt sover.
2. Perfuse dyrene med 4% paraformaldehyd i PBS (pH 7) under standard protokoller ^6.
3. Fjern hjernen og etter fikse det ved O / N nedsenking i 4% paraformaldehyde.
4. Cryoprotect hjerner i sukrose på 30% frem til hjernen synke. Deretter fjerner hjernen og fryse dem med 10 sek umidrsion i flytende nitrogen. Hold hjerner ved -80 ° C inntil delene er produsert.
5. Produsere seksjoner på 20 mikrometer for retrograd kanalen tracer analyse og ved 40 mikrometer for anterokanalen tracer analyse ved seksjonering på en cryostate.

Merk: FG merkede nevroner kan observeres i form av hvite celler under ultrafiolett lys eksitasjon. BDA er oppdaget av O / N inkubasjon med et avidin-biotin-peroksidasekompleks og 3,3 'diaminobenzidin med tillegg av nikkel ved 0,4% for å forbedre kontrasten av fibrene ^6,7.

Representative Results

Vi har lagt dyr til 30 min av tilstopping av midtre cerebralarterie ved intraluminal suturen metoden indusere en lesjon i den venstre striatum og deretter levert rhEpo direkte inn i hjernen ved hjelp av miniosmotic pumper (figur 1, figur 3) i løpet av 30 dager med start 3 dager etter ⁶ slag. Figur 4 viser en skjematisk fremstilling av den Cortiço spinalkanalen som ble sporet etter CB og BDA injeksjon og det området der tracere ble injisert. Vi viste en forbedring av grep styrke og motorytelse (figur 5) etter 14 og 42 dager med rhEpo levering hhv. Levering av BDA inn i den høyre motor cortex av dyr som mottok et slag på venstre striatum, viste en økning i motor fibrene krysser midtlinjen på nivå med den røde og facial nucleus (figur 5), noe som viser vellykket farging av spirende fibre som en konsekvens av farmakologisk behandling med miniosmotic pumper. rhEpo behandling også økt neuronoverlevelse, forsinket diffuse astrocytosis, redusert glial arrdannelse og økt angiogenese i studerte perioden ^6. Ved å bruke den samme teknikken for kanalen sporstoffinjeksjons kan vi med hell detektere talamiske kjerner som er koblet til cortex ved injeksjon av det retrograde kanalen tracer FG (figur 6).

Figur 1. Komponenter i miniosmotic pumpen som brukes i denne protokollen. Avstands platen, kanylen og tab avtagbart, kateter, strømnings moderator og miniosmotic pumpe kan observeres. Aspektet av ferdig montert pumpe kan sees i figur 2A. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

TVen på-page = "1">
Figur 2. Oversikt over pumpe implantasjon viktige punkter. (A) mus er vist som plasseres på stereotaktisk anordning med fullt konstruert miniosmotic pumpe ved siden av den. Pilen angir koordinatene valgt for implantasjon. (B) Pumpen har blitt innført på ryggen av dyret og bare kanylen forblir på utsiden. Skallen er allerede boret. (C) Aspect av hodet etter implantasjon. (C.1) Kanylen er på posisjon, men det flyttbare kategorien har ikke blitt kuttet. (C.2) Den flyttbare kategorien har blitt kuttet og søm av såret kan nå begynne. (D) Stjernen viser en nylig implantert dyr i forhold til et dyr 30 dager etter implantasjon (#). Når plassert på riktig måte, bør såret forblir lukket inntil enden av den prosedyre som er angitt på bildet.ove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Nissl-farging indikerer implantasjonsstedet på hjernebarken. Et lite snitt kan observeres på en del av den venstre cortex (pil). Bredden av den penetrerte området er omtrent 50 mikrometer. Det er ingen åpenbare alvorlige vevsendringer basert på Nissl flekker i forhold til tilsvarende kontralaterale området (*). R: Høyre halvkule. L: Venstre halvkule. Scale bar = 300 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Tracttracer injeksjon strategi som offentliggjøres før etter Reitmeier et al. ^6,7. (A) Skjematisk indikerer injeksjonssteder for kanalen tracer BDA på kontralateral motor cortex mens CB ble injisert i motor cortex av infarkt halvkule. Fibrene ble fulgt til den røde kjerne (ikke vist), og ansikts kjerne (se figur 5). (B) Den innsprøytingsstedet på anterokanalen tracer BDA siden av motor cortex er vist. Legg merke til den røde pilen indikerer nålen spor mens den svarte pilen viser noen kortikale celler merket med BDA. Cx: Cortex. CC: Corpus callosum. V: ventrikkel. FN: Facial kjernen. Scale bar i B = 200 mikrometer. 4A er gjengitt med tillatelse ^6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5. Gjenvinning av et infarkt hjernen etter levering av rhEpo. (A) BDA injiseres i contralesional motor cortex blir deretter detektert i corticobulbar fibre på nivå med den ansiktskjernen (Bregma -5,8 mm til -6,3 mm). Skjæringslinjene på hver halvkule ble trukket parallelt med midtlinjen og fibrene krysser hverandre linje i retning mot ipsilesional og contralesional halvkule ble talt og uttrykt som prosent av totalt antall merkede fibre i corticospinal kanalen. Erytropoietin økt fiberkryssinger i retning til contralesional ansikts Nucleus Data er midler + - SD. Data ble analysert ved enveis ANOVA etterfulgt av minst signifikante forskjeller tester, §P <0,05 sammenlignet med placebobehandlede ikke-iskemiske mus. (B) Motor atferd viste en forbedring på håndgripestyrke og koordinasjon i rota stang test. Data er gjennomsnitts kostbares + - SD. Data ble analysert ved to-veis gjentatte målinger ANOVA, etterfulgt av en-veis ANOVA / minst signifikante forskjeller tester for hvert tids-punkt. §P <0,05 sammenlignet med pre-ischemisk baseline; * P <0,05 sammenlignet med vehikkelbehandlede iskemiske mus. Figurene 5A og B er gjengitt med tillatelse ^6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6. Target strukturer oppnådd etter injeksjon av Fluorogold (FG). (A) på injeksjonsstedet for FG ved siden av motoren cortex som antydet i figur 1. Legg merke til rød pil som indikerer at nålen sporet og den hvite pilen indikerer noen merkede celler i cortex. (B) FG injisert i nærheten av motorencortex er oppdaget i VPL. Fi: fimbria. IC: Intern kapsel. RT: thalamic reticular nucleus. VPL: thalamic ventral posterolaterale kjerne. Scale bar = 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

For mange år, har forskning på nevrodegenerative tilstander som iskemisk hjerneslag eller traumatisk hjerneskade fokusert på utvikling av nervecellene behandlinger som tar sikte på å fremme neuronoverlevelse i akutt hjerneslag fasen. Det store flertallet av medisinsk behandling som har vist seg å være effektive i gnagermodeller mislykkede når oversatt til klinikken. Grunner til dette terapisvikt, men er ikke begrenset av mangel på vedvarende virkninger av rusmidler fører til vedvarende funksjonell nevrologisk utvinning. Det er derfor viktig å utvikle strategier som fremmer hjerne ombygging på lengre sikt. Fordi fremme neuronal overlevelse alene er ikke tilstrekkelig til å tillate vellykket slag utvinning, som foreslått av det store antall mislykkede forsøk nevrobeskyttelse, stimulering av neuronal plastisitet har nylig fått stor interesse på feltet.

Midler for levering av legemidler er intraperitoneal injeksjon, hale intra jegnjection, femoral injeksjon, enkel stereotaktisk injeksjon av vektorer inn i hjernen og fortsatte konstant levering av miniosmotic pumper. Det sistnevnte kan omfatte systemisk levering, hvis pumpen ikke har en kanyle, eller som kan organ rettet, som vi har vist for levering inn i hjernen. Med unntak av miniosmotic pumper og anvendelsen av virale vektorer, vil alle andre strategier indusere varierende medikamentkonsentrasjoner. For langsiktige eksperimenter blir det derfor nødvendig å sende inn dyret til å stresse med å motta hyppige injeksjoner. BBB pålegger en viktig hindring for hjernen opptak av proteiner eller medikamenter fra blodet, noe som resulterer i et behov for store protein eller medikamentdoser for å oppnå terapeutiske konsentrasjoner i hjernen. For eksempel Pellegrini et al. (2013) ⁵ levert rhEpo ved intraperitoneal injeksjon i en dose ekvivalent med 75 IE / dag for et dyr av 30 g (750 IU / dag for en 300 g rotte). Til sammenligning målrettet levering av rhEpo til hjernen tillatt oss å bruke en mye lavere dose på bare 10 IE / dag i vår studie for vellykket hjerneslag utvinning, som gjorde oss i stand til å oppnå bedring over et stort tidsskala til en fast rente på 0,25 mL / t.

I dette arbeidet har vi vist en fremgangsmåte for implantering av minipumper med en kanyle koblet til skallen for å levere den plastisitet fremmende protein rhEpo direkte inn i ventrikkelen, og derved omgå BBB. Ved denne metode rhEpo fremmet nevrologisk utvinning i en rekke måter, inkludert reduksjon av infarktstørrelse, reduksjon av glial arrdannelse og induksjon av angiogenese. rhEpo også fremmet neuronoverlevelse og økt anslag fra contralesional motor cortex mot denerveres rød kjerne og ansikts kjerner. Den spirende av fibrene ble avslørt ved injeksjon av anterokanalen tracer BDA inn i motoren cortex (figurene 4A og 5A). En funksjonell korrelat til den spirende av fibrene er provided ved forbedring av motoriske ferdigheter (Figur 5B). I tillegg har vi vist at den samme metode for sporstoffinjeksjonskanalen kan brukes til å avsløre thalamo-cortical forbindelser ved injeksjon av det retrograde kanalen tracer FG (figur 6B).

Ved fremstillingen av den miniosmotic pumpen, er det viktig å vurdere målpunktet og bruken av avstandsstykker. Vi bruker en spacer for å redusere lengden av nålen ved 0,5 mm som på denne måten selve spissen av nålen er i kontakt med ventrikkel ved gitte koordinater (-0,2 mm caudal, 0,9 mm lateral, 2,5 mm dorso ventral Med i forhold til bregma). Men hvis dypere strukturer er målet for forskningen, så vil ingen avstandsstykker vil være nødvendig. Likeledes, hvis en mer ekstern leveringspunkt er ønskelig (f.eks., Cortex), og flere avstandsskiver vil være nødvendig. Kateteret må være lang nok slik at pumpen ikke er for tett inntil hodet, da det vil hindre bevegelsene til mouse, men også ikke så lenge som en gang er implantert overdreven lengde kan føre kateteret til å bøye, og dermed øke risikoen for kanylen fjerning av den naturlige bevegelse av musen. En del av 2 cm av kateteret gir meget gode resultater når det gjelder mobilitet og stabilitet av implantatet (figur 1 og 2). Inkubasjon av pumpen ved 37 ° CO / N gjør at pumpen umiddelbart begynne å pumpe medikamentet inn i hjernen ved tidspunktet for implantasjon.

I miniosmotic pumpen implantering er det viktig å sikre at hodeskallen er skikkelig tørket før implantering av kanylen. Vanligvis rengjøring med 70% etanol vil bevege benet til tørk, men hvis kontinuerlig blødning er funnet, vil berøre skallen forsiktig med en cauterizer helt tørke den. Det er viktig å sikre at innføringen av nålen som er vertikal og sakte som mulig. I posisjon, og mens limet tørker, plassere fingeren på toppen av kanylen hindrer den fra å bevege seg sideveis oveh skallen. Spesiell forsiktighet bør gis til såret og plassering av kanylen. Det er viktig at snittet ikke blir utført nøyaktig over midtlinjen av skallen, men litt til høyre side. Ved lukking av såret, hvis innsnitt ble gjort på midtlinjen, vil huden bli overstrekkes, og dermed øke faren for sår åpning. Gjøre innsnitt litt til den ene siden vil tillate sutur poeng for å være borte fra den høyeste delen av kanylen. Som en konsekvens vil det være mindre spenning på sutur punktene og såret vil gro på riktig måte. Dyr bør være i bur alene og sjekket hver dag, spesielt i løpet av de første 10-15 dager etter implantasjon. Ved sårdehiscens, sår må stenges så snart som mulig. Dersom kanylen er fjernet eller dyret presenterer en infeksjon, eksperimentet må være avsluttet. Re-implantasjon av kanylen er ikke anbefalt. Det er svært viktig for vellykket implantasjon å bruke tilstrekkelige mengder vev annonsehesive (ikke for mye!) da den forringer ben og øker risikoen for kanylen fjernes. Men bruker for lite lim vil heller ikke holde kanylen er festet til benet. De miniosmotic pumpene kan bære stoffer oppløst i et bredt spekter av substanser, som er den eneste begrensning for denne at oppløsningsmidlet er biokompatible. I tillegg, gitt at volumet er lite (200 ul) en må fastslå om konsentrasjonen som er nødvendig for forsøket er egnet og vil ikke forårsake utfelling inne i pumpen.

Tract tracing med enten anterograd eller retrograd tracere er et meget godt etablert teknikk for å studere hjernen tilkobling og plastisitet. Det må tas hensyn til bruk stereotaktiske rammer når injisering for å sikre nøyaktighet på målretting hjernen området man ønsker å studere (dvs. å unngå injeksjon på corpus callosum når injisere cortex).

For alle kirurgiske inngrep og for å redusere smerte oginflammasjon, bør dyrene behandles med 0,1 mg / kg Buprenorfin før intervensjonen og Caprofen ved 4 mg / kg en gang om dagen i tre dager etter inngrepet.

Som konklusjon, gir denne metoden et passende verktøy for å studere effekten av proteiner eller farmakologiske forbindelser i den skadde hjernen, som representerer en metode som er godt egnet for studier av hjernens plastisitet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alzet miniosmotic pump. Model 2004.	Alzet	000298	Drug container
Brain infusion kit 3 1-3 mm	Alzet	0008851	Drug brain delivery system
Loctite  454 Prism gel	Loctite	45404	Cyanoacrylate adhesive for cannula adhesion to the skull
75N glass syringe	Hamilton	87900/00	Injection of tract tracers
Biotin Dextran Amine (10,000 MW)	Molecular probes	N-7167	Anterograde tract tracer
Fluorogold	Fluorochrome, LLC.		Retrograde tract tracer
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)	Stoelting	53311	Stereotactic device for coordinate determination, pump implantation and tract tracer injection.