Implantation af Miniosmotic Pumper og levering af Tract Lysspor at studere Brain Reorganisering i patofysiologiske tilstande

Protocol

Dyreforsøg blev udført med regeringens godkendelse (G1361 / 13, AZ84-02.04.2013.A192 og G1362 / 13, AZ84-02.04.2013.A194; Bezirksregierung Düsseldorf) baseret på NIH retningslinjer for pasning og anvendelse af forsøgsdyr.

1. Fremstilling af Miniosmotic Pumper

1. I et sterilt miljø (dvs.., Cellekultur hætte), få pumpen, kateter, strømningsmoderatoren, hjerne infusion kanyle og afstandsskiverne der skal anvendes (figur 1).
2. For levering af lægemidler direkte ind i hjertekamrene bruge en indløbsring således at kun spidsen af ​​kanylen nålen er i kontakt med ventriklen. Hold kanylen hovedet med en pincet. Tilsæt to dråber cyanoacrylatklæbemiddel (CA) og indføre en spacer disk.
3. Efterlad kanylen på en flad overflade, der vender opad, således at limen mellem indløbsring og kanylen tørrer.
4. Skær kateteret i afsnit på ca. 2,5 cm.
5. For EACH pumpe, udarbejde en minimal 300-350 pi af opløsningen af interesse, da det vil være nødvendigt at fylde pumpen således ekstrudering al luft inde i den for at forhindre dannelsen af bobler inden i katetret. bobler vil hæmme strømmen af opløsning i hjernen.
6. Slut forsigtigt kateteret strømningsmoderatoren.
7. Anvendelse af en 2 ml sprøjte forbundet til nålen billede af hjernen infusion kit, fylde pumpen, indtil en lille mængde opløsning undslipper pumpen, hvilket forhindrer luftbobler inde i det.
8. Fyld forsigtigt flow moderator og kateter opmærksom at undgå bobler tilbage inde i kateteret.
9. Indføre strømningsmoderatoren inde i pumpen.
10. Når de er fyldt, tilslut forsigtigt kanylen til enden af ​​kateteret. Hvis det observeres, at en boble dannes fjerne kanylen og omhyggeligt genopfylde kateter med køretøjet eller lægemiddel-opløsning og derefter genindføre kanylen.
11. Placer pump i en beholder med steril saltvandsopløsning og lade det blive ved 37 ° CO / N.
12. Før implantation kontrolleres igen for bobledannelse. Hvis det er nødvendigt (dvs.., Der bobler observeret) fjerne kanylen og refill røret. Tilslut kanylen. Dette bør kun tage et par mikroliter opløsning.

2. Implantation af Miniosmotic Pumper

Bemærk: Til disse forsøg blev dyrene bedøvet med 1% isofluran (30% O _2, 70% N _{2 O).} Men hvis dette ikke er til rådighed, brug af intraperitoneale injektioner af anæstesi er også muligt ^11.

1. Find dyret i stereotaktisk indretningen under anæstesi og dække øjnene med en beskyttende salve for at forhindre tørhed, mens under anæstesi. Bekræft anæstesi ved at observere dets mangel på svar i bagpote, når der trykkes med fingrene eller med en pincet. Du må ikke fortsætte, indtil dyret er helt i søvn.
2. Skær pelsen over hanad enten med en saks eller en barbering maskine. Skære så meget som muligt uden at beskadige huden.
3. Rens huden med 70% ethanol og desinfektionsmiddel med antibakterielle og fungicider egenskaber.
4. Med en skalpel åbne en 1 cm incision lidt til højre for midterlinjen og blotlægge kraniet.
5. Rens kraniet med en vatpind. Suge det med 70% ethanol og videregive det over kraniet. Dette vil inducere kraniet tørre.
6. Hvis kraniet har lys blødning, brug en cauterizer at eliminere eventuelle blødning point. Blood forhindrer CA tørrer korrekt over benet, når kanylen er implanteret.
7. Brug stereotaktisk apparat til at foretage et mærke på det punkt af kraniet, hvor kanylen vil blive implanteret. For ventrikulære infusioner på venstre hjernehalvdel koordinater er -0,2 mm caudale, 0,9 mm lateralt til bregma (figur 2A).
8. Forsigtigt bore over kraniet gør en 45 ° vinkel; dette forhindrer boret ved et uheld gå i brain. Gentagne gange bore efter et par sekunder og derefter kontrollere, hvor dybt hullet er. Stop boring når kraniet er blevet tyndet men stadig ikke helt trængt.
9. Bryde meninges med spidsen af ​​en steril nål, indtil fuld adgang til hjernen opnås. Gør det forsigtigt, så der ikke beskadiger hjernen.
10. Rens kraniet med 70% ethanol ved hjælp af en vatpind.
11. Indføre en lige pincet under huden af ​​dyret i en antero-haleretningen. Brug pincet til at åbne rummet under huden på bagsiden af ​​dyret, hvor pumpen vil blive implanteret. Indføre pumpen ind i bagsiden af dyret forlader kateteret og kanylen uden (Figur 2B). Pumpen vil forblive i denne stilling, indtil den fjernes og behøver ikke nogen form for fiksering.
12. Anbring forsigtigt fire små dråber lim siden af ​​nålen i kanylen.
13. Indføre forsigtigt nålen gennem kraniet uden at flytte det sidelæns. Hold den i stilling til 15-30 sek until kanylen er helt fastgjort (fig 2C.1). Når på plads, vil kanylen nå 2,5 mm i dorso ventrale retning, hvis der er anvendt en spacer disk. Hvis forbundet korrekt, kanylen forblive fastgjort til knoglen, indtil eksperimentets afslutning.
14. Placer en finger hen over fanen aftagelige og derefter bruge den anden hånd til at skære det ud ved sin hals med et sæt sakse (figur 2C.2).
15. Lukke såret på huden med en 5-0 sutur og tilføje et par dråber povidon-iod-opløsning (PVP-I) oven på såret for at forhindre infektion (figur 2D).
16. Flyt dyret ind i en ny bur. Placer ikke drives dyr med dyr, der endnu ikke er drives. Holde dyr, der er blevet implanteret med pumper alene i deres bure i den tid af lægemiddel administration.
17. Efterlad ikke mus uden opsyn, indtil de er vågne og har genvundet brystleje.

3. Pumpe flytbarel

Bemærk: Normalt eksperimentet vil ende i slutningen af ​​leveringstiden tillades af pumpen, men det er muligt at fjerne pumpen for at gøre sekundære eksperimenter som en opfølgning på det stof levering. For at kunne gøre tarmkanalen tracer indsprøjtninger er det således nødvendigt at fjerne pumpen.

1. Placer dyret i seterotactic enhed under anæstesi og dækker øjnene med beskyttende salve for at forhindre tørhed, mens under anæstesi. Bekræft anæstesi ved at observere dets mangel på svar i bagpote, når der trykkes med fingrene eller med en pincet. Du må ikke fortsætte, indtil dyret er helt i søvn.
2. Åbn forsigtigt huden ved at skære gennem snittet udført på dagen for pumpen implantation.
3. Med en kirurgisk klemme holde kanylen og træk den ud. Det bør let fjernes fra kraniet. Som forventes blid blødning, stop det ved at placere en vatpind og vente 1-2 min.
4. Træk pumpen ud af kateteret. Hanlp det kommer ud ved at skubbe den, hvilket skaber tryk over huden.
5. Lukke såret igen med en 5-0 sutur og tilsæt et par dråber PVP-I.
6. Flyt dyret ind i en ny bur. Læg ikke drives dyr med dyr, der endnu ikke er drives. Dyr, der har undergået kirurgi kan sættes sammen.
7. Efterlad ikke mus uden opsyn, indtil de er vågne og har genvundet brystleje.
8. Så dyret kan komme sig i 10 dage før du fortsætter til tarmkanalen sporstof injektion.

4. Pres Tract Tracer Injektion ved 45 ° Vinkler på højre Motor Cortex

1. Placer dyret på stereotaktisk indretningen under anæstesi og dække øjnene med en beskyttende salve for at forhindre tørhed, mens under anæstesi. Bekræft anæstesi ved at observere dets mangel på svar i bagpote, når der trykkes med fingrene eller med en pincet. Du må ikke fortsætte, indtil dyret er helt i søvn.
2. Åbn sår i hovedet.
3. Clæne kraniet med 70% ethanol ved hjælp af en vatpind.
4. Indføre en 5 pi glassprøjte (26S ga) på den lodrette indehaveren af ​​enheden. Sørg for, at lavere ende af indehaveren af ​​glasset er netop på bedriften stykke. Sprøjten må ikke være for langt under det, som så vil det være umuligt at placere den 45 ° fra den lodrette stilling og udfører injektionen.
5. Orientere sprøjten direkte over bregma og find derefter de ønskede koordinater. For en indsprøjtning på den motoriske hjernebark koordinater er: Punkt # 1: +0,5 mm rostralt og 2,5 mm lateralt i forhold til bregma. Punkt # 2: 1,34 mm rostralt, 2,5 mm lateralt i forhold til bregma.
6. Når koordinaterne er blevet placeret, angive deres position over kraniet med en markør med en tynd spids. Foretag kun én prik i kraniet som overdreven blæk frigivelse kunne skjule det korrekte koordinat.
7. Bore forsigtigt kraniet holder boret ved 45 °. Som i trin 2.8, kontrollere kraniet ofte så at det ikke er fuldt perforated for at undgå skade på hjernen forårsaget af boret. Brug spidsen af ​​en sprøjte for at sikre, at alt knoglemateriale er blevet fjernet.
8. Load 600 nl af tarmkanalen tracer fortynding i sprøjten.
9. Justere den lodrette position til 45 ° mod højre side af dyret. Under mikroskopet, skal du placere spidsen af ​​sprøjtens nål lige foran hullet.
10. Flyt den i lodret retning med 1,5 mm. Lad nålen stabilt i denne stilling i 30 sek til 1 min før gør tryk injektioner.
11. Injicer 300 nl af tracer fortynding i tre trin på 100 nl adskilt fra hinanden med 30 sek. Efter den sidste injektion, forlader sprøjten stabil i 30 sekunder til 1 min med henblik på at undgå sporstof til at flyde ud af hjernen.
12. Træk langsomt i sprøjten, flytte det over det andet hul og gentage den samme proces med de resterende 300 nl der er inde i sprøjten.
13. Efter den anden injektion, fjern sprøjten og fortsæt til lukke wound med en 5-0 sutur og tilsæt et par dråber PVP-I.
14. Flyt dyret ind i en ny bur. Læg ikke drives dyr med dyr, der endnu ikke er drives. Dyr, der har undergået kirurgi kan sættes sammen. Efterlad ikke mus uden opsyn, indtil de er vågne og har genvundet brystleje.
15. Så dyret kan komme i 10 dage før aflivning.

5. Tract Tracer Observation

1. Bedøver dyret fuldt pr institutionelle retningslinier. Bekræft anæstesi ved at observere dets mangel på svar i bagpote, når der trykkes med fingrene eller med en pincet. Du må ikke fortsætte, indtil dyret er helt i søvn.
2. Perfundere dyrene med 4% paraformaldehyd i PBS (pH 7) under standardprotokoller ^6.
3. Fjern hjernen og post fix det ved O / N nedsænkning i 4% paraformaldehyd.
4. Cryoprotect hjerner i saccharose ved 30% indtil hjerner synke. Fjern derefter hjerner og fryse dem ved 10 sek Immersion i flydende nitrogen. Hold hjerner ved -80 ° C, indtil sektioner er fremstillet.
5. Fremstil sektioner på 20 um til retrograd tarmkanalen tracer analyse og ved 40 um for anterograd tarmkanalen tracer analyse ved sektionering på en cryostate.

Bemærk: FG mærkede neuroner kan iagttages som hvide celler under ultraviolet lys excitation. BDA påvises ved O / N inkubering med et avidin-biotin-peroxidase-kompleks og 3,3 'diaminobenzidin med tilsætning af nikkel på 0,4% til at forbedre kontrasten af fibrene ^6,7.

Representative Results

Vi indgav dyrene til 30 min af mellem-cerebral arterieokklusion af intraluminale sutur metode til at inducere en læsion i venstre striatum og derefter leveret rhEpo direkte ind i hjernen ved hjælp af miniosmotic pumper (figur 1, figur 3) i løbet af 30 dage, begyndende 3 dage efter slagtilfælde ^6. Figur 4 viser en skematisk afbildning af cortico spinal kanalen, der blev sporet efter CB og BDA injektion og det område, hvor sporstoffer blev injiceret. Vi viste en forbedring på gribestyrke og motorisk præstation (figur 5) efter 14 og 42 dage rhEPO levering hhv. Levering af BDA i den højre motor cortex af dyr, der modtog et slag på venstre striatum, viste en stigning i motordrevne fibre krydser midterlinjen på niveau med de røde og ansigtscellekerne (figur 5), hvilket demonstrerer succesfuld farvning af spiring fibre som en konsekvens af farmakologisk behandling med miniosmotic pumper. rhEpo behandling steg også neuronal overlevelse, forsinket diffus astrocytose, reducerede glial ardannelse og øget angiogenese i den undersøgte periode ^6. Ved at bruge den samme teknik til tarmkanalen tracer injektion kan vi med succes detektere thalamiske kerner, der er forbundet til cortex ved indsprøjtning af retrograd tarmkanalen tracer FG (figur 6).

Kan observeres Figur 1. Komponenter i den miniosmotic pumpe anvendes i denne protokol. Det indløbsring, kanyle og aftagelig fane, kateter, flow moderator og miniosmotic pumpe. Det aspekt af fuldt samlede pumpe kan ses i figur 2A. Klik her for at se en større version af dette tal.

nden-side = "1">
Figur 2. Oversigt over pumpens implantation centrale punkter. (A) Musen er vist som placeret på stereotaktisk apparat med fuldt konstrueret miniosmotic pumpe ved siden af. Pilen angiver de udvalgte til implantation koordinater. (B) er blevet indført Pumpen på bagsiden af dyret og kun kanylen forbliver på ydersiden. Kraniet er allerede blevet boret. (C) Aspekt af hovedet efter implantation. (C.1) Kanylen er på positionen, men fanen flytbare ikke er blevet skåret. (C.2) Det aftagelige fane er blevet skåret og syning af såret kan nu begynde. (D) Asterisken viser et nyligt implanteret dyr sammenlignet med et dyr 30 dage efter implantation (#). Når opstaldet korrekt, bør såret forblive lukket, indtil afslutningen af ​​proceduren som vist på billedet.ove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Nissl farvning indikerer implantationsstedet på cortex. Et lille snit kan observeres på en del af den venstre cortex (pil). Bredden af ​​den gennembrudte område er ca. 50 um. Det er ingen indlysende alvorlige vævsforandringer baseret på Nissl farvning sammenlignet med det tilsvarende kontralaterale område (*). R: højre hjernehalvdel. L: Venstre halvkugle. Skala bar = 300 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Tractsporstof injektion strategi som offentliggjort før ved Reitmeier et al. ^6,7. (A) Skematisk angivelse injektionssteder for tarmkanalen tracer BDA på kontralaterale motoriske hjernebark henviser CB blev injiceret i motoren cortex af infarkt halvkugle. Fibrene blev fulgt til den røde kerne (ikke vist) og ansigtscellekerne (se figur 5). (B) Den injektionsstedet på anterograd tarmkanalen tracer BDA siden af motoren cortex vises. Bemærk den røde pil angiver nålesporet henviser den sorte pil viser et par corticale celler mærket med BDA. Cx: Cortex. CC: Corpus callosum. V: ventrikel. FN: ansigtscellekerne. Scale bar i B = 200 um. Figur 4A er gengivet med venlig tilladelse ^6. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. Genvinding af en infarkt hjernen efter levering af rhEpo. (A) BDA injiceret i contralesional motor cortex detekteres derefter i corticobulbar fibre på samme niveau som den ansigtscellekerne (Bregma -5,8 mm til -6,3 mm). Vejkryds linier på hver halvkugle blev trukket parallelt med midterlinjen og fibre krydser hver linje i retning til ipsilesional og contralesional halvkugle blev talt og udtrykt som procent af de samlede mærkede fibre i corticospinal tarmkanalen. Erythropoietin øget fiber overfarter i retning til de contralesional facial nucleus Data er midler + - SD. Data blev analyseret ved envejs ANOVA efterfulgt af mindst betydende forskelle tests, §P <0,05 sammenlignet med bærerbehandlede ikke-iskæmiske mus. (B) Motor adfærd viste en forbedring på håndgreb styrke og koordinering i turnus stang testen. Data er middelværdier valuES + - SD. Data blev analyseret ved to-vejs gentagne målinger ANOVA efterfulgt af en-vejs ANOVA / mindst signifikante forskelle test for hvert tidspunkt. §P <0,05 sammenlignet med præ-iskæmisk baseline; * P <0,05 sammenlignet med vehikelbehandlede iskæmiske mus. 5A og B er gengivet med venlig tilladelse ^6. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6. målstrukturer nået efter injektion af Fluorogold (FG). (A) ved injektionsstedet FG siden af motoren cortex som vist i figur 1. Bemærk den røde pil angiver nålen spor og den hvide pil angiver et par mærkede celler i cortex. (B) FG injiceret i nærheden af motorencortex detekteres i VPL. Fi: Fimbria. IC: Intern kapsel. RT: thalamiske retikulære kerne. VPL: thalamiske ventral posterolateral kerne. Skala bar = 200 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

I mange år har forskning i neurodegenerative sygdomme som iskæmisk slagtilfælde eller traumatisk hjerneskade med fokus på udvikling af neurobeskyttende behandlinger, der har til formål at fremme neuronal overlevelse i akut slagtilfælde fase. Langt størstedelen af ​​lægemiddelbehandlinger, der har vist sig at være effektiv i gnavermodeller mislykkedes, da oversat til klinikken. Årsager til denne terapeutiske svigt omfatter, men er ikke begrænset til de manglende vedvarende effekter narkotika resulterer i vedvarende funktionel neurologisk opsving. Det er derfor vigtigt at udvikle strategier, der fremmer hjerne remodeling på længere sigt. Eftersom fremme af neuronal overlevelse alene er ikke tilstrækkelig til at tillade vellykket slagtilfælde nyttiggørelse, som foreslået af det store antal af mislykkede forsøg neurobeskyttelse, stimulering neuronplasticitet har for nylig fået stor interesse på området.

Midler til lægemiddeltilførsel er intraperitoneal injektion, hale intravaskulær injection, femoral injektion, enkelt stereotaktisk injektion af vektorer ind i hjernen, og fortsatte konstant levering af miniosmotic pumper. Sidstnævnte kan omfatte systemisk levering, hvis pumpen ikke har en kanyle, eller som kan orgel-rettet, som vi har vist til levering i hjernen. Med undtagelse af miniosmotic pumper og anvendelsen af ​​virale vektorer, vil alle andre strategier inducere fluktuerende stofkoncentrationer. For langsigtede eksperimenter det derfor bliver nødvendigt at sende dyret til stress af at modtage hyppige injektioner. BBB pålægger en vigtig hindring for hjernen optagelse af proteiner eller lægemidler fra blodet, hvilket resulterer i behovet for store protein- eller medikamentdoser med henblik på at opnå terapeutiske koncentrationer i hjernen. For eksempel Pellegrini et al. (2013) ⁵ leveres rhEpo ved intraperitoneal injektion i en dosis svarende til 75 IU / dag for et dyr af 30 g (750 IU / dag for en 300 g rotte). Til sammenligning målrettet levering af rhEpo til hjernen tilladt os at bruge en meget lavere dosis på kun 10 IU / dag i vores undersøgelse for vellykket slagtilfælde nyttiggørelse, som gjorde det muligt at opnå genopretning over en stor tidsskala til en fast rente på 0,25 gl / time.

I dette arbejde har vi vist fremgangsmåden til implantering af minipumper med en kanyle forbundet til skallen med henblik på at levere plasticitet-fremmende protein rhEpo direkte i ventriklen, således omgå BBB. Ved denne fremgangsmåde, rhEpo fremmes neurologisk opsving i en række måder, herunder reduktion af infarkt størrelse, reduktion af glial ardannelse og induktion af angiogenese. rhEpo også fremmet neuronal overlevelse og øget fremskrivninger fra contralesional motoriske hjernebark mod denerverede røde kerne og ansigts kerner. Spiring af fibrene blev afsløret ved indsprøjtning af anterograd tarmkanalen tracer BDA i motoren cortex (figur 4A og 5A). En funktionel korrelat til spiring af fibrene er provided med en forbedring af motoriske færdigheder (figur 5B). Derudover har vi vist, at den samme fremgangsmåde til tarmkanalen tracer injektion kan anvendes til at afsløre thalamo-hjernebarkforbindelser ved indsprøjtning af retrograd tarmkanalen tracer FG (figur 6B).

Ved fremstillingen af ​​miniosmotic pumpe, er det vigtigt at overveje målpunktet og brugen af ​​afstandsstykker. Vi bruger en afstandsholder for at reducere længden af ​​kanylen ved 0,5 mm som på denne måde selve spidsen af ​​nålen er i kontakt med ventriklen ved det givne koordinater (-0.2 mm caudale, 0,9 mm lateralt, 2,5 mm dorso ventrale, med hensyn til bregma). Men hvis dybere strukturer er målet for forskningen, så ingen afstandsstykker vil være behov for. Ligeledes, hvis der ønskes en mere ekstern leveringspunkt (dvs.., Cortex), derefter flere afstandsskiver vil være nødvendig. Kateteret skal være lang nok til, at pumpen ikke er for tæt på hovedet, da den vil hindre bevægelser af mouse, men også ikke alt for længe, ​​når implanteret overdreven længde kan forårsage kateteret til at bøje, hvilket øger risikoen for kanylen fjernelse af den naturlige bevægelse af musen. Et afsnit på 2 cm af kateteret giver meget gode resultater med hensyn til mobilitet og stabilitet af implantatet (figur 1 og 2). Inkubation af pumpen ved 37 ° CO / N giver pumpen til straks begynde at pumpe lægemidlet ind i hjernen på tidspunktet for implantation.

I miniosmotic pumpe implantation er det vigtigt at sikre, at kraniet er korrekt tørres, før implantering af kanylen. Normalt rengøring med 70% Ethanol vil fremkalde knoglen til tørre, men hvis kontinuerlig blødning er fundet, vil røre kraniet forsigtigt med en cauterizer helt tør den. Det er afgørende at sikre, at indførelsen af ​​nålen er så lodret og langsom som muligt. Når i position, og mens limen tørrer, placerer fingeren på toppen af ​​kanylen forhindrer den i at bevæge sig til siden ovis kraniet. Der bør lægges særlig vægt på at såret og placering af kanylen. Det er vigtigt, at snittet ikke udføres nøjagtigt over midten linje af kraniet, men lidt til højre. Ved lukning af såret, hvis snittet er foretaget på den midterste linie, vil huden blive overbelastet, hvilket øger risikoen for sår åbning. Gør snittet lidt til den ene side vil gøre det muligt sutur punkter at være væk fra den højeste del af kanylen. Som følge heraf vil der være mindre spænding på sutur punkter og såret vil hele ordentligt. Dyrene bør bur alene og kontrolleres dagligt, især i de første 10-15 dage efter implantation. I tilfælde af sårruptur, sår skal lukkes så hurtigt som muligt. Hvis kanylen er fjernet eller dyret præsenterer en infektion, har forsøget til ophør. Re-implantation af kanylen frarådes. Det er meget vigtigt for en vellykket implantation at anvende tilstrækkelige mængder væv adhesive (ikke for meget!), da det nedbrydes knoglen og øger risikoen for kanylen fjernes. Men ved hjælp af for lidt lim vil heller ikke holde kanylen er knyttet til knoglen. De miniosmotic pumper kan bære medikamenter opløst i en bred vifte af stoffer, som er den eneste begrænsning til dette, at opløsningsmidlet er biokompatibel. Derudover, eftersom mængden er lille skal (200 pi) man bestemme, om fusionen er nødvendig for forsøget er egnet og vil ikke forårsage udfældning inde i pumpen.

Tarmkanalen sporing med enten anterograd eller retrograd sporstoffer er et meget veletableret teknik til at studere hjernens tilslutningsmuligheder og plasticitet. Pleje skal gives til brug stereotaktiske rammer, når injektion for at sikre nøjagtigheden om at målrette hjernen område man ønsker at studere (dvs. at forhindre injektion på hjernebjælken, når injektion cortex).

For alle kirurgiske indgreb og for at mindske smerter oginflammation, skal dyrene behandles med 0,1 mg / kg Buprenorphin før intervention og Caprofen ved 4 mg / kg én gang dagligt i tre dage efter indgrebet.

Afslutningsvis Denne fremgangsmåde giver en passende værktøj til at studere virkningen af ​​proteiner eller farmakologiske forbindelser i skadede hjerne, der repræsenterer en fremgangsmåde, der er velegnet til undersøgelser af hjernens plasticitet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alzet miniosmotic pump. Model 2004.	Alzet	000298	Drug container
Brain infusion kit 3 1-3 mm	Alzet	0008851	Drug brain delivery system
Loctite  454 Prism gel	Loctite	45404	Cyanoacrylate adhesive for cannula adhesion to the skull
75N glass syringe	Hamilton	87900/00	Injection of tract tracers
Biotin Dextran Amine (10,000 MW)	Molecular probes	N-7167	Anterograde tract tracer
Fluorogold	Fluorochrome, LLC.		Retrograde tract tracer
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)	Stoelting	53311	Stereotactic device for coordinate determination, pump implantation and tract tracer injection.