Summary
Сотовый организация черепно костей давно предположили, но никогда непосредственно не визуализируется. Мульти-спектральный мечения клеток и в естественных условиях живут изображений позволяет визуализировать динамическое поведение клеток в данио нижней челюсти. Здесь мы подробно протокол для управления Zebrabow трансгенных рыб и непосредственно наблюдать клетки интеркаляции и морфологические изменения хондроцитов в хряще в Меккеля.
Abstract
Развитие позвоночных черепно структур требует точной координации миграции клеток, пролиферации, адгезии и дифференцировки. Паттерна хряща Меккеля, первый глотки арки производной, включает в себя миграцию черепно нервного гребня (CNC) клеток и прогрессивной разделов, пролиферацию и организацию дифференцированных хондроцитов. Несколько исследований описали миграции с ЧПУ во время нижней челюсти формообразования, но детали, как хондроциты достижения организации в росте и расширении хряща Меккеля, остается неясным. Sox10 ограничено и химически индуцированных Cre рекомбиназа-опосредованной рекомбинации создает перестановки различных флуоресцентных белков (RFP, YFP и CFP), тем самым создавая многоспектральной маркировки клеток-предшественников и их потомства, отражающие различные клоновых популяций. Использование конфокальной время киносъемки, это можно наблюдать хондроциты behaviили во время развития хряща данио Меккеля.
Мультиспектральное мечения клеток позволяет ученым, чтобы продемонстрировать расширение хондроцитов в Меккеля. Во время фазы расширения хряща Меккеля, который предвосхищает челюсть, хондроциты интеркалировать осуществить расширение, как они складывают в организованном одноклеточного слоистой подряд. Отказ этом организованного процесса интеркалирующего посредником расширение клеток обеспечивает сотовой механистическое объяснение гипоплазии нижней челюсти, что мы наблюдаем в нижней челюсти пороков развития.
Introduction
Черепно развитие требует сложных молекулярных, клеточных и тканевых взаимодействий ездить клеточной пролиферации, миграции и дифференциации 1,2, 3. Это жестко регулируется и сложный процесс, подлежит генетических и экологических возмущений, таких, что черепно-лицевые уродства являются одними из самых распространенных врожденных пороков развития 1-9. В то время как хирургические вмешательства остаются основой лечения черепно-лицевых аномалий, понимания основ развития имеет важное значение для будущих инноваций терапии. Таким образом, изучение морфогенеза и механизмов в конвергенции и расширения и интеграции клеток обеспечивает новые идеи в формировании скелета черепно 1.
Черепно нервного гребня мигрируют и заполнить первую глотки арки, а также форма парные челюстные процессы, которые проходят с образованием хряща Меккеля, который предвосхищает челюсть. Морфогенез ое хряща Меккеля требует хондроцитов организации через направленного распространения, поляризации клеток и дифференцировки 1,10. Тем не менее, запутанность хондроцитов организации в росте и расширении хряща Меккеля, остается неясным. Понимание динамическое поведение клеток является критическим для понимания врожденных пороков развития, влияющие на размер нижней челюсти, например, гипоплазией нижней челюсти фенотипов 11.
Эмбрионы рыбок данио предлагают много развития и генетические преимущества для детального изучения морфогенеза хряща Меккеля. Их генетический уступчивость, прозрачность, экс естественных и быстрое развитие мощные преимущества кредитования это хорошо для наблюдения клеточного движения и организации живой изображений 6. Использование клон трассировки инструменты, такие как: Sox10 KAEDE трансгенной линии, мы и другие очерчены нервного гребня происхождение эмбриональных черепно скелета 1,5. UsiН.Г. Sox10: ERT2-Cre с UBI: Zebrabow-М трансгенной линии, теперь можно исследовать детали сотовых движений во время черепно-лицевого развития. Zebrabow-М, является трансгенной линии разработана с убиквитиновой промоутер вождения выражение различных флуорофоров, каждый в окружении LOX сайтов 8. По умолчанию флюорофор Zebrabow-М Красный, выражая RFP. После индукции экспрессии Cre, то Zebrabow-М построить рекомбинирует и клетки выразить сочетание различных флуорофоров (ППП, СФП и YFP), создающих многоспектральной выражение в зародыше. Все дочерние клетки, которые делят с меченых клеток после рекомбинации затем клонально помечены, так что сотовые населения, которые вытекают из различных сопоставленными предшественников клонально помечены. К этому клонирование клеток маркировки, пролиферации и миграции клеток с клональной разрешением может следовать (фиг.1 и 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Massachusetts General Hospital Институциональный уход и использование животных комитет (IACUC) одобрил все процедуры в соответствии с Протоколом номер # 2010N000106. Это в соответствии с Ассоциацией по оценке и аккредитации содержания лабораторных животных Care International (AAALAC) руководящих принципов.
1. Реагенты и материалы Подготовка
- Подготовка 1 л 50X Е3 эмбриона среды (таблица 1) и подготовить 1 л 1X E3 эмбриона среды (таблица 2).
- Подготовка E3 эмбриона среду с N-фенилтиомочевины (ПТУ) путем добавления 30 мг ПТУ 1 л 1X E3. Перемешать O / N, чтобы гарантировать, что ПТУ полного растворения. Хранить при комнатной температуре.
- Чтобы приготовить раствор проназы, разбавленной 150 мкл проназы (0,5 мг / мл) с 15 мл 1X E3. Этого количества достаточно для 1 чашки Петри. Используйте немедленно.
- Подготовьте раствор метилцеллюлозы.
- Подготовка Е3-Tricaine решение путем смешивания 75 мл 0,2% Tricaine 25 мл1х E3. Варить 3 г метилцеллюлозы в 75 мл Е3-Tricaine решения.
- Составьте окончательный объем до 100 мл с Е3-Tricaine решения. Окончательное решение метилцеллюлоза вязкой и непрозрачным с желтоватым оттенком. Хранение: РТ в защищенном от света.
- Тамоксифен акции и индукции решение
- Подготовьте 5 мм тамоксифен маточного раствора путем растворения 4-гидрокситамоксифен в 100% этанола. Магазин складе при температуре -80 ° C.
- Подготовка свежий раствор тамоксифена при концентрации желание в 1X E3, чтобы получить индукционный решение. ВНИМАНИЕ! Пожалуйста, обратитесь MSDS перед использованием.
- Подготовка 1 л 0,2% Tricaine согласно таблице 3.
- Получить конфокальной слайдов. Клей четыре покровного стекла (18 х 18), чтобы сформировать блок затем поместить 2 блока на 24 х 60 см 2 покровного стекла друг от друга, что позволяет монтировать эмбриона в середине.
2. Подготовка эмбрионов
- Трансгенные линии.
- Sox10: ERT2-Cre
ПРИМЕЧАНИЕ: Создание вектора направленного pDestTol2- Sox10: ERT2-Cre, используя стандартные методы молекулярного клонирования и коммерчески получены рекомбинации технологии клонирования.- Зерноуборочные 5 'запись клон (pENTR5'- sox10p), содержащий 7.2Kb в Sox10 промоутер, шлюз средний клон (PME-ERT2-CRE), и 3' клон входа (pENTR3'-полиА) в реакции с LR назначения линзы вектор pDestTol2- α-кристаллина: YFP.
- Очищают конструкцию pDestTol2- Sox10: ERT2-CRE. Со-инъекцию очищенного конструкцию (100 нг / мкл) с Tol2 транспозазы мРНК (50 нг / мкл) в эмбрионы дикого (F0) на стадии одного элемента.
- Экран F0 взрослых учредителями для передачи зародышевой линии на основе яркого желтого флуоресценции в эмбрионах F1.
- Sox10: ERT2-Cre; Zebrabow-М
- Скрещивание с Zebrabow-Mлиния (2.1.1) с Sox10: трансгенной линии ERT2-CRE.
- Выберите эмбрионы, обладающие сильной вездесущий выражение RFP и YFP объектива маркер и расти их до взрослых.
3. эмбрионов
- Настройте несколько пар Sox10: ERT2-Cre; Zebrabow-M трансгенной данио между 5 вечера и 6 вечера на 1 день.
- На следующий день, тянуть делители утром и собирать яйца около полудня.
- Перевести их на чашки Петри и добавить 15 мл раствора проназой dechorionate эмбрионов.
- Инкубируйте эмбрионов в течение 1 мин до 5 примерно 60% эмбрионов были dechorionated. Остановить реакцию декантации проназой решение и мыть эмбрионов 3-4 раза свежей E3 среды.
- Инкубируйте эмбрионов в dechorionated E3 на RT O / N, и пусть они развиваются, чтобы достичь стадии 10 сомитов. Выдержите 50-60 эмбрионов на сцепление, чтобы избежать различных рост развития. 4. Лечение
- Проверьте этап развития эмбрионов "под микроскопом светового поля, чтобы они находятся на стадии 10 сомитов.
- Использование флуоресцентного микроскопа с красным флуоресцентным белком (RFP) фильтра, изолировать ярко-красные эмбрионов.
- Переходим к индукции CRE-рекомбинации добавлением 10 мкМ гидрокситамоксифен решения Петри и инкубации изолированных зародышей на 28,5 ° С в течение 3 ч.
- Слейте тамоксифен решение и мыть эмбрионов несколько раз с E3.
ВНИМАНИЕ! отказаться от тамоксифена решение в специальном контейнере биологических отходов. - Инкубируйте эмбрионов на 28,5 ° CO / N.
- Когда эмбрионы примерно 28-29 сомитов стадии (около 24 ч после оплодотворения), инкубировать эмбрионов на 28,5 ° С в Е3 ПТУ раствора будущем.
Примечание: ПТУ здесь использованы для ингибирования образования меланофорах в развивающихся эмбрионов. Это лечение необходимоизбежать искажения сигнала флуоресценции по авто-флуоресцентный меланофорах. - Инкубируйте эмбрионов на 28,5 ° C
- Для визуализации полностью разработанные черепно-лицевых структур, выбора эмбрионов на 4 дня после оплодотворения для интенсивности красного сигнала и Cre выражения маркера положительности (желтый в сетчатке).
- Обезболить эмбрионов с Е3 / 0,015% Tricaine решения. Анестезия подтверждается, когда нет активных движений или плавник активности не наблюдается, когда мягко подталкивая эмбрион.
- Передача выбранного эмбрионов для визуализации в чашку Петри, содержащую каплю метилцеллюлозы и осторожно бальзамируют эмбрион с метилцеллюлозы.
- На чистой конфокальной слайда, поместите каплю свежего метилцеллюлозы и смонтировать эмбриона в капле с помощью microloader чаевые. Позиция эмбриона дорсально принимая осторожность, чтобы не коснутьсяэмбрион непосредственно.
- Накройте установленный эмбриона с 25 х 25 покровного и отрегулировать положение эмбриона в случае необходимости, манипулируя покровное.
- Эмбрион готов к изображению.
- Используйте 20x сухой объектив цели (числовая апертура 0,75; обскуры размер 2,0 мкм) для фокусировки эмбриона.
- Нажмите кнопку L100 на микроскоп и выбора каналов в программном обеспечении.
- Выберите кнопку конфокальной установки и нажмите "Auto" и выберите следующие каналы перед закрытием окна: CH1: CFP, CH2: GFP, CH3: RFP или mCherry
- Включите СН2 и СН3, прежде чем нажать кнопку "Удалить" блокировку. Нажмите 'Play', чтобы начать сканирование.
- Сосредоточьтесь на структуре интерес, который лучше всего сделать, начиная с ½ кадра / сек и высокого напряжения (ВН) 150, а затем изменить настройки соответственно до желаемое качество изображения не переменного токаhieved. ППП будет ярче, чем другие цвета, поэтому регулировать HV. Изменение позиции Z, чтобы найти как YFP и RFP-положительных клеток.
- После установки с настройками, снимок вашего эмбриона. Сохранить свою фотографию в формате программного обеспечения конфокальной изображений и TIFF формат для обработки изображений в каждой разделенной канала.
- Далее, для визуализации CFP, выключите СН2 и СН3 и включите Ch1. Re-настройки параметров, как в шаге 5, не изменяя зону фокусировки.
ПРИМЕЧАНИЕ: СФП может быть очень трудно обнаружить из-за фонового сигнала в канале синего, что можно обойти путем корректировки размера обскуры. Больший размер обскуры позволяет лучше обнаружения флуоресценции путем уменьшения отношение сигнал / фон. Тем не менее, крупные обскуры снизит конфокальной эффект, ущерба для качества изображения. Таким образом, тщательной корректировки настроек, необходимых для достижения желаемого качества изображения и интенсивности. - Захват изображения и сохранять их в формате как (конфокальной программное обеспечение и TМФЛ) для обработки изображений. Изображения могут быть обработаны с помощью стандартного программного обеспечения для обработки изображений, чтобы объединить слои и улучшить цветовые настройки, как описано Пан и его коллеги 8.
5. Выбор эмбрионов
6. Монтаж эмбриона в метилцеллюлоза
7. Анализ с помощью флуоресцентной микроскопии
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Визуализация Традиционная хряща целыми монтаж альциановым голубым пятен была неоценима в наблюдении развивающийся хрящ Меккеля и обычно используется для визуализации окончательного клеточной организации 12 (Рис. 1А) Для дальнейшего анализа развивающиеся хондроциты сверхурочно, родословная трассировки с помощью Sox10: KAEDE трансгенных линий позволило нам изучить миграцию клеток, сближение и расширение в живых эмбрионов 2,12 (рис 1B). Тем не менее, организация хондроцитов в черепно-лицевой скелетной структуры остается плохо изученным. По живого изображения, трансгенной линии Zebrabow-М способен выявить процесс интеркаляции хондроцитов и удлинение, что посредником расширение и рост хряща Меккеля (рис 1С-G).
В этом протоколе, уби: Zebrabow-м; Sox10: эмбрионы ERT2-Cre лечили тамоксифен в 10 сомитов и хондроcytes в нижней челюсти визуализировались в различные моменты времени в ходе развития (от 3 до 5 DPF DPF). Нижняя челюсть лучше фото вентрально, чтобы ясно вид хряща Меккеля без вмешательства решетчатой пластины и мозгового дорсально. Стабильно поддерживаться и унаследованные цвета позволяют легко происхождение отслеживания и CNCC клеток отображение судьбы, как указано черными стрелками на рис 2А-2D. Сингл синий сотовый, кажется, мигрируют и интеркалировать с соседними клетками. Затем удлиняется вдоль передне-задней оси с образованием однородно формованного хондроцита таким образом, поддерживая глобальную форму хряща Меккеля, как она распространяется кпереди.
Этот метод позволяет изучать пороков роста нижней челюсти на клеточном уровне и органов в условиях, таких как Робин последовательности, где микрогнатия является одним из выдающихся особенностей, описанных. Отказ в пролиферации, продлении или интеркаляции может быть эффективно визуализировать т он растет хондроциты в течение долгого времени.
| NaCl | 14.61 г |
| KCl | 0,65 г |
| CaCl 2 | 1,83 г |
| MgSO 4 | 1,99 г |
| Деионизированная H 2 O | 1000 мл |
| * Хранение: РТ | |
| ** Добавьте 1 каплю голубого метилена в качестве анти-грибковым | |
Таблица 1. 50X Е3 эмбриональных среднего рецепт
| 50X Е3 | 20 мл |
| Деионизированная H 2 O | 980 мл |
| * Хранение: РТ | |
| 1М Трис-Cl (рН 9,5) | 9 мл |
| Tricaine | 2 г |
| Деионизированная H 2 O | Сделайте до 1 л |
| * Хранение: РТ | |
Таблица 3. 0,2% Tricaine рецепт
Рисунок 1. (А) хряща флуоресценции Меккеля из Sox10:.. GFP (Б) хряща расчлененного Меккеля из 4 DPF Тюбинген эмбриона окрашенных Альциановый синий (С) Трансгенные данио линии Ubi: Zebrabow-М крест с Sox10: ERT2-CRE. (ГД) Ubi: Zebrabow-М; Sox10: ERT2-Crе изображение в RFP (D), YFP (Е), CFP (F) каналов и объединить (G). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. (AD) Интервальная фотосъемка Zebrabow-М: Sox10: ERT2-Cre в 3dpf (А), 3.5dpf (Б), 4dpf (С) и 5dpf (D). Черные стрелки указывают на тот же одного клона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Альциановый синий и photoconvertible трансгенные линии, как описано выше дополняет друг с другом, чтобы определить сложный процесс хряща и развития костей. Тем не менее, в прямом эфире клеточной миграции и организация в течение органогенеза давно предположили, и косвенно продемонстрировал, но никогда не визуализируется. Zebrabow-М трансгенных линии в сочетании с хряща конкретных Cre позволяет одновременно живой соблюдение всех этих различных событий, участвующих в образовании костной и хрящевой. Этот метод позволяет изучать дефектов роста нижней челюсти на клеточном уровне и органов в условиях, таких как Робин последовательности, где микрогнатия является одним из выдающихся особенностей, описанных. Отказ в пролиферации, продлении или интеркаляции может быть эффективно визуализировать в растущих хондроцитов в течение долгого времени.
Цвет оптимизация разнообразие
Оптимизация уровней CRE титрованием концентрация 4-гидрокситамоксифен может контролировать Extenт рекомбинации и разнообразие цветов, не приводя в эмбриона летальности. Эстроген имеет решающее значение для нормального развития сетчатки и, следовательно, более высокие дозы тамоксифена (> 25 мкм) могут индуцировать сетчатки дегенерация, высокий уровень смертности (~ 60 до 80%), черепно-лицевые пороки и задержки в развитии. Кроме того, 4-гидрокситамоксифен разбавляют в этаноле, который сам по себе является токсичным во время эмбрионального развития 13. Поэтому, важно, чтобы определить наилучший концентрации и продолжительности экспозиции, чтобы получить хорошую скорость рекомбинации, но ограничить токсичность для эмбрионов.
Требуемой концентрации 4-гидрокситамоксифен была оптимизирована в данном протоколе. Различные концентрации (5-25 мкм) индукционные моменты времени (10 сомитов, 24, 36 и 48 HPF) и продолжительность (от 30 мин до 6 ч) были испытаны (данные не показаны). Низкая доза тамоксифена (5 мкм) получают ограниченный рекомбинации, а более высокие дозы (от 10 до 20 мкм), полученное SIMИлар рекомбинации и разнообразие цветов. Дозы более 20 мкм под угрозу нормальное развитие эмбрионов и, следовательно, не подходит для изучения черепно-лицевые пороки развития. Индукционные продолжительность меньше, чем 2 часа не было достаточно для создания адекватной рекомбинации, а более 6 ч индукции индуцируется токсичности и пороков развития у зародышей. Индукционная в течение 3 или 4 часов не отличаются по количеству рекомбинации и конечных результатов.
Индукционная после 24 HPF эмбриональных этап не производится нужный рекомбинации и флуоресцентного выражение. Таким образом, лучший компромисс между нормальным развитием и подходящим количеством цветов, не приводя к значительно большим числом эмбриональной смертности был определен как 3 ч индукции в 10 сомитов с концентрацией 10 мкМ в тамоксифена.
Качество изображения
Получение последовательные и высококачественные изображения могут быть сложной задачей. Если одно поле В.И.EW не в состоянии визуализировать весь хрящ Меккеля или черепно-лицевой структуры интересов, вся структура может быть отображен, принимая Z-стеки. Однако, получение Z-стеки может быть сложным в живого изображения эмбрионов из-за артефактов движения. Поэтому важно, чтобы компромисс между качеством изображения Z-стека, количество информации, необходимое для изображений сессии и профилактики индуцированного лазером фото-отбеливание в течение долгосрочного лазерного воздействия.
Еще одно ограничение этого метода является то, что флуоресцентные белки не показать такую же стабильность во время визуализации. Например ППП является относительно стабильным, но белок YFP может быть неустойчивым. Поэтому, важно, чтобы определить оптимальные настройки изображений эмпирически обнаружить максимальное количество цветов в данном эмбриона с соответствующей интенсивностью.
В дополнение к стабильности цвета, конфокальной микроскопии еще одно ограничение, потому что она не в состоянии прочитать CFPи каналы YFP вместе. Это связано с тем, что излучение от CFP обнаруживается в обоих 470 нм и 535 нм каналах. Кроме того, спектр излучения CFP (470-535nm) и спектр возбуждения YFP (530 нм) перекрываются, создавая FRET (флуоресцентный резонансный перенос энергии) артефакт. Другими словами, когда флуоресценции CFP обнаружено, что возбуждает флуоресценцию YFP создавая тем самым неспецифическую сигнал. По этой причине, этот протокол контуры сканирования все каналы флуоресценции были отдельно и объединение отдельных изображения отдельно с помощью общего программного обеспечения для обработки изображений. Чтобы обойти ограничения на конфокальной микроскопии, в две фотоны микроскопа может быть использован, как описано в кастрюле и др в бумаге, где все три флуоресценции выражения могут быть считаны одновременно позволяет более разнообразие цветов 8. Пан др описал широкий спектр цветовой разнообразия в их Zebrabow-М линий (до 30 цветов). После условия, описанные в этом протocol, различные интенсивности флуоресценции и рекомбинаций могут быть получены, как показано на рисунке 2, хотя некоторые цвета перестановок можно было потеряно во время обработки после визуализации.
Наследование цвета и клоновых анализы
Пан др описал стабильно поддерживается цвета наследство в Zebrabow-М от прародителя потомству, что позволяет судьба отображения 8. Этот протокол ориентирован на нервных клеток CNCC охарактеризовать формирование хряща Меккеля. Использование CreERT2 у рыбок данио позволяет эффективно тамоксифена индуцированной LoxP кассеты рекомбинации и способности контролировать наступление CNCC клонов маркировки в течение черепно-лицевого развития. Этот метод может быть легко адаптирована для визуализации все нервные производные гребня кроме хряща Меккеля. Кроме того, с помощью другого трансгенного репортер линию клонального анализа в самых различных системах органов будут освещены различными тоды роста клеток во время органогенеза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы благодарят Alex Schier за любезно обмена трансгенной линии Zebrabow-M, Джеффри Бернс для вектора pDEST и Рене Этье-Daigle за отличную ухода рыбы объекта и линий.
ФИНАНСИРОВАНИЕ:
Мы благодарны за щедрую финансовую поддержку от NIDCR RO3DE024490 и Shriners больницы для детей (ECL) и пост-докторантов учебных стипендий от Shriners больницы для детей (LR и Ю. К.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronase | Roche Life Sciences | 10165921001 | Prepare 500 μl stock aliquots at 50 mg/ml |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7619 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 4-HydoxyTamoxifen | Sigma-Aldrich | T176 | |
| 24 x 60 coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| 18 x 18 coverslips | Fisher Scientific | 12-540A | |
| 25 x 25 coverslips | Fisher Scientific | 12-540C | |
| pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit | Life technologies | K591-20 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Life Technologies | K2400-20 | |
| pENTR3'-pA | Tol2Kit | 302 | |
| pDEST | Gift from Geoffrey Burns labs | ||
| Bright field microscope | |||
| Fluorescent microscope | |||
| Confocal microscope | |||
| Image processing software |
References
- Dougherty, M., et al. Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis. Development. 140, 76-81 (2013).
- Dougherty, M., et al. Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model. The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).
- Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
- Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525 (2013).
- McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research. Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).
- Mossey, P. Dental education and CPD: are you being served. British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Vieira, A. R. Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).
- Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development. PLoS genetics. 10, e1004726 (2014).
- Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence. Teratology. 65, 116-120 (2002).
- Javidan, Y., Schilling, T. F. Development of cartilage and bone. Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).
- McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140, 3254-3265 (2013).
